Summary
Mevcut protokol, fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerin etkili izolasyonu için ayrıntılı açıklamalar sağlar. Ayrıca, western blotlama, proteomik ve fosfoproteomik dahil olmak üzere sonraki analizleri kapsar.
Abstract
Biyosıvılardan elde edilen hücre dışı veziküller (EV'ler) son zamanlarda likit biyopsi alanında önemli bir ilgi görmüştür. Hemen hemen her hücre tipi tarafından salınırlar, konakçı hücrelerin gerçek zamanlı bir görüntüsünü sağlarlar ve proteinler, özellikle fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlara (PTM'ler) sahip olanlar da dahil olmak üzere çok sayıda moleküler bilgi içerirler. Bununla birlikte, mevcut EV izolasyon yöntemlerinden kaynaklanan düşük verim ve safsızlıklar nedeniyle EV'lerin biyoakışkanlardan izolasyonu zorlu olmaya devam etmekte ve bu da EV fosfoproteinleri gibi EV kargosunun aşağı akış analizini zorlaştırmaktadır. Burada, insan idrarı gibi biyosıvılardan EV izolasyonu için işlevselleştirilmiş manyetik boncuklara ve aşağı akış proteomiklerine ve EV izolasyonunu takiben fosfoproteomik analize dayalı hızlı ve etkili bir EV izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Protokol, idrar EV'lerinin ve EV proteomu ve fosfoproteomunun hassas profillerinin yüksek geri kazanım verimini sağladı. Ayrıca, bu protokolün çok yönlülüğü ve ilgili teknik hususlar da burada ele alınmaktadır.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EV'ler), tüm hücre tipleri tarafından salgılanan ve kan, idrar, tükürük vb. biyosıvılarda bulunan zar kapsüllü nanopartiküllerdir.1,2,3,4. EV'ler, konakçı hücrelerinin fizyolojik ve patolojik durumunu yansıtan çeşitli biyoaktif moleküllerden oluşan bir kargo taşır ve bu nedenle hastalığın ilerlemesinde çok önemli faktörler olarak işlev görür 4,5,6. Ayrıca, kapsamlı çalışmalar, EV tabanlı hastalık belirteçlerinin semptomların başlamasından veya tümörlerin fizyolojik tespitinden önce tanımlanabileceğini ortaya koymuştur 5,6,7.
Fosforilasyon, hücresel sinyalleşme ve düzenlemede önemli bir mekanizma görevi görür. Bu nedenle, anormal fosforilasyon olayları, düzensiz hücresel sinyal yolakları ve kansergibi metastatik hastalık gelişimi ile ilişkili olduğundan, fosfoproteinler biyobelirteç keşfi için değerli bir kaynak sağlar 8,9,10. Fosforilasyon dinamiklerinin profillenmesi, hastalığa özgü fosfoprotein imzalarının potansiyel biyobelirteçler olarak tanımlanmasına izin verse de, fosfoproteinlerin düşük bolluğu ve dinamik doğası, fosfoproteinlerin biyobelirteçler olarak geliştirilmesinde büyük zorluklar yaratmaktadır11,12. Özellikle, EV'ler içinde kapsüllenen düşük miktarda fosfoproteinler, hücre dışı ortamda harici enzimatik sindirimden korunur8. Sonuç olarak, EV'ler ve EV'den türetilen fosfoproteinler, kanser ve diğer hastalıkların erken evre tespitinde biyobelirteç keşfi için ideal bir kaynak sunar.
EV'lerde protein fosforilasyonunun analizi, kanser sinyalizasyonunu ve erken evre hastalık teşhisini anlamak için değerli bir kaynak sunsa da, etkili EV izolasyon yöntemlerinin eksikliği büyük bir engel teşkil etmektedir. EV izolasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme (DUC)13 ile sağlanır. Bununla birlikte, bu yöntem zaman alıcıdır ve düşük verim ve zayıf tekrarlanabilirlik nedeniyle klinik uygulamalar için uygun değildir13,14. Polimer kaynaklı çökeltme15 gibi alternatif EV izolasyon yaklaşımları, EV olmayan proteinlerin birlikte çökelmesi nedeniyle düşük özgüllük ile sınırlıdır. Antikor tabanlı afinite yakalama16 ve afinite filtrasyonu17 dahil olmak üzere afinite tabanlı yaklaşımlar, gelişmiş özgüllük sunar, ancak küçük hacim nedeniyle nispeten düşük bir geri kazanım oranıyla sınırlıdır.
EV'lerde fosfoprotein dinamiklerini keşfetmedeki sorunları ele almak için grubumuz, EV'leri işlevselleştirilmiş manyetik boncuklar18 üzerine yakalamak için kimyasal afiniteye dayalı hücre dışı veziküller toplam geri kazanım ve saflaştırma (EVtrap) tekniği geliştirmiştir. Önceki sonuçlar, bu manyetik boncuk tabanlı EV izolasyon yönteminin, çok çeşitli biyoakışkan numunelerinden EV'leri izole etmede oldukça etkili olduğunu ve DUC ve diğer mevcut izolasyon yöntemlerine kıyasla kontaminasyonu en aza indirirken çok daha yüksek EV verimi elde edebildiğini göstermiştir18,19. Çeşitli biyoakışkanlardan türetilen EV'lerin fosfoproteomunun profilini çıkarmak ve çeşitli hastalıklar için potansiyel fosfoprotein biyobelirteçlerini tespit etmek için EVtrap ve grubumuz20 tarafından geliştirilen titanyum bazlı bir fosfopeptit zenginleştirme yöntemini başarıyla kullandık 19,21,22.
Burada, dolaşımdaki EV'lerin izolasyonu için EVtrap'e dayalı bir protokol sunuyoruz. Protokol idrar EV'lerine odaklanır. Ayrıca, batı lekeleme kullanarak izole edilmiş EV'lerin karakterizasyonunu da gösteriyoruz. Daha sonra hem proteomik hem de fosfoproteomik analizler için numune hazırlama ve kütle spektrometresi (MS) alımını detaylandırıyoruz. Bu protokol, idrar EV proteomu ve fosfoproteomunun profilini çıkarmak için verimli ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar, bu da EV'ler ve klinik uygulamaları hakkında daha fazla çalışmayı kolaylaştıracaktır23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm idrar örnekleri sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra toplandı. Deneyler, insan örneklerini içeren tüm etik standartlara uygundu ve Purdue Üniversitesi İnsan Araştırmaları Koruma Programı'nın yönergelerine uygundu.
1. Örnek toplama
- Hücre kalıntılarını ve büyük apoptotik cisimleri çıkarmak için 12 mL idrar örneğini 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde 10 dakika boyunca 2.500 x g, 4 ° C'de santrifüjleyin.
- 10 mL süpernatanı 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve EV izolasyonuna devam edin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler -80 °C'de saklanabilir ve kullanım sırasında 37 °C'de çözülebilir.
2. EVtrap yaklaşımını kullanarak EV izolasyonu
- Üreticinin talimatlarına göre numuneye 0,5 mL yükleme tamponu (1:10 v/v oranı) ve 100 μL EVtrap boncuk bulamacı (1:50 v/v oranı) ekleyin.
- Numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca uçtan uca döndürerek inkübe edin.
- 15 mL'lik konik tüpü manyetik bir ayırıcı rafa yerleştirerek numuneyi peletleyin. Süpernatanı çıkarın.
- Boncukları 1 mL yıkama tamponunda tekrar süspanse edin ve süspansiyonu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. EV'ye bağlı boncukları yeniden süspanse etmek için hafifçe pipetleyin.
- Tüpü 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü manyetik ayırıcı rafına yerleştirin ve süpernatanı aspire edin. Süpernatanı tamamen aspire etmek için bir P200 pipeti kullanın ve boncukları aspire etmekten kaçının.
- Boncukları 1 mL yıkama tamponu ile yıkayın. Boncukların kurumasını önlemek için süpernatanı aspire ettikten hemen sonra tamponu ekleyin.
- Boncukları 2x oda sıcaklığında 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Boncukları 100 μL taze hazırlanmış 100 mM trietilamin ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüp manyetik ayırıcı raf kullanarak EV'leri içeren ayrıştırılmış çözeltiyi toplayın.
NOT: 1 mL 100 mM trietilamin hazırlamak için 14 μL trietilamin çözeltisini suda seyreltin. - Adım 2.8'i tekrarlayın ve ayrıştırılan çözümleri birleştirin. Elüatı 4 °C'de bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.
NOT: Deney burada duraklatılabilir. Kurutulmuş EV numuneleri, aşağıdaki adımlar veya sonuçlar üzerinde olumsuz bir etki olmaksızın birkaç ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.
3. EV'lerin batı lekeleme ile karakterizasyonu
- Kurutulmuş EV örneğinin% 5'ini (idrar örneğinin 0.5 mL'sine eşdeğer) 20 μL 1x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tamponunda 10 mM ditiyotreitol (DTT) ile yeniden süspanse edin.
NOT: 0.5 mL idrardan EV'ler, western blotlamada CD9 (bir EV marker24) sinyalini tespit etmek için yeterlidir. - Numuneyi 95 °C'de 5 dakika kaynatın. Numuneyi bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin ve standart protokolleri25 izleyerek elektroforez ve immünoblotlama gerçekleştirin.
- Proteinleri düşük floresan poliviniliden florür (PVDF) membranına aktardıktan sonra, membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca tris-tamponlu salin ara-20 (TBST) içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin. 1 L TBST tamponu hazırlamak için 19 mM Tris bazı, 137 mM NaCl ve 1 mL Tween-20 ekleyin; HCl kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- Membranı tavşan anti-CD9 antikoru ile TBST'de% 1 BSA'da 1: 5.000 oranında 4 ° C'de gece boyunca veya oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- Membranı 3x 5 dakika boyunca TBST ile yıkayın. Membranı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de% 1 BSA'da 1:5000 oranında anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı ikincil antikor ile inkübe edin.
- Membranı 3x 5 dakika boyunca TBST ile yıkayın. Ticari olarak elde edilen geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substratlarını (1:1 oranında) membran üzerine ekleyin ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemindeki sinyalleri tespit edin.
4. Proteomik ve fosfoproteomik analiz için numune hazırlama
- 12 mM sodyum deoksikolat (SDC), 12 mM sodyum lauroil sarkozinat (SLS), 100 mM trietilamonyum bikarbonat tamponu (TEAB), 10 mM tris- (2-karboksietil) fosfin (TCEP), 40 mM kloroasetamid (CAA) ve 1x fosfataz inhibitör kokteylleri.
NOT: Stok çözümleri, Malzeme Tablosunun açıklamasında listelenmiştir. Lizis tamponu, gerekli hacme bağlı olarak istenen konsantrasyonları elde etmek için stok çözeltileri eklenerek hazırlanır. - Kurutulmuş EV örneğini 100 μL lizis tamponunda çözündürün ve örneği 1.100 rpm'de çalkalayarak 95 °C'de 10 dakika ısıtın.
- Numuneyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, 400 μL 50 mM TEAB ekleyerek beş kat seyreltin.
- Üreticinin talimatlarına göre bir BCA tahlil kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. 50 mM TEAB ile beş kat seyreltilmiş lizis tamponunu boş olarak kullanın.
- 1:50 w/w enzim-protein oranında tripsin/Lys-C karışımı ekleyin ve numuneyi gece boyunca 37 °C'de 1.100 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
- Numuneyi asitleştirmek için 50 μL %10 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.
- Numunelere 600 μL etil asetat ekleyin ve karışımı 2 dakika vorteksleyin.
- Numuneyi 20.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve üst tabakayı (organik tabaka) çıkarın. Aspirasyon sırasında arayüzü bozmaktan kaçının.
- 4.7-4.8 arasındaki adımları tekrarlayın. Bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak sulu fazı kurutun.
- Peptitleri asitleştirmek için kurutulmuş numuneyi 200 μL %0.1 TFA'da yeniden süspanse edin ve üreticinin talimatlarına göre bir C18 tuz giderme ucu kullanarak numuneyi tuzdan arındırın. Ucu %80 asetonitrilde 200 μL %0,1 TFA ile koşullandırın, ardından 200 μL %0,1 TFA ile 2x uygulayın. Asitlendirilmiş peptit örneğini uca yükleyin ve ardından ucu 3x 200 μL %0.1 TFA ile yıkayın. Peptitleri% 80 asetonitril içinde 200 μL% 0.1 TFA ile elute.
- Bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak elüatı kurutun. Proteomik analiz için peptit örneğinin %2'sini (idrar örneğinin 0.2 mL'sine eşdeğer) ayrı ayrı kurutun. Fosfoproteomik analiz için numunenin geri kalanını (%98) kullanın.
- Üreticinin talimatlarına göre bir fosfopeptit zenginleştirme kiti kullanarak numuneden fosfopeptitleri zenginleştirin. Zenginleştirme için aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirin.
- Kurutulmuş numuneyi 200 μL yükleme tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneye 50 μL boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuvvetlice çalkalayın. Numuneyi boncuklarla birlikte fritlenmiş uca yükleyin ve 100 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Ucu 200 μL yükleme tamponu ile yıkayın, ardından yıkama tamponu 1, ardından yıkama tamponu 2 ile yıkayın. Üç yıkama adımını da 20 x g'da 2 dakika ve 100 x g'da 1 dakika santrifüj ederek gerçekleştirin.
- Ayrıştırılmış fosfopeptitleri toplamak için ucu boncuklarla yeni bir tüpe koyun. Uca 50 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 20 x g'da 2 dakika boyunca bir kez santrifüjleyin. Uca 50 μL daha elüsyon tamponu ekleyin ve 20 x g'da 2 dakika boyunca bir kez santrifüjleyin. 100 x g'da 1 dakika boyunca son bir kez santrifüjleyin.
- Ayrıştırılmış fosfopeptitleri bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.
5. LC-MS / MS analizi
NOT: Veriye bağlı edinim (DDA) gibi farklı LC-MS/MS sistemleri/ayarları ve veri toplama yöntemleri kullanılabilir.
- Kurutulmuş proteom/fosfoproteom numunelerini %0.1 formik asit (çözücü A) içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri üreticinin talimatlarına göre yükleyin.
- Numuneleri, sıvı kromatografi (LC) sistemi aracılığıyla sıkışmış iyon hareketliliği uçuş süresi MS'ye enjekte edin ve önceden ayarlanmış standartlaştırılmış Whisper 40 numune/gün yöntemini kullanın. Peptitler, Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi 15 cm'lik bir C18 kolonu (75 μm iç çap, 1.9 μm partikül boyutu) üzerinde ayrılır.
- Proteomik analiz için, rampa başına 300-1200 m/z ve 0,6-1,50 1/K0 arasında değişen bir kütle aralığı ile veriden bağımsız edinim (dia-PASEF) toplama yöntemiyle birleştirilmiş paralel bir birikim-seri parçalanma kullanarak veri elde edin ve döngü süresi 1,38 s.
- Fosfoproteomik analiz için, rampa başına 400-1550 m/z ve 0.6-1.50 1/K0 arasında değişen ve 1.38 s'lik bir döngü süresine sahip bir dia-PASEF toplama yöntemi kullanarak veri elde edin.
- Ham dosyaları proteomik yazılıma yükleyin ve kütüphaneden bağımsız veriden bağımsız bir alım iş akışı kullanarak sinyal çıkarma, tanımlama ve niceleme gerçekleştirin.
- Arama ayarları için Homo sapiens veritabanını, tripsin/P enzimleri içeren spesifik sindirim türlerini, 7 minimum peptit uzunluğunu, 52 maksimum peptit uzunluğunu, iki kaçırılan bölünmeyi, sabit modifikasyon olarak sisteinde karbamidometili, asetil proteini N-terimini, metiyoninde oksidasyonu ve serin, treonin ve tirozinde fosforilasyonu (fosfoproteomik analiz için) değişken modifikasyonlar olarak ve 5'i maksimum değişken modifikasyonlar olarak kullanın. PSM, peptit ve protein grubundaki FDR'yi 0.01'e ayarlayın.
NOT: Bu protokolde Spectronaut yazılımı kullanılmıştır. DIA-NN ve PEAKS gibi diğer DIA veri arama yazılımları da yaygın olarak kullanılmaktadır. Veriler DDA modunda alınmışsa, MaxQuant ve Proteome Discoverer gibi yazılımlar uygulanabilir.
- Arama ayarları için Homo sapiens veritabanını, tripsin/P enzimleri içeren spesifik sindirim türlerini, 7 minimum peptit uzunluğunu, 52 maksimum peptit uzunluğunu, iki kaçırılan bölünmeyi, sabit modifikasyon olarak sisteinde karbamidometili, asetil proteini N-terimini, metiyoninde oksidasyonu ve serin, treonin ve tirozinde fosforilasyonu (fosfoproteomik analiz için) değişken modifikasyonlar olarak ve 5'i maksimum değişken modifikasyonlar olarak kullanın. PSM, peptit ve protein grubundaki FDR'yi 0.01'e ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, EV'lerin izolasyonundan aşağı akış proteomik ve fosfoproteomik analizlerine kadar kapsamlı bir iş akışı göstermektedir (Şekil 1). Üçlü idrar örnekleri EV izolasyonuna tabi tutuldu. İzole edilen EV'ler, batı lekeleme ile karakterize edildi ve daha sonra protein ekstraksiyonu, enzimatik sindirim ve peptit temizliği dahil olmak üzere kütle spektrometrisi tabanlı proteomik numune hazırlama için işlendi. Fosfoproteomik analiz için, fosfopeptitler, metal iyonu ile işlevselleştirilmiş çözünür nanopolimerlere dayalı olarak daha da zenginleştirildi. Hem peptit hem de fosfopeptit örnekleri, veriden bağımsız mod altında yüksek çözünürlüklü iyon hareketlilik kütle spektrometrisi ile analiz edildi. Elde edilen ham dosyalar Homo sapiens veri tabanında arandı ve tanımlama ve MS2 düzeyinde niceleme için kütüphaneden bağımsız veriden bağımsız edinim iş akışı gerçekleştirildi.
İzole edilmiş EV'leri karakterize etmek ve geri kazanım verimini tahmin etmek için, önce EV markörü CD9'u tespit etmek için western blotlama için jel üzerine 0.5 mL idrar içeren bir eşdeğer yükledik (Şekil 2A). Ek olarak, karşılaştırma için EV izolasyonu için en çok kullanılan yöntem olan diferansiyel ultrasantrifüjleme (DUC) kullanılarak aynı hacimde idrardan izole edilen EV'leri dahil ettik. Sonuçlar, EVtrap'in DUC'ye kıyasla çok daha yüksek CD9 sinyalleri üretebildiğini gösterdi ve bu da EV'lerin boncuklar tarafından etkili bir şekilde yakalandığını gösterdi. Her CD9 bant sinyali için daha fazla kantitatif değer, EVtrap'in doğrudan idrar kontrolünün 5 kat yoğunluğuna kıyasla ~%99'luk bir geri kazanım verimi elde ettiğini, DUC'nin ise EV'lerin yalnızca ~%1.5'ini geri kazandığını göstermiştir (Şekil 2B).
Proteomik profilleme için her numunenin %2'sini LC-MS/MS'ye yükleyerek, ~2.200 benzersiz proteinden > 11.000 benzersiz peptit belirledik (Şekil 3A), bu iş akışının EV proteomunun derinlemesine bir kapsamını sağladığını gösteriyor. Numuneler arasında protein tanımlamalarında yüksek derecede örtüşme gözlendi ve benzersiz proteinlerin %72'si her üç kopyada da tutarlı bir şekilde tanımlandı (Şekil 3B). Ayrıca, tanımlama sonuçlarını ExoCarta veri tabanı ile karşılaştırdık (Şekil 3C)26. Özellikle, en iyi 100 EV markörü ve proteininden, bu EV proteinlerinin ~ 90'ını başarıyla tanımladık, bu proteomik analiz yoluyla EV proteinlerinin tarafsız ve eksiksiz bir profilini çıkardık. Kantitatif kesinliği değerlendirmek için, protein niceleme sonuçları için varyasyon katsayılarının (CV) dağılımını daha da değerlendirdik (Şekil 3D). Düşük orta CV (%5,7), EV izolasyonu, numune hazırlama ve MS tespiti dahil olmak üzere prosedürün yüksek tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini gösterir.
Fosfoproteomik analiz için, fosfopeptit zenginleştirmesi için her bir peptit örneğinin %98'ini kullandık ve ~350 benzersiz fosfoproteine karşılık gelen ~800 benzersiz fosfopeptit tanımladık (Şekil 4A). Zenginleştirme, sırasıyla ortalama %72 fosfoserin (pS) peptitleri, %22 fosfotreonin (pT) ve %6 fosfotirozin (pY) peptitleri verdi (Şekil 4B). Üç kopyanın tanımlanabilirliği açısından, fosfopeptitlerin% 42'si her üç analizde de tanımlandı ve her iki analiz arasında ~% 50'lik bir örtüşme vardı (Şekil 4C). Fosfopeptitlerin miktar tayini için %21.8'lik bir orta CV belirlendi, bu da bu protokol kullanılarak kabul edilebilir bir kantitatif tekrarlanabilirlik olduğunu düşündürdü.
Şekil 1: İdrar hücre dışı vezikül (EV) izolasyonu ve aşağı akış analizleri için kullanılan şematik iş akışı. EV'ler, hücre dışı veziküller toplam geri kazanım ve saflaştırma (EVtrap) yaklaşımı ile idrar örneklerinden izole edilir ve izole edilen EV'ler doğrudan western blotting analizine tabi tutulur. LC-MS/MS analizi için, proteinler EV'lerden ekstrakte edilir ve peptitlere sindirilir. Temizleme adımlarından sonra peptit numuneleri, fosfopeptit zenginleştirmesinden sonra proteomik analiz veya fosfoproteomik analiz için kullanılabilir. Hem proteomik hem de fosfoproteomik numuneler LC-MS/MS ile analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Batı blot ile izole edilmiş EV'lerin karakterizasyonu . (A) 0.1 mL doğrudan idrar örneğinden (n=1), diferansiyel santrifüjleme (DUC) yaklaşımı kullanılarak izole edilen EV'lerden (n=3) ve EVtrap yaklaşımı kullanılarak izole edilen EV'lerden (n=3) EV marker CD9'un saptanması. (B) (A)'daki western blotlama sinyallerinin nicelleştirilmesi, doğrudan idrar örneğine göre iyileşme yüzdesi olarak sunulur (5 kat yoğunluk =% 100). DUC ve EVtrap örnekleri için çubuk grafiği, üçlü kopyalardan ortalama yoğunlukları ve standart sapmaları (hata çubuklarıyla temsil edilir) görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İzole edilmiş EV'lerin proteomik analizi . (A) Üçlü olarak tanımlanan benzersiz proteinlerin ve peptitlerin toplam sayısı. (B) Replikasyonlar arasında tanımlanmış benzersiz proteinlerdeki örtüşmeyi gösteren Venn şeması. (C) ExoCarta veri tabanındaki ilk 100 EV işaretleyicisine karşılık gelen tanımlanmış benzersiz proteinlerin sayısı. (D) Protein ölçümü için varyasyon katsayısının (CV) dağılımını gösteren yoğunluk grafiği. Ortanca CV değeri kırmızı kesikli bir çizgiyle vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İzole edilmiş EV'lerin fosfoproteomik analizi . (A) Üç kopyalar halinde tanımlanmış benzersiz fosfoproteinlerin ve fosfopeptitlerin toplam sayısı. (B) Fosfopeptit zenginleştirmesinden sonra pSTY peptitlerinin yüzde bileşimi. (C) Replikasyonlar arasında tanımlanmış benzersiz fosfopeptitlerdeki örtüşmeyi gösteren Venn şeması. (D) Fosfopeptit miktar tayini için CV dağılımını gösteren yoğunluk grafiği. Ortanca CV değeri kırmızı kesikli bir çizgiyle vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etkili EV izolasyonu, EV'lerde düşük miktarda bulunan proteinleri ve fosfoproteinleri tespit etmek için temel bir ön koşuldur. Bu ihtiyacı karşılamak için çok sayıda yöntemin geliştirilmesine rağmen, çoğunluk hala büyük ölçekli çalışmalarda ve rutin klinik ortamlarda kullanımlarını engelleyen zayıf iyileşme veya düşük tekrarlanabilirlik gibi sınırlamalardan muzdariptir. DUC genellikle EV izolasyonu için en yaygın yöntem olarak kabul edilir ve hedef EV'lerin saflığını artırmaya yardımcı olmak için normal olarak ek yıkama adımlarıuygulanır 27,28. Bu prosedür daha sıkıcı ve zaman alıcı bir DUC işlemine yol açar (> 6 saat). Ayrıca, DUC sonrası düşük EV geri kazanım verimi birden fazla çalışma ile bildirilmiştir,29,30 ve Şekil 2'deki sonuçlarda gösterilmiştir. Karşılaştırıldığında, EVtrap verimli EV izolasyonu (< 1 saat) ve yüksek geri kazanım verimi sunar (Şekil 2). Özellikle, bu iş akışının başarılı bir şekilde uygulanması, çeşitli hastalıklar ve kanserler için önemli EV belirteçlerinin tanımlanması için çok önemli bir ilerlemeye işaret etmektedir 19,21,22 Bununla birlikte, EVtrap, tüm EV popülasyonunu yakaladığı için mikro-parçacıklar veya eksozomlar gibi EV'lerin belirli alt popülasyonlarını izole edemez.
Bu protokolde proteomik ve fosfoproteomik analizler için peptit örneğinin %2 ve %98'ini kullandık. EVtrap ile 10 mL idrardan izole edilen EV'ler tipik olarak 100-200 μg toplam protein verdiğinden, sindirim ve temizlemeden sonra peptitlerin %98'i fosfopeptit zenginleştirmesi için yeterlidir. Kantitatif MS analizi için tandem kütle etiketi (TMT) etiketlemesi gibi bir etiketleme adımı gerekiyorsa, peptit miktarını normalleştirmek ve miktar tayininin doğruluğunu artırmak için tuzdan arındırma adımını takiben peptit konsantrasyonu ölçümü yapılabilir31.
Bu protokol öncelikle idrar EV'lerini izole etmek için EVtrap kullanımını vurgularken, bu yaklaşımın çok yönlülüğünün çeşitli numune tiplerinin 32,33,34 işlenmesinde gösterildiğini belirtmekte fayda var. Önceki sonuçlara dayanarak, bu protokolde kullanılan koşul, EV'leri hücre kültürü ortamından izole etmek için uygulanabilirdi. Hücre tarafından salgılanan EV'lerin izolasyonu için, hücreler, sonuçların güvenilirliğini baltalayacak olan aşırı FBS türevli EV'lerin hücre tarafından salgılanan EV'lerle birlikte izolasyonunu önlemek için fetal sığır serumu (FBS) içermeyen veya EV'den yoksun FBS koşulları altında yetiştirilir35. Ek olarak, diğer numune tiplerinden izole edilen EV'ler, CD9, CD63, CD81, tümör duyarlılık geni 101 proteini (TSG101) ve ALG-2 etkileşimli protein X (ALIX) dahil olmak üzere birkaç yaygın EV belirteci kullanılarak western blotting analizi ile karakterize edilebilir.36.
MS analizinde kapsamı artırmak ve nicelemeyi iyileştirmek için, DIA verilerini aramak için projeye özel bir kitaplık oluşturmak alternatif bir seçenektir. DIA modunda üretilen spektrumların karmaşıklığı nedeniyle, bir referans spektrum koleksiyonu içeren bir spektral kitaplık, tanımlama güvenilirliğini artırmak ve kapsamı iyileştirmek için faydalıdır. Aynı numuneler veya önceden parçalanmış numuneler üzerinde DDA analizi yapılarak yüksek kaliteli spektral kütüphaneler oluşturulabilir37. Kütüphane ayrıca dia-PASEF için en uygun pencereleri belirlemek ve tanımlamayı daha da geliştirmek için kullanılabilir38.
Birlikte ele alındığında, sunulan protokol, proteomik ve fosfoproteomik analizler için idrar örneklerinden EV'leri izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sağlar. Bu protokolü uygulayarak, erken evre hastalık tespiti ve uzunlamasına izleme için biyobelirteçler olarak düşük miktarda bulunan EV proteinlerinin ve fosfoproteinlerin daha iyi tespit edilmesini bekliyoruz. Ayrıca, araştırmacılar EV araştırma alanını ilerletmek ve daha iyi teşhis ve tedavi stratejilerine katkıda bulunmak için büyük bir fırsata sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rekabet eden bir finansal çıkar beyan ederler. Anton Iliuk ve W. Andy Tao, EVtrap boncukları geliştiren ve PolyMAC fosfopeptit zenginleştirme kitini ticarileştiren Tymora Analytical Operations'ın kurucu ortaklarıdır.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen NIH hibeleri 3RF1AG064250 ve R44CA239845 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A.
- Singh, V., et al.
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R.
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
