Summary
Denne protokol indeholder detaljerede beskrivelser for effektiv isolering af ekstracellulære vesikler i urinen ved hjælp af funktionaliserede magnetiske perler. Desuden omfatter det efterfølgende analyser, herunder western blotting, proteomics og phosphoproteomics.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV'er) fra biofluider har for nylig fået betydelig opmærksomhed inden for flydende biopsi. Frigivet af næsten alle typer celler, giver de et realtidsbillede af værtsceller og indeholder et væld af molekylær information, herunder proteiner, især dem med posttranslationelle modifikationer (PTM'er) såsom phosphorylering, som hovedaktøren i cellulære funktioner og sygdomsdebut og progression. Imidlertid er isoleringen af elbiler fra biofluider fortsat udfordrende på grund af lave udbytter og urenheder fra de nuværende EV-isoleringsmetoder, hvilket gør downstream-analysen af EV-last, såsom EV-phosphoproteiner, vanskelig. Her beskriver vi en hurtig og effektiv EV-isoleringsmetode baseret på funktionaliserede magnetiske perler til EV-isolering fra biofluider såsom human urin og nedstrøms proteomics og phosphoproteomics analyse efter EV-isolering. Protokollen muliggjorde et højt genvindingsudbytte af urin-EV'er og følsomme profiler af EV-proteom og phosphoproteom. Desuden behandles denne protokols alsidighed og relevante tekniske overvejelser også her.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er membranindkapslede nanopartikler, der udskilles af alle typer celler og er til stede i biofluider såsom blod, urin, spyt osv.1,2,3,4. EV'er bærer en last af forskellige bioaktive molekyler, der afspejler deres værtscellers fysiologiske og patologiske tilstand og derfor fungerer som afgørende faktorer i sygdomsprogression 4,5,6. Desuden har omfattende undersøgelser fastslået, at EV-baserede sygdomsmarkører kan identificeres før symptomdebut eller fysiologisk påvisning af tumorer 5,6,7.
Fosforylering fungerer som en nøglemekanisme i cellulær signalering og regulering. Derfor giver phosphoproteiner en værdifuld kilde til opdagelse af biomarkører, da afvigende fosforyleringshændelser er forbundet med dysregulerede cellulære signalveje og metastatisk sygdomsudvikling såsom kræft 8,9,10. Selvom profilering af fosforyleringsdynamik gør det muligt at identificere sygdomsspecifikke phosphoproteinsignaturer som potentielle biomarkører, udgør phosphoproteiners lave forekomst og dynamiske natur store udfordringer i udviklingen af phosphoproteiner som biomarkører11,12. Især er de fosfoproteiner med lavt rigelige mængder, der er indkapslet i EV'er, beskyttet mod ekstern enzymatisk fordøjelse i det ekstracellulære miljø8. Derfor tilbyder EV'er og EV-afledte phosphoproteiner en ideel kilde til biomarkøropdagelse i den tidlige fase af påvisning af kræft og andre sygdomme.
Selvom analyse af proteinfosforylering i elbiler giver en værdifuld ressource til forståelse af kræftsignalering og tidlig sygdomsdiagnose, udgør manglen på effektive EV-isoleringsmetoder en stor barriere. EV-isolering opnås almindeligvis gennem differentiel ultracentrifugering (DUC)13. Denne metode er imidlertid tidskrævende og er ikke egnet til kliniske implikationer på grund af lav gennemstrømning og dårlig reproducerbarhed13,14. Alternative EV-isolationsmetoder, såsom polymerinduceret udfældning15, er begrænset af lav specificitet på grund af samtidig udfældning af ikke-EV-proteiner. Affinitetsbaserede tilgange, herunder antistofbaseret affinitetsregistrering16 og affinitetsfiltrering17, tilbyder forbedret specificitet, men er begrænset til en relativt lav genoprettelsesrate på grund af lille volumen.
For at løse problemerne med at udforske fosfoproteindynamik i EV'er har vores gruppe udviklet ekstracellulære vesikler total recovery and purification (EVtrap) teknik baseret på kemisk affinitet til at fange EV'er på funktionaliserede magnetiske perler18. Tidligere resultater har vist, at denne magnetiske perlebaserede EV-isoleringsmetode er yderst effektiv til isolering af elbiler fra en lang række biofluidprøver og er i stand til at opnå meget højere EV-udbytte, samtidig med at forurening minimeres sammenlignet med DUC og andre eksisterende isolationsmetoder18,19. Vi har med succes brugt EVtrap og en titaniumbaseret phosphopeptidberigelsesmetode udviklet af vores gruppe20 til at profilere phosphoproteomet af EV'er afledt af forskellige biofluider og til at detektere potentielle phosphoproteinbiomarkører for forskellige sygdomme 19,21,22.
Her præsenterer vi en protokol baseret på EVtrap til isolering af cirkulerende elbiler. Protokollen fokuserer på urin EV'er. Vi demonstrerer også karakteriseringen af isolerede elbiler ved hjælp af western blotting. Vi beskriver derefter prøveforberedelsen og massespektrometri (MS) erhvervelsen til både proteomics og phosphoproteomics analyser. Denne protokol giver en effektiv og reproducerbar arbejdsgang til profilering af EV-proteomet og phosphoproteomet i urinen, hvilket vil lette yderligere undersøgelser af EV'er og deres kliniske anvendelser23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle urinprøver blev indsamlet fra raske personer efter informeret samtykke. Eksperimenterne var i overensstemmelse med alle etiske standarder, der involverede menneskelige prøver og var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Purdue University Human Research Protection Program.
1. Indsamling af prøver
- Der centrifugeres 12 ml urinprøve i et 15 ml konisk centrifugerør i 10 minutter ved 2.500 x g, 4 °C for at fjerne cellerester og store apoptotiske legemer.
- Overfør 10 ml supernatant til et nyt 15 ml rør og fortsæt med EV-isolation.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og prøverne kan opbevares ved -80 °C og optøs ved 37 °C efter brug.
2. EV-isolering ved hjælp af EVtrap-tilgangen
- Der tilsættes 0,5 ml påfyldningsbuffer (forholdet 1:10 v/v) og 100 μL EVtrap-perleopslæmning (forholdet 1:50 v/v) til prøven i henhold til producentens anvisninger.
- Prøven inkuberes ved ende-over-ende-rotation i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Pellet prøven ved at placere det 15 ml koniske rør på et magnetisk separatorstativ. Supernatanten fjernes.
- Resuspender perlerne i 1 ml vaskebuffer og overfør suspensionen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Afpipette afpipetteres forsigtigt for at ophvirvle de EV-bundne perler.
- Glasset anbringes på et magnetisk separatorstativ med 1,5 ml mikrocentrifugerør, og supernatanten suges til sig. Brug en P200-pipette til fuldstændig opsugning af supernatanten og undgå at opsuge perlerne.
- Vask perlerne med 1 ml vaskebuffer. Bufferen tilsættes umiddelbart efter opsugning af supernatanten for at forhindre, at perlerne tørrer ud.
- Puds perlerne 2x med 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS) ved stuetemperatur.
- Inkuber perlerne med 100 μL frisklavet 100 mM triethylamin i 10 minutter ved stuetemperatur og opsaml den eluerede opløsning indeholdende EV'er ved hjælp af et 1,5 ml mikrocentrifugerør magnetisk separatorstativ.
BEMÆRK: For at forberede 1 ml 100 mM triethylamin fortyndes 14 μL triethylaminopløsning i vand. - Gentag trin 2.8, og kombiner de eluerede opløsninger. Eluatet tørres ved hjælp af en vakuumcentrifugekoncentrator ved 4 °C.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her. Tørrede EV-prøver kan opbevares ved -80 °C i flere måneder uden negative virkninger på følgende trin eller resultaterne.
3. Karakterisering af elbiler ved western blotting
- Resuspender 5% af den tørrede EV-prøve (svarende til 0,5 ml af urinprøven) i 20 μL 1x lithiumdodecylsulfat (LDS) prøvebuffer med 10 mM dithiothreitol (DTT).
BEMÆRK: EV'er fra 0,5 ml urin er nok til at detektere CD9 (en EV-markør24) signal i western blotting. - Kog prøven i 5 min ved 95 °C. Prøven lægges på en polyacrylamidgel, og der udføres elektroforese og immunblotting efter standardprotokoller25.
- Efter overførsel af proteinerne til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran med lav fluorescens blokeres membranen med 1% bovint serumalbumin (BSA) i tris-bufret saltvand tween-20 (TBST) i 1 time ved stuetemperatur. For at forberede 1 liter TBST-buffer tilsættes 19 mM Tris-base, 137 mM NaCl og 1 ml Tween-20; juster pH til 7,4 ved hjælp af HCI.
- Inkuber membranen med kaninanti-CD9-antistof i forholdet 1:5.000 i 1 % BSA i TBST ved 4 °C natten over eller i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask membranen 3x i 5 min hver med TBST. Inkuber membranen med anti-kanin IgG, HRP-bundet sekundært antistof i forholdet 1:5000 i 1% BSA i TBST i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask membranen 3x i 5 min hver med TBST. Tilføj de kommercielt opnåede ECL-substrater (enhanced chemiluminescence) (forholdet 1:1) på membranen, og detekter signaler på et kemiluminescensbilleddannelsessystem.
4. Prøveforberedelse til proteomforskning og phosphoproteomics-analyse
- Forbered frisk lysisbuffer indeholdende 12 mM natriumdeoxycholat (SDC), 12 mM natriumlauroylsarcosinat (SLS), 100 mM triethylammoniumbicarbonatbuffer (TEAB), 10 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), 40 mM chloracetamid (CAA) og 1x fosfatasehæmmercocktails.
BEMÆRK: Stamopløsningerne er angivet i beskrivelsen af materialetabellen. Lysisbufferen fremstilles ved tilsætning af stamopløsningerne for at opnå de ønskede koncentrationer afhængigt af det krævede volumen. - Den tørrede EV-prøve opløses i 100 μL lysisbuffer, og prøven opvarmes i 10 minutter ved 95 °C under omrystning ved 1.100 omdr./min.
- Efter afkøling af prøven til stuetemperatur fortyndes den fem gange ved tilsætning af 400 μL 50 mM TEAB.
- Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af et BCA-analysesæt i henhold til producentens anvisninger. Brug lysisbufferen fortyndet fem gange med 50 mM TEAB som blindprøve.
- Der tilsættes trypsin/Lys-C-blanding ved 1:50 w/w enzym-/protein-forhold, og prøven inkuberes ved 37 °C natten over under omrystning ved 1.100 omdr./min.
- Der tilsættes 50 μL 10% trifluoreddikesyre (TFA) for at syrne prøven.
- Der tilsættes 600 μL ethylacetat til prøverne, og blandingen hvirvles i 2 minutter.
- Centrifuger prøven i 3 minutter ved 20.000 x g , og fjern det øverste lag (organisk lag). Undgå at forstyrre grænsefladen under aspiration.
- Gentag trin 4.7-4.8. Den vandige fase tørres ved hjælp af en vakuumcentrifugekoncentrator.
- Den tørrede prøve resuspenderes i 200 μL 0,1% TFA for at syrne peptiderne og afsaltes prøven ved hjælp af en C18-afsaltningsspids i henhold til producentens anvisninger. Konditioner spidsen med 200 μL 0,1% TFA i 80% acetonitril, efterfulgt af 2x med 200 μL 0,1% TFA. Læg den syrnede peptidprøve i spidsen, og vask derefter spidsen 3x med 200 μL 0,1% TFA. Eluer peptiderne med 200 μL 0,1% TFA i 80% acetonitril.
- Eluatet tørres ved hjælp af en vakuumcentrifugekoncentrator. Tør 2% af peptidprøven (svarende til 0,2 ml af urinprøven) separat til proteomics-analyse. Brug resten (98%) af prøven til phosphoproteomics analyse.
- Berig phosphopeptider fra prøven ved hjælp af et phosphopeptidberigelsessæt i henhold til producentens anvisninger. Udfør de trin, der er beskrevet nedenfor, for forbedring.
- Den tørrede prøve resuspenderes i 200 μL påfyldningsbuffer. Tilsæt 50 μL af perlerne til prøven og ryst kraftigt i 20 minutter ved stuetemperatur. Fyld prøven med perlerne på den frittede spids og centrifuger i 1 min ved 100 x g.
- Spidsen vaskes med 200 μL påfyldningsbuffer efterfulgt af vaskebuffer 1 og derefter vaskebuffer 2. Udfør alle tre vasketrin ved centrifugering én gang i 2 minutter ved 20 x g og én gang i 1 minut ved 100 x g.
- Sæt spidsen med perler i et nyt rør for at opsamle de eluerede phosphopeptider. Der tilsættes 50 μL elueringsbuffer til spidsen, og centrifugeres én gang i 2 minutter ved 20 x g. Der tilsættes yderligere 50 μL elueringsbuffer til spidsen, og centrifugeres én gang i 2 minutter ved 20 x g. Centrifuger en sidste gang i 1 min ved 100 x g.
- De eluerede phosphopeptider tørres ved hjælp af en vakuumcentrifugekoncentrator.
5. LC-MS/MS-analyse
BEMÆRK: Forskellige LC-MS/MS-systemer/-indstillinger og dataindsamlingsmetoder, såsom dataafhængig erhvervelse (DDA) kan bruges.
- Resuspender de tørrede proteom-/phosphoproteomprøver i 0,1% myresyre (opløsningsmiddel A), og fyld prøverne i henhold til producentens anvisninger.
- Injicer prøverne i fanget ion-mobilitet time-of-flight MS gennem væskekromatografisystemet (LC) og brug den forudindstillede standardiserede Whisper 40 prøver pr. Dag-metode. Peptider adskilles på en 15 cm C18-søjle (75 μm indvendig diameter, 1,9 μm partikelstørrelse) som nævnt i materialetabellen.
- Til proteomics-analyse indsamles data ved hjælp af en parallel akkumuleringsseriel fragmentering kombineret med datauafhængig erhvervelsesmetode (dia-PASEF) med et masseområde pr. rampe, der spænder fra 300-1200 m/z og fra 0,6-1,50 1/K0 med en cyklustid på 1,38 s.
- Til phosphoproteomics-analyse erhverves data ved hjælp af en dia-PASEF-erhvervelsesmetode med et masseområde pr. rampe, der spænder fra 400-1550 m / z og 0,6-1,50 1 / K0 med en cyklustid på 1,38 s.
- Indlæs raw-filerne i proteomics-software, og udfør signaludtrækning, identifikation og kvantificering ved hjælp af en biblioteksfri datauafhængig arbejdsgang til erhvervelse.
- Til søgeindstillinger skal du bruge Homo sapiens-databasen , specifikke fordøjelsestyper med trypsin / P-enzymer, 7 minimal peptidlængde, 52 maksimal peptidlængde, to savnet spaltning, carbamidomethyl ved cystein som fast modifikation, acetylprotein N-term, oxidation ved methionin og phosphorylering ved serin, threonin og tyrosin (til phosphoproteomics-analyse) som variable modifikationer og 5 som maksimale variable modifikationer. Indstil FDR ved PSM, peptid og proteingruppe til 0,01.
BEMÆRK: Spectronaut-software blev brugt i denne protokol. Andre DIA-datasøgningssoftware såsom DIA-NN og PEAKS er også almindeligt anvendt. Hvis data blev erhvervet i DDA-tilstand, er software som MaxQuant og Proteome Discoverer gældende.
- Til søgeindstillinger skal du bruge Homo sapiens-databasen , specifikke fordøjelsestyper med trypsin / P-enzymer, 7 minimal peptidlængde, 52 maksimal peptidlængde, to savnet spaltning, carbamidomethyl ved cystein som fast modifikation, acetylprotein N-term, oxidation ved methionin og phosphorylering ved serin, threonin og tyrosin (til phosphoproteomics-analyse) som variable modifikationer og 5 som maksimale variable modifikationer. Indstil FDR ved PSM, peptid og proteingruppe til 0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol demonstrerer en omfattende arbejdsgang fra isolering af elbiler til downstream-proteomics og phosphoproteomics-analyser (figur 1). De tredobbelte urinprøver blev udsat for EV-isolering. De isolerede EV'er blev karakteriseret ved western blotting og efterfølgende behandlet til massespektrometribaseret proteomics prøveforberedelse, herunder proteinekstraktion, enzymatisk fordøjelse og peptidoprydning. Til phosphoproteomics-analyse blev phosphopeptiderne yderligere beriget baseret på metalionfunktionaliserede opløselige nanopolymerer. Både peptid- og phosphopeptidprøver blev analyseret ved massespektrometri med høj opløsning ionmobilitet under datauafhængig tilstand. Resultatet råfiler blev søgt mod Homo sapiens database, og biblioteksfri datauafhængig erhvervelse workflow blev udført til identifikation og MS2-niveau kvantificering.
For at karakterisere de isolerede elbiler og estimere genvindingsudbyttet lagde vi først en ækvivalent på 0,5 ml urinholdige EV'er på gelen til western blotting for at detektere EV-markøren CD9 (figur 2A). Derudover inkluderede vi elbilerne isoleret fra den samme mængde urin ved hjælp af den mest anvendte metode til EV-isolering, differentiel ultracentrifugering (DUC), til sammenligning. Resultaterne viste, at EVtrap var i stand til at producere meget højere CD9-signaler sammenlignet med DUC, hvilket indikerer en effektiv opfangning af elbiler ved perlerne. Yderligere kvantitative værdier for hvert CD9-båndsignal viste, at EVtrap opnåede et genvindingsudbytte på ~99% sammenlignet med den 5-dobbelte intensitet af den direkte urinkontrol, mens DUC kun genvandt ~1,5% af EV'erne (figur 2B).
Ved at indlæse 2% af hver prøve på LC-MS/MS til proteomisk profilering identificerede vi > 11.000 unikke peptider fra ~2.200 unikke proteiner (figur 3A), hvilket indikerer, at denne arbejdsgang giver en dybdegående dækning af EV-proteom. Der blev observeret en høj grad af overlapning i proteinidentifikationer på tværs af prøver, hvor 72% af unikke proteiner blev konsekvent identificeret i alle tre replikater (figur 3B). Desuden sammenlignede vi identifikationsresultaterne med ExoCarta-databasen (figur 3C)26. Især ud af de 100 bedste EV-markører og proteiner identificerede vi med succes ~ 90 af disse EV-proteiner, hvilket tyder på en upartisk og komplet profilering af EV-proteiner gennem denne proteomics-analyse. For at vurdere den kvantitative præcision evaluerede vi yderligere fordelingen af variationskoefficienter (CV) for proteinkvantificeringsresultaterne (figur 3D). Et lavt medium CV (5,7%) indikerer procedurens høje reproducerbarhed og pålidelighed, herunder EV-isolering, prøveforberedelse og MS-detektion.
Til phosphoproteomics-analysen brugte vi 98% af hver peptidprøve til phosphopeptidberigelsen og identificerede ~800 unikke phosphopeptider svarende til ~350 unikke phosphoproteiner (figur 4A). Berigelsen gav i gennemsnit henholdsvis 72% phosphoserin (pS) peptider, 22% phosphothreonin (pT) og 6% phosphotyrosin (pY) peptider (figur 4B). Med hensyn til identifikationsreproducerbarheden af de tre replikater blev 42% af phosphopeptiderne identificeret ved alle tre analyser, og der var en ~ 50% overlapning mellem hver anden analyse (figur 4C). Et medium CV på 21,8% blev bestemt til kvantificering af phosphopeptider, hvilket tyder på en acceptabel kvantitativ reproducerbarhed ved anvendelse af denne protokol (figur 4D).
Figur 1: Skematisk arbejdsgang anvendt til isolering af ekstracellulær vesikel (EV) i urinen og downstream-analyser. EV'er isoleres fra urinprøver gennem den ekstracellulære vesikler total genopretning og oprensning (EVtrap) tilgang, og de isolerede EV'er udsættes direkte for western blotting analyse. Til LC-MS/MS-analyse ekstraheres proteiner fra elbiler og fordøjes til peptider. Peptidprøverne efter oprydningstrinnene kan bruges til proteomics-analyse eller phosphoproteomics-analyse efter phosphopeptidberigelse. Både proteomics og phosphoproteomics prøver analyseres af LC-MS / MS. Identifikation og kvantificering udføres derefter ved hjælp af data independent acquisition (DIA) workflow metode. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering af isolerede elbiler ved western blotting. (A) Påvisning af EV-markør CD9 fra 0,1 ml direkte urinprøve (n = 1), EV'er isoleret ved hjælp af differentiel centrifugering (DUC) tilgang (n = 3) og EV'er isoleret ved hjælp af EVtrap-tilgang (n = 3). (B) Kvantificering af western blotting-signaler i (A) præsenteres som den procentvise genfinding i forhold til den direkte urinprøve (5 gange intensitet = 100%). For DUC- og EVtrap-prøverne viser søjlediagrammet gennemsnitsintensiteterne og standardafvigelserne (repræsenteret ved fejlbjælker) fra de tredobbelte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Proteomics analyse af isolerede EV'er . (A) Det samlede antal identificerede unikke proteiner og peptider i tre eksemplarer. (B) Venn-diagram, der viser overlapningen i identificerede unikke proteiner mellem replikater. (C) Antallet af identificerede unikke proteiner svarende til de 100 bedste EV-markører i ExoCarta-databasen. D) Tæthedsplot, der viser fordelingen af variationskoefficienten (CV) til proteinkvantificering. Medianværdien CV fremhæves med en rød stiplet linje. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Phosphoproteomics analyse af isolerede EV'er . (A) Det samlede antal identificerede unikke phosphoproteiner og phosphopeptider i tre eksemplarer. (B) Procentvis sammensætning af pSTY-peptider efter phosphopeptidberigelse. (C) Venn-diagram, der viser overlapningen i identificerede unikke phosphopeptider mellem replikater. D) Densitetsplot, der viser fordelingen af CV for phosphopeptidkvantificering. Medianværdien CV fremhæves med en rød stiplet linje. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv EV-isolering er en væsentlig forudsætning for at detektere proteiner og phosphoproteiner med lav overflod i elbiler. På trods af udviklingen af adskillige metoder til at opfylde dette behov lider flertallet stadig af begrænsninger som dårlig genopretning eller lav reproducerbarhed, hvilket hæmmer deres anvendelse i store undersøgelser og rutinemæssige kliniske indstillinger. DUC betragtes generelt som den mest almindelige metode til EV-isolering, og de ekstra vasketrin anvendes normalt for at hjælpe med at øge renheden af mål-EV'er27,28. Denne procedure fører til en mere kedelig og tidskrævende DUC-proces (> 6 timer). Desuden er lavt EV-genvindingsudbytte efter DUC blevet rapporteret af flere undersøgelser,29,30 og vist i resultaterne i figur 2. Til sammenligning tilbyder EVtrap effektiv EV-isolering (< 1 time) og et højt genvindingsudbytte (figur 2). Især markerer den vellykkede anvendelse af denne arbejdsgang et afgørende fremskridt for identifikationen af signifikante EV-markører for forskellige sygdomme og kræftformer 19,21,22 EVtrap er imidlertid ikke i stand til at isolere specifikke underpopulationer af EV'er, såsom mikrovesikler eller exosomer, da den fanger hele EV-populationen.
I denne protokol brugte vi 2% og 98% af peptidprøven til proteomics og phosphoproteomics analyser. Da EV'erne isoleret fra 10 ml urin med EVtrap typisk giver 100-200 μg total protein, er 98% af peptiderne efter fordøjelse og oprydning tilstrækkelige til phosphopeptidberigelse. Hvis der kræves et mærkningstrin, såsom tandem mass tag (TMT) mærkning, til kvantitativ MS-analyse, kan peptidkoncentrationsmåling efter afsaltningstrinnet udføres for at normalisere peptidmængden og forbedre nøjagtigheden af kvantificering31.
Mens denne protokol primært fremhæver brugen af EVtrap til isolering af urin-EV'er, er det bemærkelsesværdigt at nævne, at alsidigheden af denne tilgang er blevet demonstreret ved behandling af forskellige prøvetyper32,33,34. Baseret på tidligere resultater var betingelsen anvendt i denne protokol gældende for at isolere EV'er fra cellekulturmedier. Til isolering af celleudskillede EV'er dyrkes cellerne under føtale bovin serum (FBS)-fri eller EV-depleterede FBS-betingelser for at forhindre samtidig isolering af overdreven FBS-afledte EV'er med celleudskillede EV'er, hvilket vil underminere pålideligheden af resultaterne35. Derudover kan de isolerede EV'er fra andre prøvetyper karakteriseres ved western blotting-analyse ved hjælp af flere almindelige EV-markører, herunder CD9, CD63, CD81, tumorfølsomhedsgen 101-protein (TSG101) og ALG-2-interagerende protein X (ALIX)36.
For at øge dækningen og forbedre kvantificeringen i MS-analyse er opbygning af et projektspecifikt bibliotek til søgning i DIA-data en alternativ mulighed. På grund af kompleksiteten af de spektre, der produceres i DIA-tilstand, er et spektralbibliotek, der indeholder en samling referencespektre, gavnligt for at øge identifikationstilliden og forbedre dækningen. Spektralbiblioteker af høj kvalitet kan genereres ved at udføre DDA-analyse på de samme prøver eller præfraktionerede prøver37. Biblioteket kan også bruges til at bestemme optimale vinduer til dia-PASEF og yderligere forbedre identifikation38.
Samlet set giver den præsenterede protokol en enkel og effektiv metode til isolering af elbiler fra urinprøver til proteomiske og phosphoproteomiske analyser. Ved at implementere denne protokol forventer vi forbedret påvisning af EV-proteiner og phosphoproteiner med lavt rigelige tal som biomarkører til tidlig sygdomsdetektion og langsgående overvågning. Desuden har forskere den store mulighed for at fremme EV-forskning og bidrage til bedre diagnostiske og terapeutiske strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer en konkurrerende økonomisk interesse. Anton Iliuk og W. Andy Tao er medstiftere af Tymora Analytical Operations, som udviklede EVtrap-perler og kommercialiserede PolyMAC-phosphopeptidberigelsessæt.
Acknowledgments
Dette arbejde er delvist finansieret af NIH-tilskud 3RF1AG064250 og R44CA239845.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A.
- Singh, V., et al.
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R.
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
