Summary
Här presenterar vi ett protokoll för ex vivo kalciumavbildning i GCaMP6-uttryckande vuxen Drosophila för att övervaka epileptiforma aktiviteter. Protokollet ger ett värdefullt verktyg för att undersöka iktala händelser hos vuxna Drosophila genom ex vivo kalciumavbildning, vilket möjliggör utforskning av de potentiella mekanismerna för epilepsi på cellnivå.
Abstract
Epilepsi är en neurologisk sjukdom som kännetecknas av återkommande anfall, delvis korrelerade med genetiskt ursprung, som drabbar över 70 miljoner individer världen över. Trots den kliniska betydelsen av epilepsi har den funktionella analysen av neural aktivitet i centrala nervsystemet ännu inte utvecklats. De senaste framstegen inom bildteknik, i kombination med stabilt uttryck av genetiskt kodade kalciumindikatorer, såsom GCaMP6, har revolutionerat studiet av epilepsi på både hjärn- och encellsupplösningsnivåer. Drosophila melanogaster har dykt upp som ett verktyg för att undersöka de molekylära och cellulära mekanismerna bakom epilepsi på grund av dess sofistikerade molekylära genetik och beteendeanalyser. I denna studie presenterar vi ett nytt och effektivt protokoll för ex vivo kalciumavbildning i GCaMP6-uttryckande vuxen Drosophila för att övervaka epileptiforma aktiviteter. Hela hjärnan prepareras av cac, en välkänd epilepsigen, knockdownflugor för kalciumavbildning med ett konfokalmikroskop för att identifiera den neurala aktiviteten som en uppföljning till den smällkänsliga anfallsliknande beteendeanalysen. CAC knockdown-flugorna visade en högre frekvens av anfallsliknande beteende och onormal kalciumaktivitet, inklusive fler stora taggar och färre små taggar än vildtypsflugor. Kalciumaktiviteten var korrelerad till anfallsliknande beteende. Denna metod fungerar som en effektiv metod för att screena de patogena generna för epilepsi och utforska den potentiella mekanismen för epilepsi på cellnivå.
Introduction
Epilepsi, en komplex kronisk neurologisk sjukdom som kännetecknas av återkommande spontana och oprovocerade anfall och avvikande neuronal nätverksaktivitet, har drabbat över 70 miljoner individer över hela världen, vilket gör den till en av de vanligaste neurologiskasjukdomarna1 och leder till tunga bördor för familjer och samhälle. Med tanke på effekterna av epilepsi har många studier genomförts för att identifiera etiologin för anfall, varav genetik har godkänts som en primär orsak till många typer av epilepsi eller epileptiska syndrom2. Under de senaste årtiondena har framsteg inom genomisk teknik lett till en snabb ökning av upptäckten av nya epilepsiassocierade gener, som spelar en avgörande roll för anfallsförekomst, inklusive jonkanaler och icke-jonkanalgener 3,4. De bakomliggande mekanismerna och den funktionella analysen mellan generna och de epileptiska fenotyperna är dock ofullständigt klarlagda. Identifiering av epilepsiassocierade gener och mekanismer gör det möjligt att behandla patienter på ett effektivtsätt 5,6.
Cytosoliska kalciumsignaler är centrala element i neuronal aktivitet och synaptisk överföring. Kalciumavbildning, inklusive hjärnskivor7, in vivo 8,9 och ex vivo10, har använts för att övervaka neuronal aktivitet11 som en markör för neuronal excitabilitet sedan 1970-talet12,13. De senaste framstegen inom bildteknik, i kombination med de genetiskt kodade kalciumindikatorerna (GECI), såsom GCaMP6, har revolutionerat studiet av epilepsi på både hjärnövergripande och encellsupplösningsnivåer 14,15,16, som har en hög nivå av spatiotemporal precision. Förändringar i kalciumkoncentration och transienter observerades i aktionspotentialer respektivesynaptisk överföring 14, vilket indikerar att förändringen av intracellulära kalciumnivåer uppvisar en strikt korrelation med den elektriska excitabiliteten hos neuroner17,18. Kalciumavbildning har också tillämpats som en utvecklingsanfallsmodell9 och utförts på Drosophila för screening av antikonvulsiva föreningar19.
Drosophila melanogaster har vuxit fram som en kraftfull modellorganism i vetenskaplig forskning, såsom epilepsi, för sina sofistikerade molekylära genetik och beteendeanalyser 20,21,22. Dessutom har de avancerade genetiska verktygen hos Drosophila bidragit till uttrycket av den genetiskt kodade kalciumindikatorn GCaMP6. Till exempel möjliggör Gal4- och UAS-baserade binära transkriptionssystem specifikt uttryck av GCaMP6 på ett rumsligt och tidsmässigt kontrollerat sätt. Eftersom Drosophila är en liten organism kräver in vivo kalciumavbildning skickliga operationsfärdigheter för att utföra ett kirurgiskt ingrepp, där endast en liten del av hjärnans rygg exponerades genom ett litet fönster14,23. Samtidigt kan ex vivo kalciumavbildning i den intakta hjärnan hos Drosophila användas för att övervaka intresseområden (ROI) i hela hjärnan.
I denna studie presenterar vi ex vivo kalciumavbildning i GCaMP6-uttryckande vuxen Drosophila för att övervaka epileptiforma aktiviteter. CACNA1A är en välkänd epilepsigen tillhör cac Cav2-kanalen, som är en homolog till CACNA1A. Vi började med att dissekera hjärnorna hos cac knockdown-flugor tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi och avbilda dem med hjälp av ett konfokalmikroskop med xyt-skanningsläge. Vi analyserade sedan förändringarna i kalciumsignaler för ROI genom att beräkna indikatorer som kvantifierar spontana anfallsliknande händelser, såsom %ΔF/F-värde och kalciumhändelser av GCaMP6-fluorescens. Dessutom utförde vi mekanisk stimulans med virvelmaskin för att inducera anfallsbeteendetester på cac-knockdown-flugor samt för att validera resultaten av kalciumavbildning. Sammantaget ger detta protokoll ett värdefullt verktyg för att undersöka iktala händelser hos vuxna Drosophila genom ex vivo kalciumavbildning, vilket möjliggör utforskning av de potentiella mekanismerna för epilepsi på cellnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protokoll för bang-känslig analys
- Etablera experimentflugorna genom att korsa tub-Gal4-förarlinjen med UAS-cac-RNAi-linjen via Gal4/UAS-systemet21. Samla jungfruflugorna i tub-Gal4-linjen och hanflugorna i UAS-cac-RNAi-linjen . Överför sedan jungfru- och hanflugorna till samma flaska för att skörda avkomman.
OBS: Tub-Gal4-drivrutinslinjen gör det möjligt att uppnå global knockdown av cac-genen . Använd UAS-cac-RNAi-linjen som kontrollgrupp. - Efter 3-5 dagars stängning, bedöva försiktigt flugorna med 100 % CO2 (CO2 anestesiutrustning) och samla in både tub-Gal4>UAS-cac-RNAi-flugorna och UAS-cac-RNAi-flugorna med en borste. Överför dessa flugor till nya, rena foderflaskor 1 dag före testning för att säkerställa att de är väl förberedda.
- Bedöva försiktigt flugorna med CO2 . När du har bedövat, placera försiktigt 4-6 flugor i individuella färska injektionsflaskor. Låt flugorna återhämta sig från narkosen i ca 1 timme innan du fortsätter med testningen.
OBS: För varje genotyp testades minst fem försök, och varje försök bestod av sex injektionsflaskor med flugor. - Ställ in färdskrivaren. Placera en kamera (720-1080P, minst 30-60 FPS, AF låst) på ett stativ framför en whiteboard. Justera kamerans fokus manuellt med en tom flaska för att säkerställa tydliga och korrekta bilder.
- Använd en virvelblandare för att utföra det mekaniskt inducerade anfallsliknande beteendet. Placera varje injektionsflaska som innehåller 4-6 flugor på virvelblandaren och kör den på högsta inställningen (2800 rpm) i exakt 10 s. Efter virvlingen placerar du omedelbart injektionsflaskan på whiteboardtavlan.
- Observera flugorna och registrera eventuellt anfallsliknande beteende som de uppvisar.
OBS: Anfallsliknande beteende som observeras hos flugor består av tre stadier: anfall (manifesterar sig som vibrerande vingar), förlamning och återhämtning24. Förhållandet mellan beslagtagna flugor och testade flugor definierades som anfallsfrekvens.- Mät återhämtningstiden som den tid som krävs efter virvlande tills flugorna återfår förmågan att stå upprätt25.
2. Protokoll för kalciumavbildning av ex vivo-hjärnan
- Etablera tub-Gal4>UAS-GCaMP6m respektive tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-linjeflugor . Generera flugorna med hjälp av Gal4/UAS binära uttryckssystem21 för att möjliggöra övervakning av kalciumaktivitet i ex vivo-hjärnan .
- Bered dissektionslösningen enligt beskrivningen i det medföljande receptet (tabell 1)26.
- Bered den externa lösningen enligt beskrivningen i tabell 1. Justera till pH 7,2 med NaOH och justera osmolariteten till 250-255 mOsm/L.
OBS: Den externa lösningen kan förvaras vid 4 °C i 1 vecka. - För beredning av dissektionslösningen, tillsätt 9 enheter papainsuspension och L-lysin (2 mg/ml) till 600 μl av den externa lösningen. Vred lösningen och vänta 15 minuter tills lösningen är klar.
OBS: Det rekommenderas att använda dissektionslösningen inom 4 timmar.
- Bered den externa lösningen enligt beskrivningen i tabell 1. Justera till pH 7,2 med NaOH och justera osmolariteten till 250-255 mOsm/L.
- Genomsök den externa lösningen med syresatt koksaltlösning (95 % syre och 5 % koldioxid) i 5 minuter före användning. Använd pipetten för att överföra ca 10 μL av dissektionslösningen till en petriskål. Denna lösning kommer att ge de nödvändiga förutsättningarna för hjärndissektion och avbildning.
- Dissekera noggrant hjärnorna i både tub-Gal4>UAS-GCaMP6m och tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-linjerna med hjälp av sprutnålarna och mikroskopet. Följ det etablerade protokollet för hjärndissektion27.
- Använd en pipett för att överföra den förberedda hjärnan till en registreringsskål som innehåller 5 ml färsk extern lösning och immobilisera hjärnan med en C-skarp hållare i inspelningsskålen i 3-5 minuter för återhämtning.
OBS: Den C-skarpa hållaren var gjord av en metallhalvcirkel med 7 mm diameter korsad av parallella fibrer 0.5 mm från varandra. - Inställning och insamling av konfokal avbildning
- För konfokal avbildning, fånga varje hjärna med ett 20x objektiv och xyt Scanning Mode. Identifiera svampkroppens neuroner med ytterligare 4,5x digital förstärkning baserad på 20x optisk förstärkning.
OBS: Varje ex vivo-hjärna kan avbildas i mer än 1 timme. - Erhåll hela hjärn-GCaMP6m-emissionen vid 488 nm laserexcitation med 16 μw lasereffekt. Ställ in skanningsparametrarna på en hastighet på 400, med en pixelstorlek på 256 pixlar x 256 pixlar. Använd en förvärvshastighet på 5,3 Hz och spela in under en tid av 3 minuter.
- För konfokal avbildning, fånga varje hjärna med ett 20x objektiv och xyt Scanning Mode. Identifiera svampkroppens neuroner med ytterligare 4,5x digital förstärkning baserad på 20x optisk förstärkning.
- Identifiera 5-8 ROI i varje hjärna och analysera fluorescensen. Bestäm manuellt cellkroppen hos svampkroppens neuroner som intresseområdet28.
- Märk de identifierade neuronerna och mät deras fluorescensintensiteter med ImageJ. Analysera fluorescensdata för GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definiera den intracellulära fluorescensen, som ökar mellan 2 och 2,5 standardavvikelser över baslinjen, som små spikar, och intracellulär fluorescens, som ökar mer än 2,5 standardavvikelser över baslinjen, som stora toppar. Analysera frekvensen av kalciumspikar med Students t-test.
OBS: F0 definierades som baslinjen av den genomsnittliga fluorescensintensiteten för de första 5 bilderna i ROI, F1 som fluorescensintensiteten för den givna tidpunkten och B som bakgrunden utan fluorescens. Neuronernas temporala fysiologiska aktiviteter är också till hjälp för att skilja dem från brustecken.
- Märk de identifierade neuronerna och mät deras fluorescensintensiteter med ImageJ. Analysera fluorescensdata för GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definiera den intracellulära fluorescensen, som ökar mellan 2 och 2,5 standardavvikelser över baslinjen, som små spikar, och intracellulär fluorescens, som ökar mer än 2,5 standardavvikelser över baslinjen, som stora toppar. Analysera frekvensen av kalciumspikar med Students t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll fann vi att cac knockdown-flugor uppvisade signifikant högre frekvens av anfallsliknande beteende än WT-flugorna (17,00 ± 2,99 [n = 6] jämfört med 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; Elevens t-test, Figur 1A). De flesta tub-Gal4>UAS-cac-RNAi-flugor återhämtade sig inom 1-5 s, medan UAS-cac-RNAi-flugor återhämtade sig inom 2 s. Återhämtningsprocenten för cac knockdown-flugor inom 1 s var signifikant lägre än WT-flugorna (88,08 ± 1,89 [n = 6] jämfört med 96,50 ± 1,82 [n = 6]; P = 0,0093; Elevens t-test, Figur 1B). Som visas i figur 2 observerades kalciumsignaler i flugornas svampkropp. Små spikar förekom mindre hos cac knockdown-flugor (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,97 ± 0,96 [n = 13] jämfört med tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5,33 ± 1,31 [n = 13]; P < 0,0001; Studentens t-test), medan stora spikar förekom mer hos cac knockdown-flugor (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2,87 ± 0,63 [n = 13] jämfört med tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1,72 ± 0,62 [n = 13]; P < 0,0001). Dessa resultat indikerar att de kalciumsignaler som observerats hos flugor korrelerar starkt med neuronal aktivitet och visade överensstämmelse med det anfallsliknande beteendet hos cac knockdown-flugor.
Figur 1: Klassisk anfallsfrekvens och återhämtningstid hos flugor. (A) Anfall förekom i högre grad hos cac knockdown-flugor. B) Återhämtningstiden efter beslaget. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa kalciumsignaler i flugornas svampkropp. (A) Kalciumsignaler i utvalda 5 celler i flugornas svampkropp. (B) Typiskt spår: Förändring i fluorescens (ΔF/F) över tiden från en enskild cell i svampkroppen i knockdown- och vildtypsfiler. (C) Globala eller neuronala kalciumhändelser som inträffar i flugornas svampkropp och som delas upp i små och stora taggar. (D) Kalciumspikar i hela hjärnan hos knockdownflugor och kontroller. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Liu et al.29. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Extern lösning för inspelning och tillverkning av dissektionslösning. | |
| Koksalt | 101 mM |
| Kaliumklorid | 3 m² |
| Kalciumklorid | 1 mM |
| Magnesiumklorid | 4 m² |
| Glukos | 5 mM |
| Monobasiskt natriumfosfat | 1,25 mM |
| Bikarbonat | 20,7 mM |
| Dissektionslösning | |
| Extern lösning | 600 μL |
| Papain avstängning | 9 U |
| L-lysin | 2 mg/ml |
Tabell 1: Sammansättning av externa lösningar och dissektionslösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalciumjonen fungerar som en avgörande andra budbärare och spelar en central roll i en rad fysiologiska och patofysiologiska svar på både kemiska och elektriska störningar. Dessutom har det topologiska elementet i de presynaptiska P/Q-kanalerna, som kodas av den mänskliga CACNA1A-genen, identifierats som ansvarigt för att förmedla urladdningen av olika neurotransmittorer, inklusive glutamat 30,31,32, och är nära kopplat till epilepsi 33,34. Tidigare uppvisade beteendet hos Cac knockdown-flugor inte den svårighetsgrad som rapporterats hos vissa mutanter och uppvisade till och med suppressiva effekter hos vissa dubbelmuterade flugor35 . Resultaten av denna studie visar att cac knockdown-flugor är mer benägna att drabbas av anfall än sina motsvarigheter av vildtyp. Denna observation stämmer överens med det faktum att patienter och andra djurmodeller som bär på CACNA1A funktionsbortfallna varianter drabbas av epilepsi28,36. Globalt kan knockdown av cac direkt störa neuromuskulär överföring i motorneuroner. Även om rörelseförmåga hos vuxna och larver visade sig vara icke-prediktiv för anfallskänslighet, måste bidraget från motorneuronernas cac i anfallsbeteende undersökas ytterligare37. Konsekvent, i ex vivo kalciumavbildning, märkte vi en större andel kalciumhändelser i svampkroppen hos cac knockdown-flugor än hos vildtypsflugorna (WT), vilket indikerade en högre frekvens av neuronal avfyrning9. Flugornas svampkropp anses vara löst analog med hippocampus och cortex i däggdjurshjärnan. Eftersom anfall vanligtvis förekommer i hippocampus och cortex hos människor, används svampkroppen för att studera anfallsrelaterad neural kalciumaktivitet i denna studie. Sammanfattningsvis fastställde denna studie konsistensen av den knallkänsliga anfallsliknande analysen och kalciumavbildningen hos Drosophila.
Inom området kalciumavbildning möjliggör användning av kalciumindikatorn GCaMP6 i kombination med konfokalmikroskopi övervakning av förändringar i kalciumkoncentration inom olika kontexter såsom in vivo, i cellkulturer, i hjärnskivor och i ex vivo intakt hjärnvävnad av Drosophila-modellen. Det är dock allmänt känt att in vivo-avbildning av kalciumflöden i det centrala nervsystemet hos Drosophila kräver ett förfinat kirurgiskt ingrepp för att uppnå optisk tillgång till hjärnan. Detta hinder kan hämma den praktiska och utvecklande av denna teknik i enskilda laboratorier 8,16. Zebrafisk är också en viktig djurmodell för att studera epilepsi. In vivo-metoden för kalciumavbildning har också etablerats tidigare36. Det är dock endast zebrafisklarver som kan användas för registrering av in vivo-avbildningar. Å andra sidan, även om cellodlings- och hjärnskivmodeller kan ge bilder med högre upplösning, kan hjärnans integritet och dess neurala nätverk inte replikeras fullt ut i cellkultur eller hjärnskivor på grund av strukturella störningar. Den aktuella studien tar itu med dessa problem genom att implementera isolerade intakta Drosophila-hjärnvävnader för kalciumavbildning, vilket undviker behovet av komplexa kirurgiska tekniker och bevarar integriteten hos hjärnan och neurala nätverk utan störningar. Ex vivo-metoden ger också ett överlägset signal-brusförhållande jämfört med in vivo-avbildningstekniker.
Den aktuella studien belyser olika pivotala procedurer i protokollet för generering av tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi-linjeflugor . Till en början spelade den dubbla balanseraren en avgörande roll för att få de önskvärda flugorna. Markerade balanserare gör det möjligt för forskare att följa alleler och kromosomer genom komplexa korsningar över flera generationer38. Därefter, för effektiv separation av den intakta hjärnvävnaden och förbättrad mikroskopisk visualisering, var det absolut nödvändigt att använda Papain-suspension för att mjuka upp hjärnans ytfiber. Dessutom, för att stabilisera hjärnan och förhindra neuronal skada under experiment, ansågs det nödvändigt att använda en C-sharp-hållare med nylonhårkors27.
Sammanfattningsvis är kalciumavbildning som tillämpas här tillsammans med den smällkänsliga anfallsliknande beteendeanalysen i Drosophila ett kraftfullt system för screening av de epilepsiassocierade generna och för att utforska den potentiella mekanismen för epilepsi på cellulär nivå. Förvisso kan denna teknik inte studera kalciumsignaler i realtid som korrelerar till djurs beteende som andra in vivo-metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (anslag nr 2022A1515111123 till Jing-Da Qiao) och planerar att förbättra vetenskaplig forskning inom GMU (Jing-Da Qiao). Detta arbete stöddes också av Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enihancement Plan (Funding No. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W.
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al.
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S.
