Summary
本方案为利用功能化磁珠有效分离尿细胞外囊泡提供了详细的描述。此外，它还包括后续分析，包括蛋白质印迹、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学。
Abstract
来自生物流体的细胞外囊泡 （EV） 最近在液体活检领域引起了极大的关注。它们由几乎所有类型的细胞释放，提供宿主细胞的实时快照，并包含丰富的分子信息，包括蛋白质，特别是那些具有翻译后修饰 （PTM） 的蛋白质，如磷酸化，作为细胞功能和疾病发生和进展的主要参与者。然而，由于当前 EV 分离方法的产量和杂质低，从生物流体中分离 EV 仍然具有挑战性，这使得 EV 货物（如 EV 磷蛋白）的下游分析变得困难。在这里，我们描述了一种基于功能化磁珠的快速有效的 EV 分离方法，用于从生物流体（如人尿液）中分离 EV 和 EV 分离后的下游蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。该方案实现了尿 EV 的高回收率以及 EV 蛋白质组和磷酸化蛋白质组的敏感谱。此外，本文还讨论了该协议的多功能性和相关技术考虑因素。
Introduction
细胞外囊泡 （EV） 是由所有类型的细胞分泌的膜包膜纳米颗粒，存在于血液、尿液、唾液等生物流体中1,2,3,4。EV 携带多种生物活性分子，这些分子反映了宿主细胞的生理和病理状态，因此是疾病进展的关键因素 4,5,6。此外，广泛的研究已经确定，基于 EV 的疾病标志物可以在症状出现或肿瘤生理检测之前被识别出来 5,6,7。
磷酸化是细胞信号传导和调节的关键机制。因此，磷蛋白为生物标志物的发现提供了有价值的来源，因为异常的磷酸化事件与失调的细胞信号通路和转移性疾病的发展（如癌症）有关8,9,10。尽管分析磷酸化动力学可以识别疾病特异性磷蛋白特征作为潜在的生物标志物，但磷蛋白的低丰度和动态性质对开发磷蛋白作为生物标志物构成了重大挑战11,12。值得注意的是，封装在 EV 中的低丰度磷蛋白在细胞外环境中受到保护，免受外部酶消化的影响8。因此，EV 和 EV 衍生的磷蛋白为癌症和其他疾病的早期检测中的生物标志物发现提供了理想的来源。
尽管对 EV 中蛋白质磷酸化的分析为了解癌症信号传导和早期疾病诊断提供了宝贵的资源，但缺乏有效的 EV 分离方法是一个主要障碍。EV 隔离通常通过差示超速离心 （DUC）13 实现。然而，这种方法耗时且由于通量低和重现性差而不适合临床意义13,14。替代 EV 分离方法（例如聚合物诱导沉淀15）由于非 EV 蛋白的共沉淀而受到低特异性的限制。基于亲和力的方法，包括基于抗体的亲和力捕获16 和亲和力过滤17，可提供增强的特异性，但由于体积小，回收率相对较低。
为了解决探索 EV 中磷蛋白动力学的问题，我们课题组开发了基于化学亲和力的细胞外囊泡全回收和纯化 （EVtrap） 技术，将 EV 捕获到功能化的磁珠上18。先前的结果表明，与DUC和其他现有分离方法相比，这种基于磁珠的EV分离方法在从各种生物流体样品中分离EV方面非常有效，并且能够实现更高的EV产量，同时最大限度地减少污染18,19。我们已经成功地利用了 EVtrap 和我们小组20 开发的钛基磷酸肽富集方法来分析来自不同生物流体的 EV 的磷酸化蛋白质组，并检测各种疾病的潜在磷蛋白生物标志物19、21、22。
在这里，我们提出了一种基于EVtrap的协议，用于分离循环的EV。该协议侧重于泌尿 EV。我们还演示了使用蛋白质印迹法对分离的 EV 进行表征。然后，我们详细介绍了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的样品制备和质谱 （MS） 采集。该协议为分析尿液 EV 蛋白质组和磷酸化蛋白质组提供了高效且可重复的工作流程，这将有助于对 EV 及其临床应用的进一步研究23。
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Protocol
所有尿液样本均在知情同意后从健康个体中收集。这些实验符合涉及人体样本的所有伦理标准，并符合普渡大学人类研究保护计划的指导方针。
1. 样品采集
- 在2,500× g，4°C下将12mL尿液样品在15mL锥形离心管中离心10分钟，以除去细胞碎片和大凋亡体。
- 将 10 mL 上清液转移到新的 15 mL 试管中，然后进行 EV 分离。
注意：方案可以在这里暂停，样品可以储存在-80°C，并在使用时在37°C解冻。
2. 使用EVtrap方法进行EV隔离
- 根据制造商的说明，向样品中加入 0.5 mL 上样缓冲液（1：10 v/v 比）和 100 μL EVtrap 珠浆（1：50 v/v 比）。
- 在室温下通过端到端旋转孵育样品30分钟。
- 通过将 15 mL 锥形管放在磁性分离器架上来沉淀样品。除去上清液。
- 将珠子重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中，并将悬浮液转移到 1.5 mL 微量离心管中。轻轻移液以重新悬浮与 EV 结合的磁珠。
- 将试管放在 1.5 mL 微量离心管磁性分离器架上并吸出上清液。使用P200移液管完全吸出上清液并避免吸出珠子。
- 用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤珠子。吸出上清液后立即加入缓冲液，以防止珠子变干。
- 在室温下用 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤珠子 2 次。
- 在室温下用 100 μL 新鲜制备的 100 mM 三乙胺孵育珠子 10 分钟，并使用 1.5 mL 微量离心管磁分隔架收集含有 EV 的洗脱溶液。
注：要制备 1 mL 的 100 mM 三乙胺，请在水中稀释 14 μL 三乙胺溶液。 - 重复步骤2.8并合并洗脱的溶液。使用真空离心浓缩器在4°C下干燥洗脱液。
注意：实验可以在此处暂停。干燥的EV样品可以在-80°C下储存数月，而不会对以下步骤或结果产生不利影响。
3. 通过蛋白质印迹法表征 EV
- 将 5% 的干燥 EV 样品（相当于 0.5 mL 尿液样品）重悬于 20 μL 含有 10 mM 二硫苏糖醇 （DTT） 的 1x 十二烷基硫酸锂 （LDS） 样品缓冲液中。
注意：来自 0.5 mL 尿液的 EV 足以检测蛋白质印迹中的 CD9（EV 标志物24）信号。 - 将样品在95°C下煮沸5分钟。 将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并按照标准方案25进行电泳和免疫印迹。
- 将蛋白质转移到低荧光聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上后，在室温下用1%牛血清白蛋白（BSA）在tris缓冲盐水吐温-20（TBST）中封闭膜1小时。要制备 1 L TBST 缓冲液，加入 19 mM Tris 碱、137 mM NaCl 和 1 mL 吐温-20;使用 HCl 将 pH 值调节至 7.4。
- 将膜与兔抗CD9抗体以1：5,000的比例在TBST中的1%BSA中在4°C下孵育过夜或在室温下孵育2小时。
- 用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。在室温下，将膜与抗兔IgG，HRP连接的二抗在TBST中的1%BSA中以1：5000的比例孵育1小时。
- 用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。将市售的增强型化学发光（ECL）底物（比例为1：1）添加到膜上，并在化学发光成像系统上检测信号。
4. 蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的样品制备
- 制备含有 12 mM 脱氧胆酸钠 （SDC）、12 mM 月桂酰肌氨酸钠 （SLS）、100 mM 三乙基碳酸氢铵缓冲液 （TEAB）、10 mM 三（2-羧乙基）膦 （TCEP）、40 mM 氯乙酰胺 （CAA） 和 1x 磷酸酶抑制剂混合物的新鲜裂解缓冲液。
注意：库存溶液列在 材料表的描述中。裂解缓冲液的制备方法是加入储备溶液，以达到所需的浓度，具体取决于所需的体积。 - 将干燥的EV样品溶解在100μL裂解缓冲液中，并在95°C下加热样品10分钟，并以1,100rpm振荡。
- 将样品冷却至室温后，加入 400 μL 50 mM TEAB，将其稀释五倍。
- 按照制造商的说明使用BCA检测试剂盒测量蛋白质浓度。使用用 50 mM TEAB 稀释 5 倍的裂解缓冲液作为空白。
- 加入胰蛋白酶/Lys-C混合物，酶蛋白比为1：50 w/w，并将样品在37°C下孵育过夜，以1,100rpm振荡。
- 加入 50 μL 10% 三氟乙酸 （TFA） 酸化样品。
- 向样品中加入 600 μL 乙酸乙酯，并将混合物涡旋 2 分钟。
- 将样品以20,000× g 离心3分钟，并除去上层（有机层）。避免在抽吸过程中干扰界面。
- 重复步骤 4.7-4.8。使用真空离心浓缩器干燥水相。
- 将干燥的样品重悬于 200 μL 0.1% TFA 中以酸化肽，并根据制造商的说明使用 C18 脱盐尖端对样品进行脱盐。用 200 μL 0.1% TFA 的 80% 乙腈溶液调节吸头，然后用 200 μL 的 0.1% TFA 调节 2 次。将酸化的肽样品加载到吸头中，然后用 200 μL 0.1% TFA 洗涤吸头 3 次。用 200 μL 0.1% TFA 的 80% 乙腈溶液洗脱肽。
- 使用真空离心浓缩器干燥洗脱液。分别干燥 2% 的肽样品（相当于 0.2 mL 尿液样品）用于蛋白质组学分析。使用样品的其余部分（98%）进行磷酸化蛋白质组学分析。
- 根据制造商的说明，使用磷酸肽富集试剂盒从样品中富集磷酸肽。执行下面描述的步骤进行扩充。
- 将干燥的样品重悬于200μL上样缓冲液中。向样品中加入 50 μL 珠子，并在室温下剧烈摇动 20 分钟。将带有珠子的样品加载到烧结的尖端，并以 100 x g 离心 1 分钟。
- 用 200 μL 上样缓冲液洗涤吸头，然后洗涤缓冲液 1，然后洗涤缓冲液 2。通过以20×g离心一次2分钟和一次以100×g离心1分钟来执行所有三个洗涤步骤。
- 将带有珠子的尖端放入新管中以收集洗脱的磷酸肽。向吸头中加入 50 μL 洗脱缓冲液，以 20 x g 离心一次 2 分钟。 向吸头中再加入 50 μL 洗脱缓冲液，并以 20 x g 离心一次 2 分钟。最后一次以100×g离心1分钟。
- 使用真空离心浓缩器干燥洗脱的磷酸肽。
5. LC-MS/MS分析
注：可以使用不同的LC-MS/MS系统/设置和数据采集方法，例如数据相关采集（DDA）。
- 将干燥的蛋白质组/磷酸化蛋白质组样品重悬于0.1%甲酸（溶剂A）中，并按照制造商的说明加载样品。
- 通过液相色谱 （LC） 系统将样品注入捕获的离子淌度飞行时间 MS 中，并使用预设的标准化 Whisper 40 样品/天方法。肽在15cm C18柱（75μm内径，1.9μm粒径）上分离，如 材料表中所述。
- 对于蛋白质组学分析，使用平行累积-连续碎裂结合数据非依赖性采集 （dia-PASEF） 采集方法采集数据，每个斜坡的质量范围为 300-1200 m/z 和 0.6-1.50 1/K0，循环时间为 1.38 s。
- 对于磷酸化蛋白质组学分析，使用dia-PASEF采集方法采集数据，每个斜坡的质量范围为400-1550 m/z和0.6-1.50 1/K0，循环时间为1.38 s。
- 将原始文件加载到蛋白质组学软件中，并使用无库数据独立采集工作流程进行信号提取、鉴定和定量。
- 对于检索设置，使用智 人 数据库、胰蛋白酶/P 酶的特定消化类型、7 个最小肽长、52 个最大肽长、2 个缺失裂解、半胱氨酸位点的脲酰胺甲基作为固定修饰、乙酰蛋白 N 项、蛋氨酸氧化和丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化（用于磷酸化蛋白质组学分析）作为变量修饰，5 个作为最大变量修饰。将 PSM、肽和蛋白质组的 FDR 设置为 0.01。
注：此协议中使用了Spectronaut软件。其他DIA数据搜索软件，如DIA-NN和PEAKS也是常用的。如果数据是在 DDA 模式下采集的，则适用 MaxQuant 和 Proteome Discoverer 等软件。
- 对于检索设置，使用智 人 数据库、胰蛋白酶/P 酶的特定消化类型、7 个最小肽长、52 个最大肽长、2 个缺失裂解、半胱氨酸位点的脲酰胺甲基作为固定修饰、乙酰蛋白 N 项、蛋氨酸氧化和丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化（用于磷酸化蛋白质组学分析）作为变量修饰，5 个作为最大变量修饰。将 PSM、肽和蛋白质组的 FDR 设置为 0.01。
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Representative Results
该协议展示了从EV分离到下游蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的综合工作流程（图1）。对一式三份的尿液样本进行EV分离。分离的 EV 通过蛋白质印迹进行表征，随后进行基于质谱的蛋白质组学样品制备，包括蛋白质提取、酶消化和肽纯化。对于磷酸化蛋白质组学分析，基于金属离子功能化的可溶性纳米聚合物进一步富集了磷酸肽。多肽和磷酸肽样品均在数据无关模式下通过高分辨率离子淌度质谱分析。根据 智人 数据库搜索结果原始文件，并执行无库数据独立采集工作流程进行鉴定和 MS2 水平定量。
为了表征分离的 EV 并估计回收率，我们首先将相当于 0.5 mL 的含有 EV 的尿液加载到凝胶上进行蛋白质印迹，以检测 EV 标志物 CD9（图 2A）。此外，我们纳入了使用最常用的 EV 分离方法差示超速离心 （DUC） 从相同体积的尿液中分离出的 EV 进行比较。结果表明，与 DUC 相比，EVtrap 能够产生更高的 CD9 信号，表明磁珠可以有效捕获 EV。每个 CD9 条带信号的进一步定量值表明，与直接尿液对照的 5 倍强度相比，EVtrap 的回收率为 ~99%，而 DUC 仅回收了 ~1.5% 的 EV（图 2B）。
通过将每个样品的 2% 加载到 LC-MS/MS 上进行蛋白质组学分析，我们从 ~2,200 种独特蛋白质中鉴定出> 11,000 个独特的肽（图 3A），表明该工作流程提供了对 EV 蛋白质组的深入覆盖。观察到不同样品的蛋白质鉴定高度重叠，在所有三个重复中一致地鉴定出 72% 的独特蛋白质（图 3B）。此外，我们将鉴定结果与ExoCarta数据库进行了比较（图3C）26。值得注意的是，在前 100 个 EV 标记物和蛋白质中，我们成功鉴定了 ~90 个这些 EV 蛋白，这表明通过这种蛋白质组学分析对 EV 蛋白进行了无偏倚和完整的分析。为了评估定量精度，我们进一步评估了蛋白质定量结果的变异系数（CV）分布（图3D）。中等CV较低（5.7%）表明该程序具有高重现性和可靠性，包括EV隔离、样品制备和MS检测。
对于磷酸化蛋白质组学分析，我们使用每种肽样品的 98% 进行磷酸肽富集，并鉴定出对应于 ~350 种独特磷蛋白的 ~800 个独特磷酸肽（图 4A）。富集分别产生平均72%的磷酸丝氨酸（pS）肽、22%的磷酸苏氨酸（pT）和6%的磷酸酪氨酸（pY）肽（图4B）。就三个重复的鉴定重现性而言，所有三个分析都鉴定了42%的磷酸肽，并且每两次分析之间有~50%的重叠（图4C）。用于定量磷酸肽的培养基CV为21.8%，表明使用该方案具有可接受的定量重现性（图4D）。
图 1：用于分离尿细胞外囊泡 （EV） 和下游分析的工作流程示意图。 通过细胞外囊泡全回收和纯化 （EVtrap） 方法从尿液样本中分离 EV，分离的 EV 直接进行蛋白质印迹分析。对于LC-MS/MS分析，从EV中提取蛋白质并消化成肽。纯化步骤后的肽样品可用于蛋白质组学分析或磷酸肽富集后的磷酸化蛋白质组学分析。蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学样品均通过LC-MS/MS进行分析，然后使用数据非依赖性采集（DIA）工作流程方法进行鉴定和定量。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：通过蛋白质印迹对分离的 EV 进行表征。 （A） 从 0.1 mL 直接尿液样本 （n=1） 中检测 EV 标志物 CD9，使用差示离心 （DUC） 方法分离的 EV （n=3） 和使用 EVtrap 方法分离的 EV （n=3）。（B） （A） 中蛋白质印迹信号的定量表示为相对于直接尿液样本的回收百分比（5 倍强度 = 100%）。对于 DUC 和 EVtrap 样本，条形图显示一式三份的平均强度和标准偏差（由误差条表示）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：分离的 EV 的蛋白质组学分析 。 （A） 一式三份中鉴定出的独特蛋白质和肽的总数。（B） 维恩图，显示重复之间已鉴定的独特蛋白质的重叠。（C） 与 ExoCarta 数据库中前 100 个 EV 标记相对应的已鉴定的独特蛋白质的数量。（D） 显示蛋白质定量变异系数 （CV） 分布的密度图。CV 中值用红色虚线突出显示。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：分离的 EV 的磷酸化蛋白质组学分析 。 （A） 一式三份中鉴定出的独特磷蛋白和磷酸肽的总数。（B） 磷酸肽富集后 pSTY 肽的百分比组成。（C） 维恩图，显示重复之间已鉴定的独特磷酸肽的重叠。（D） 显示磷酸肽定量CV分布的密度图。CV 中值用红色虚线突出显示。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
有效的EV分离是检测EV中低丰度蛋白质和磷蛋白的重要先决条件。尽管开发了许多方法来满足这一需求，但大多数方法仍然存在局限性，例如恢复率差或可重复性低，这阻碍了它们在大规模研究和常规临床环境中的使用。DUC 通常被认为是最常见的 EV 隔离方法，通常应用额外的洗涤步骤来帮助提高目标 EV 的纯度27,28。此过程会导致更繁琐和耗时的 DUC 过程（> 6 小时）。此外，多项研究报道了DUC后的EV回收率低，29,30，如图2所示。相比之下，EVtrap 提供高效的 EV 隔离（< 1 小时）和高回收率（图 2）。值得注意的是，该工作流程的成功应用标志着鉴定各种疾病和癌症的重要 EV 标志物 19,21,22 的关键进展然而，EVtrap 无法分离 EV 的特定亚群，例如微囊泡或外泌体，因为它捕获了整个 EV 群。
在该协议中，我们使用2%和98%的肽样品进行蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。由于通过 EVtrap 从 10 mL 尿液中分离的 EV 通常产生 100-200 μg 的总蛋白质，因此消化和净化后 98% 的肽足以富集磷酸肽。如果定量MS分析需要标记步骤，例如串联质量标签（TMT）标记，则可以在脱盐步骤之后进行肽浓度测量，以标准化肽量并提高定量的准确性31。
虽然该协议主要强调了 EVtrap 用于分离尿液 EV，但值得注意的是，这种方法的多功能性已在处理各种样品类型中得到证明 32,33,34。根据先前的结果，该协议中使用的条件适用于从细胞培养基中分离EV。为了分离细胞分泌的 EV，细胞在无胎牛血清 （FBS） 或 EV 耗尽的 FBS 条件下培养，以防止过量的 FBS 衍生的 EV 与细胞分泌的 EV 共分离，这将破坏结果的可靠性35。此外，可以使用几种常见的 EV 标记物（包括 CD9、CD63、CD81、肿瘤易感基因 101 蛋白 （TSG101） 和 ALG-2 相互作用蛋白 X （ALIX）36）通过蛋白质印迹分析来表征来自其他样品类型的分离的 EV。
为了提高 MS 分析的覆盖率和定量，构建用于搜索 DIA 数据的项目特定库是一种替代选择。由于在DIA模式下产生的光谱的复杂性，包含参考光谱集合的光谱库有利于提高识别可信度和改善覆盖范围。通过对相同的样品或预分馏样品进行DDA分析，可以生成高质量的光谱库37。该库还可用于确定dia-PASEF的最佳窗口，并进一步改进识别38。
综上所述，所提出的方案提供了一种简单有效的方法，用于从尿液样本中分离EV以进行蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。通过实施该协议，我们期望改进低丰度 EV 蛋白和磷蛋白的检测，作为早期疾病检测和纵向监测的生物标志物。此外，研究人员有很大的机会推进电动汽车研究领域，并为更好的诊断和治疗策略做出贡献。
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Disclosures
作者宣布了相互竞争的经济利益。Anton Iliuk 和 W. Andy Tao 是 Tymora Analytical Operations 的联合创始人，该公司开发了 EVtrap 微珠并商业化了 PolyMAC 磷酸肽富集试剂盒。
Acknowledgments
这项工作部分由 NIH 赠款 3RF1AG064250 和 R44CA239845资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
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