Summary
Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) aus Bioflüssigkeiten haben in jüngster Zeit im Bereich der Flüssigbiopsie große Aufmerksamkeit erlangt. Sie werden von fast allen Zelltypen freigesetzt, liefern eine Echtzeit-Momentaufnahme der Wirtszellen und enthalten eine Fülle molekularer Informationen, darunter Proteine, insbesondere solche mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung, als Hauptakteur der zellulären Funktionen und des Ausbruchs und Fortschreitens von Krankheiten. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Bioflüssigkeiten ist jedoch aufgrund der geringen Ausbeuten und Verunreinigungen der derzeitigen Isolationsmethoden für Elektrofahrzeuge nach wie vor eine Herausforderung, was die nachgelagerte Analyse von EV-Fracht, wie z. B. EV-Phosphoproteinen, erschwert. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive EV-Isolierungsmethode, die auf funktionalisierten magnetischen Beads für die EV-Isolierung aus Bioflüssigkeiten wie menschlichem Urin und der nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse nach der EV-Isolierung basiert. Das Protokoll ermöglichte eine hohe Rückgewinnungsausbeute von EVs im Urin und empfindliche Profile des EV-Proteoms und Phosphoproteoms. Darüber hinaus werden hier auch auf die Vielseitigkeit dieses Protokolls und relevante technische Überlegungen eingegangen.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranverkapselte Nanopartikel, die von allen Arten von Zellen abgesondert werden und in Bioflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel usw. vorhanden sind.1,2,3,4. EVs tragen eine Ladung verschiedener bioaktiver Moleküle, die den physiologischen und pathologischen Zustand ihrer Wirtszellen widerspiegeln und daher als entscheidende Faktoren für das Fortschreiten der Krankheit fungieren 4,5,6. Darüber hinaus haben umfangreiche Studien gezeigt, dass EV-basierte Krankheitsmarker vor dem Auftreten von Symptomen oder der physiologischen Erkennung von Tumoren identifiziert werden können 5,6,7.
Die Phosphorylierung ist ein Schlüsselmechanismus für die zelluläre Signalübertragung und Regulation. Daher stellen Phosphoproteine eine wertvolle Quelle für die Entdeckung von Biomarkern dar, da aberrante Phosphorylierungsereignisse mit dysregulierten zellulären Signalwegen und der Entwicklung metastasierender Krankheiten wie Krebs verbunden sind 8,9,10. Obwohl die Profilierung der Phosphorylierungsdynamik die Identifizierung krankheitsspezifischer Phosphoproteinsignaturen als potenzielle Biomarker ermöglicht, stellen die geringe Häufigkeit und die dynamische Natur von Phosphoproteinen große Herausforderungen bei der Entwicklung von Phosphoproteinen als Biomarker dar11,12. Bemerkenswert ist, dass die in EVs eingekapselten Phosphoproteine mit geringer Häufigkeit vor externer enzymatischer Verdauung in der extrazellulären Umgebung geschützt sind8. Folglich bieten EVs und EV-abgeleitete Phosphoproteine eine ideale Quelle für die Entdeckung von Biomarkern in der Früherkennung von Krebs und anderen Krankheiten.
Obwohl die Analyse der Proteinphosphorylierung in EVs eine wertvolle Ressource für das Verständnis von Krebssignalen und die Diagnose von Krankheiten im Frühstadium darstellt, stellt der Mangel an effizienten Methoden zur Isolierung von EVs ein großes Hindernis dar. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen wird in der Regel durch differentielle Ultrazentrifugation (DUC)13 erreicht. Diese Methode ist jedoch zeitaufwändig und aufgrund des geringen Durchsatzes und der schlechten Reproduzierbarkeit nicht für klinische Implikationen geeignet13,14. Alternative EV-Isolierungsansätze, wie z. B. die polymerinduzierte Fällung15, sind durch eine geringe Spezifität aufgrund der Co-Präzipitation von Nicht-EV-Proteinen begrenzt. Affinitätsbasierte Ansätze, einschließlich Antikörper-basierter Affinitätserfassung16 und Affinitätsfiltration17, bieten eine verbesserte Spezifität, sind aber aufgrund des geringen Volumens auf eine relativ niedrige Wiederfindungsrate beschränkt.
Um die Probleme bei der Erforschung der Phosphoproteindynamik in EVs anzugehen, hat unsere Gruppe extrazelluläre Vesikel-Total-Recovery- und Reinigungstechniken (EVtrap) entwickelt, die auf chemischer Affinität basieren, um EVs auf funktionalisierten magnetischen Kügelchen einzufangen18. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass diese auf magnetischen Kügelchen basierende EV-Isolationsmethode bei der Isolierung von EVs aus einer Vielzahl von Bioflüssigkeitsproben sehr effektiv ist und im Vergleich zu DUC und anderen bestehenden Isolationsmethoden in der Lage ist, eine viel höhere EV-Ausbeute bei gleichzeitiger Minimierung der Kontamination zu erzielen18,19. Wir haben EVtrap und eine von unserer Gruppe20 entwickelte Methode zur Anreicherung von Phosphopeptiden auf Titanbasis erfolgreich eingesetzt, um das Phosphoproteom von EVs aus verschiedenen Bioflüssigkeiten zu profilieren und potenzielle Phosphoprotein-Biomarker für verschiedene Krankheiten zu erkennen 19,21,22.
Hier stellen wir ein auf EVtrap basierendes Protokoll zur Isolierung von zirkulierenden Elektrofahrzeugen vor. Das Protokoll konzentriert sich auf die EVs im Urin. Wir demonstrieren auch die Charakterisierung isolierter Elektrofahrzeuge mittels Western Blotting. Anschließend beschreiben wir die Probenvorbereitung und die Massenspektrometrie (MS)-Erfassung sowohl für Proteomik- als auch für Phosphoproteomik-Analysen. Dieses Protokoll bietet einen effizienten und reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Profilierung des EV-Proteoms und Phosphoproteoms im Urin, was weitere Studien zu EVs und ihren klinischen Anwendungen erleichternwird 23.
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Protocol
Alle Urinproben wurden von gesunden Probanden nach Einverständniserklärung entnommen. Die Experimente entsprachen allen ethischen Standards mit menschlichen Proben und den Richtlinien des Purdue University Human Research Protection Program.
1. Probenentnahme
- Zentrifugieren Sie 12 ml Urinprobe in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 2.500 x g, 4 °C, um Zelltrümmer und große apoptotische Körper zu entfernen.
- 10 ml des Überstandes in ein neues 15-ml-Röhrchen überführen und mit der EV-Isolierung fortfahren.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, und die Proben können bei -80 °C gelagert und bei Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden.
2. Isolierung von Elektrofahrzeugen mit dem EVtrap-Ansatz
- 0,5 ml Ladepuffer (1:10 v/v-Verhältnis) und 100 μl EVtrap-Kügelchenaufschlämmung (1:50 v/v-Verhältnis) gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Probe geben.
- Inkubieren Sie die Probe durch End-über-Ende-Rotation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Pelletieren Sie die Probe, indem Sie das konische 15-ml-Röhrchen auf ein Magnetabscheidergestell legen. Entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Kügelchen in 1 ml Waschpuffer und überführen Sie die Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig, um die EV-gebundenen Kügelchen wieder zu suspendieren.
- Legen Sie das Röhrchen auf ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen-Magnetabscheidergestell und saugen Sie den Überstand ab. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um den Überstand vollständig abzusaugen und ein Ansaugen der Kügelchen zu vermeiden.
- Waschen Sie die Perlen mit 1 ml Waschpuffer. Fügen Sie den Puffer sofort nach dem Ansaugen des Überstandes hinzu, um ein Austrocknen der Perlen zu verhindern.
- Waschen Sie die Kügelchen 2x mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Kügelchen mit 100 μl frisch zubereitetem 100 mM Triethylamin für 10 Minuten bei Raumtemperatur und sammeln Sie die eluierte Lösung, die EVs enthält, mit einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen-Magnetabscheidergestell.
HINWEIS: Zur Herstellung von 1 ml 100 mM Triethylamin werden 14 μl Triethylaminlösung in Wasser verdünnt. - Wiederholen Sie Schritt 2.8 und kombinieren Sie die eluierten Lösungen. Das Eluat wird mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator bei 4 °C getrocknet.
HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden. Getrocknete EV-Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden, ohne dass die folgenden Schritte oder die Ergebnisse beeinträchtigt werden.
3. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch Western Blot
- Resuspendieren Sie 5 % der getrockneten EV-Probe (entsprechend 0,5 ml der Urinprobe) in 20 μl 1x Lithiumdodecylsulfat (LDS)-Probenpuffer mit 10 mM Dithiothreitol (DTT).
HINWEIS: EVs ab 0,5 ml Urin reichen aus, um das CD9-Signal (ein EV-Marker24) im Western Blot zu erkennen. - Die Probe wird 5 min bei 95 °C gekocht. Laden Sie die Probe auf ein Polyacrylamid-Gel und führen Sie Elektrophorese und Immunoblotting gemäß den Standardprotokollen25 durch.
- Nachdem die Proteine auf eine niedrig fluoreszierende Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) übertragen wurden, blockieren Sie die Membran mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween-20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Um 1 l TBST-Puffer herzustellen, fügen Sie 19 mM Trisbase, 137 mM NaCl und 1 ml Tween-20 hinzu; Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein.
- Membran mit Kaninchen-Anti-CD9-Antikörper im Verhältnis 1:5.000 in 1 % BSA in TBST bei 4 °C über Nacht oder 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit TBST. Die Membran wird 1 h lang bei Raumtemperatur mit Anti-Kaninchen-IgG, HRP-verknüpftem Sekundärantikörper im Verhältnis 1:5000 in 1% BSA in TBST inkubiert.
- Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit TBST. Geben Sie die kommerziell erhältlichen ECL-Substrate (Enhanced Chemiluminescence) (Verhältnis 1:1) auf die Membran und detektieren Sie Signale auf einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem.
4. Probenvorbereitung für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse
- Bereiten Sie frischen Lysepuffer mit 12 mM Natriumdesoxycholat (SDC), 12 mM Natriumlauroylsarcosinat (SLS), 100 mM Triethylammoniumbicarbonatpuffer (TEAB), 10 mM Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), 40 mM Chloracetamid (CAA) und 1x Phosphatase-Inhibitor-Cocktails vor.
HINWEIS: Die Lagerlösungen sind in der Beschreibung der Materialtabelle aufgeführt. Der Lysepuffer wird durch Zugabe der Stammlösungen hergestellt, um die gewünschten Konzentrationen in Abhängigkeit vom erforderlichen Volumen zu erreichen. - Die getrocknete EV-Probe wird in 100 μl Lysepuffer gelöst und die Probe 10 Minuten lang bei 95 °C unter Schütteln bei 1.100 U/min erhitzt.
- Nachdem Sie die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt haben, verdünnen Sie sie um das Fünffache, indem Sie 400 μl 50 mM TEAB hinzufügen.
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie den Lysepuffer fünffach verdünnt mit 50 mM TEAB als Blindwert.
- Die Trypsin/Lys-C-Mischung wird mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:50 w/w zugegeben und die Probe wird über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 1.100 U/min inkubiert.
- Fügen Sie 50 μl 10%ige Trifluoressigsäure (TFA) hinzu, um die Probe anzusäuern.
- Geben Sie 600 μl Ethylacetat zu den Proben und wirbeln Sie die Mischung 2 Minuten lang auf.
- Die Probe wird 3 min bei 20.000 x g zentrifugiert und die obere Schicht (organische Schicht) entfernt. Vermeiden Sie es, die Schnittstelle während der Aspiration zu stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.7 bis 4.8. Trocknen Sie die wässrige Phase mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator.
- Resuspendieren Sie die getrocknete Probe in 200 μl 0,1 % TFA, um die Peptide anzusäuern, und entsalzen Sie die Probe mit einer C18-Entsalzungsspitze gemäß den Anweisungen des Herstellers. Konditionieren Sie die Spitze mit 200 μl 0,1 % TFA in 80 % Acetonitril, gefolgt von 2x 200 μl 0,1 % TFA. Laden Sie die angesäuerte Peptidprobe in die Spitze und waschen Sie die Spitze dann 3x mit 200 μl 0,1% TFA. Die Peptide werden mit 200 μl 0,1 % TFA in 80 % Acetonitril eluiert.
- Trocknen Sie das Eluat mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator. Trocknen Sie 2 % der Peptidprobe (entsprechend 0,2 ml der Urinprobe) separat für die Proteomik-Analyse. Verwenden Sie den Rest (98 %) der Probe für die Phosphoproteomik-Analyse.
- Reichern Sie Phosphopeptide aus der Probe mit einem Phosphopeptid-Anreicherungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers an. Führen Sie die unten beschriebenen Schritte für die Anreicherung aus.
- Resuspendieren Sie die getrocknete Probe in 200 μl Ladepuffer. 50 μl der Kügelchen zur Probe geben und 20 min bei Raumtemperatur kräftig schütteln. Die Probe mit den Kügelchen in die Frittenspitze geben und 1 min bei 100 x g zentrifugieren.
- Waschen Sie die Spitze mit 200 μl Ladepuffer, gefolgt von Waschpuffer 1 und dann Waschpuffer 2. Alle drei Waschschritte werden durchgeführt, indem Sie einmal für 2 Minuten bei 20 x g und einmal für 1 Minute bei 100 x g zentrifugieren.
- Stecken Sie die Spitze mit den Perlen in ein neues Röhrchen, um die eluierten Phosphopeptide aufzufangen. Geben Sie 50 μl Elutionspuffer in die Spitze und zentrifugieren Sie einmal 2 Minuten lang bei 20 x g. Geben Sie weitere 50 μl Elutionspuffer in die Spitze und zentrifugieren Sie einmal 2 Minuten lang bei 20 x g. Ein letztes Mal 1 min bei 100 x g zentrifugieren.
- Trocknen Sie die eluierten Phosphopeptide mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator.
5. LC-MS/MS-Analyse
HINWEIS: Es können verschiedene LC-MS/MS-Systeme/-Einstellungen und Datenerfassungsmethoden, wie z. B. die datenabhängige Erfassung (DDA), verwendet werden.
- Resuspendieren Sie die getrockneten Proteom-/Phosphoproteom-Proben in 0,1%iger Ameisensäure (Lösungsmittel A) und laden Sie die Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Injizieren Sie die Proben durch das Flüssigchromatographie-System (LC) in eine Flugzeit-MS mit gefangener Ionenmobilität und verwenden Sie die voreingestellte standardisierte Whisper-Methode mit 40 Proben pro Tag. Die Peptide werden auf einer 15 cm C18-Säule (75 μm Innendurchmesser, 1,9 μm Partikelgröße) getrennt, wie in der Materialtabelle angegeben.
- Für die Proteomik-Analyse werden Daten mit einer parallelen akkumulationsseriellen Fragmentierung in Kombination mit einer datenunabhängigen Erfassungsmethode (dia-PASEF) mit einem Massenbereich pro Rampe von 300-1200 m/z und von 0,6-1,50 1/K0 mit einer Zykluszeit von 1,38 s erfasst.
- Für die Phosphoproteomik-Analyse werden Daten mit einer dia-PASEF-Erfassungsmethode mit einem Massenbereich pro Rampe von 400-1550 m/z und 0,6-1,50 1/K0 mit einer Zykluszeit von 1,38 s erfasst.
- Laden Sie die Rohdateien in die Proteomik-Software und führen Sie die Signalextraktion, -identifizierung und -quantifizierung mithilfe eines bibliotheksfreien, datenunabhängigen Erfassungs-Workflows durch.
- Verwenden Sie für die Sucheinstellungen die Homo sapiens-Datenbank , spezifische Verdaustypen mit Trypsin/P-Enzymen, 7 minimale Peptidlänge, 52 maximale Peptidlänge, zwei verpasste Spaltungen, Carbamidomethyl als feste Modifikation, Acetylprotein N-Term, Oxidation bei Methionin und Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin (für die Phosphoproteomik-Analyse) als variable Modifikationen und 5 als maximale variable Modifikationen. Legen Sie den FDR-Wert bei PSM, Peptid- und Proteingruppe auf 0,01 fest.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die Spectronaut-Software verwendet. Andere DIA-Datensuchsoftware wie DIA-NN und PEAKS werden ebenfalls häufig verwendet. Wenn Daten im DDA-Modus erfasst wurden, sind Software wie MaxQuant und Proteome Discoverer anwendbar.
- Verwenden Sie für die Sucheinstellungen die Homo sapiens-Datenbank , spezifische Verdaustypen mit Trypsin/P-Enzymen, 7 minimale Peptidlänge, 52 maximale Peptidlänge, zwei verpasste Spaltungen, Carbamidomethyl als feste Modifikation, Acetylprotein N-Term, Oxidation bei Methionin und Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin (für die Phosphoproteomik-Analyse) als variable Modifikationen und 5 als maximale variable Modifikationen. Legen Sie den FDR-Wert bei PSM, Peptid- und Proteingruppe auf 0,01 fest.
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Representative Results
Dieses Protokoll demonstriert einen umfassenden Arbeitsablauf von der Isolierung von EVs bis hin zu nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analysen (Abbildung 1). Die dreifachen Urinproben wurden einer EV-Isolierung unterzogen. Die isolierten EVs wurden mittels Western Blot charakterisiert und anschließend für die massenspektrometriebasierte Proteomik-Probenvorbereitung einschließlich Proteinextraktion, enzymatischer Verdauung und Peptidaufreinigung verarbeitet. Für die Phosphoproteomik-Analyse wurden die Phosphopeptide auf Basis von Metallionen-funktionalisierten löslichen Nanopolymeren weiter angereichert. Sowohl Peptid- als auch Phosphopeptidproben wurden mittels hochauflösender Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie im datenunabhängigen Modus analysiert. Die resultierenden Rohdateien wurden mit der Homo sapiens-Datenbank abgeglichen und ein bibliotheksfreier, datenunabhängiger Erfassungsworkflow zur Identifizierung und Quantifizierung auf MS2-Ebene durchgeführt.
Um die isolierten EVs zu charakterisieren und die Wiederfindungsausbeute abzuschätzen, haben wir zunächst ein Äquivalent von 0,5 ml EV-haltigem Urin auf das Gel für das Western Blot geladen, um den EV-Marker CD9 zu detektieren (Abbildung 2A). Darüber hinaus haben wir die EVs, die aus dem gleichen Urinvolumen isoliert wurden, mit der am häufigsten verwendeten Methode zur Isolierung von EVs, der differentiellen Ultrazentrifugation (DUC), zum Vergleich einbezogen. Die Ergebnisse zeigten, dass EVtrap im Vergleich zu DUC in der Lage war, viel höhere CD9-Signale zu erzeugen, was auf eine effektive Erfassung von EVs durch die Beads hindeutet. Weitere quantitative Werte für jedes CD9-Band-Signal zeigten, dass EVtrap eine Rückgewinnungsausbeute von ~99% im Vergleich zur 5-fachen Intensität der direkten Urinkontrolle erzielte, während DUC nur ~1,5% der EVs zurückeroberte (Abbildung 2B).
Indem wir 2 % jeder Probe auf die LC-MS/MS für die Proteom-Profilierung luden, identifizierten wir > 11.000 einzigartige Peptide aus ~2.200 einzigartigen Proteinen (Abbildung 3A), was darauf hindeutet, dass dieser Arbeitsablauf eine detaillierte Abdeckung des EV-Proteoms bietet. Es wurde ein hohes Maß an Überlappung bei der Proteinidentifikation zwischen den Proben beobachtet, wobei 72 % der einzigartigen Proteine in allen drei Replikaten konsistent identifiziert wurden (Abbildung 3B). Darüber hinaus verglichen wir die Identifizierungsergebnisse mit der ExoCarta-Datenbank (Abbildung 3C)26. Bemerkenswert ist, dass wir von den Top 100 EV-Markern und -Proteinen ~90 dieser EV-Proteine erfolgreich identifiziert haben, was auf eine unvoreingenommene und vollständige Profilierung von EV-Proteinen durch diese Proteomik-Analyse hindeutet. Um die quantitative Genauigkeit zu beurteilen, haben wir die Verteilung der Variationskoeffizienten (CV) für die Ergebnisse der Proteinquantifizierung weiter ausgewertet (Abbildung 3D). Ein niedriger mittlerer CV-Wert (5,7 %) weist auf die hohe Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit des Verfahrens hin, einschließlich EV-Isolierung, Probenvorbereitung und MS-Detektion.
Für die Phosphoproteomik-Analyse haben wir 98% jeder Peptidprobe für die Phosphopeptid-Anreicherung verwendet und ~800 einzigartige Phosphopeptide identifiziert, die ~350 einzigartigen Phosphoproteinen entsprechen (Abbildung 4A). Die Anreicherung ergab durchschnittlich 72 % Phosphoserin (pS)-Peptide, 22 % Phosphothreonin (pT) bzw. 6 % Phosphotyrosin (pY)-Peptide (Abbildung 4B). In Bezug auf die Reproduzierbarkeit der Identifizierung der drei Replikate wurden 42 % der Phosphopeptide durch alle drei Analysen identifiziert, und es gab eine ~50 % Überlappung zwischen jeweils zwei Analysen (Abbildung 4C). Für die Quantifizierung von Phosphopeptiden wurde ein mittleres CV von 21,8 % bestimmt, was auf eine akzeptable quantitative Reproduzierbarkeit mit diesem Protokoll hindeutet (Abbildung 4D).
Abbildung 1: Schematischer Arbeitsablauf für die Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EV) im Urin und nachgeschaltete Analysen. EVs werden aus Urinproben durch den EVtrap-Ansatz (Extracellular Vesicles Total Recovery and Purification) isoliert, und die isolierten EVs werden direkt einer Western-Blotting-Analyse unterzogen. Für die LC-MS/MS-Analyse werden Proteine aus EVs extrahiert und zu Peptiden verdaut. Die Peptidproben nach den Reinigungsschritten können für die Proteomik-Analyse oder die Phosphoproteomik-Analyse nach der Phosphopeptid-Anreicherung verwendet werden. Sowohl Proteomik- als auch Phosphoproteomik-Proben werden mittels LC-MS/MS analysiert. Die Identifizierung und Quantifizierung erfolgt dann mit Hilfe der datenunabhängigen Erfassung (DIA) Workflow-Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung isolierter EVs mittels Western Blotting. (A) Nachweis des EV-Markers CD9 aus 0,1 ml direkter Urinprobe (n=1), EVs, die mit Differentialzentrifugation (DUC) isoliert wurden (n=3), und EVs, die mit EVtrap-Ansatz isoliert wurden (n=3). (B) Die Quantifizierung der Western-Blotting-Signale in (A) wird als prozentuale Wiederfindung relativ zur direkten Urinprobe (5-fache Intensität = 100%) dargestellt. Für die DUC- und EVtrap-Stichproben zeigt das Balkendiagramm die durchschnittlichen Intensitäten und Standardabweichungen (dargestellt durch Fehlerbalken) von den Triplikaten an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Proteomik-Analyse isolierter EVs . (A) Die Gesamtzahl der identifizierten einzigartigen Proteine und Peptide in Dreifachen. (B) Venn-Diagramm, das die Überlappung identifizierter eindeutiger Proteine zwischen Replikaten zeigt. (C) Die Anzahl der identifizierten eindeutigen Proteine, die den Top 100 EV-Markern in der ExoCarta-Datenbank entsprechen. (D) Dichtediagramm, das die Verteilung des Variationskoeffizienten (CV) für die Proteinquantifizierung zeigt. Der mediane CV-Wert wird durch eine rot gestrichelte Linie hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Phosphoproteomik-Analyse isolierter EVs . (A) Die Gesamtzahl der identifizierten eindeutigen Phosphoproteine und Phosphopeptide in Dreifachen. (B) Prozentuale Zusammensetzung der pSTY-Peptide nach Phosphopeptidanreicherung. (C) Venn-Diagramm, das die Überlappung der identifizierten eindeutigen Phosphopeptide zwischen den Replikaten zeigt. (D) Dichtediagramm, das die Verteilung der CV für die Quantifizierung von Phosphopeptiden zeigt. Der mediane CV-Wert wird durch eine rot gestrichelte Linie hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Eine effektive EV-Isolierung ist eine wesentliche Voraussetzung für den Nachweis von Proteinen und Phosphoproteinen mit geringer Häufigkeit in EVs. Trotz der Entwicklung zahlreicher Methoden, um diesen Bedarf zu decken, leidet die Mehrheit immer noch unter Einschränkungen wie schlechter Erholung oder geringer Reproduzierbarkeit, die ihren Einsatz in groß angelegten Studien und klinischen Routineumgebungen behindern. DUC wird im Allgemeinen als die gebräuchlichste Methode zur Isolierung von Elektrofahrzeugen angesehen, und die zusätzlichen Waschschritte werden normalerweise angewendet, um die Reinheit der Ziel-Elektrofahrzeuge zu erhöhen27,28. Dieses Verfahren führt zu einem langwierigeren und zeitaufwändigeren DUC-Prozess (> 6 h). Darüber hinaus wurde in mehreren Studien über eine geringe EV-Rückgewinnungsausbeute nach DUC berichtet,29,30 und in den Ergebnissen in Abbildung 2 gezeigt. Im Vergleich dazu bietet EVtrap eine effiziente EV-Isolierung (< 1 h) und eine hohe Rückgewinnungsausbeute (Abbildung 2). Insbesondere die erfolgreiche Anwendung dieses Arbeitsablaufs markiert einen entscheidenden Fortschritt für die Identifizierung signifikanter EV-Marker für verschiedene Krankheiten und Krebsarten 19,21,22 EVtrap ist jedoch nicht in der Lage, spezifische Subpopulationen von EVs, wie Mikrovesikel oder Exosomen, zu isolieren, da es die gesamte EV-Population erfasst.
In diesem Protokoll verwendeten wir 2 % und 98 % der Peptidprobe für Proteomik- und Phosphoproteomik-Analysen. Da die EVs, die mit EVtrap aus 10 ml Urin isoliert werden, typischerweise 100-200 μg Gesamtproteine ergeben, sind 98% der Peptide nach der Verdauung und Reinigung für die Phosphopeptidanreicherung ausreichend. Wenn für die quantitative MS-Analyse ein Markierungsschritt, wie z. B. eine Tandem-Massen-Tag-Markierung (TMT), erforderlich ist, kann eine Peptidkonzentrationsmessung im Anschluss an den Entsalzungsschritt durchgeführt werden, um die Peptidmenge zu normalisieren und die Genauigkeit der Quantifizierungzu verbessern 31.
Während dieses Protokoll in erster Linie die Verwendung von EVtrap zur Isolierung von EVs im Urin hervorhebt, ist es erwähnenswert, dass die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der Verarbeitung verschiedener Probentypen nachgewiesen wurde32,33,34. Basierend auf früheren Ergebnissen war die in diesem Protokoll verwendete Bedingung auf die Isolierung von EVs aus Zellkulturmedien anwendbar. Für die Isolierung von zellsezernierten EVs werden die Zellen unter fötalem Rinderserum (FBS)-freien oder EV-depletierten FBS-Bedingungen kultiviert, um eine Co-Isolierung von übermäßigen FBS-abgeleiteten EVs mit zellsezernierten EVs zu verhindern, was die Zuverlässigkeit der Ergebnisse untergräbt35. Darüber hinaus können die isolierten EVs aus anderen Probentypen durch Western-Blotting-Analyse unter Verwendung mehrerer gängiger EV-Marker charakterisiert werden, darunter CD9, CD63, CD81, das Tumor-Suszeptibilitäts-Gen 101-Protein (TSG101) und das ALG-2-interagierende Protein X (ALIX)36.
Um die Abdeckung zu erhöhen und die Quantifizierung in der MS-Analyse zu verbessern, ist der Aufbau einer projektspezifischen Bibliothek zum Durchsuchen von DIA-Daten eine alternative Option. Aufgrund der Komplexität der im DIA-Modus erzeugten Spektren ist eine Spektralbibliothek, die eine Sammlung von Referenzspektren enthält, von Vorteil, um die Sicherheit bei der Identifizierung zu erhöhen und die Abdeckung zu verbessern. Hochwertige Spektralbibliotheken können erzeugt werden, indem eine DDA-Analyse an denselben Proben oder vorfraktionierten Probendurchgeführt wird 37. Die Bibliothek kann auch verwendet werden, um optimale Fenster für dia-PASEF zu bestimmen und die Identifizierung weiter zu verbessern38.
Zusammenfassend bietet das vorgestellte Protokoll eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von EVs aus Urinproben für Proteomik- und Phosphoproteomik-Analysen. Durch die Implementierung dieses Protokolls erwarten wir eine verbesserte Detektion von EV-Proteinen und Phosphoproteinen mit geringer Häufigkeit als Biomarker für die Früherkennung von Krankheiten und die longitudinale Überwachung. Darüber hinaus haben Forscher die große Chance, das Feld der EV-Forschung voranzutreiben und zu besseren diagnostischen und therapeutischen Strategien beizutragen.
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Disclosures
Die Autoren erklären ein konkurrierendes finanzielles Interesse. Anton Iliuk und W. Andy Tao sind Mitbegründer von Tymora Analytical Operations, einem Unternehmen, das EVtrap-Beads entwickelt und das PolyMAC-Phosphopeptid-Anreicherungskit auf den Markt gebracht hat.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH-Zuschüsse 3RF1AG064250 und R44CA239845 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
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