Summary
Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) uit biovloeistoffen hebben de laatste tijd veel aandacht gekregen op het gebied van vloeibare biopsie. Ze worden vrijgegeven door bijna elk type cel, bieden een real-time momentopname van gastheercellen en bevatten een schat aan moleculaire informatie, waaronder eiwitten, met name die met posttranslationele modificaties (PTM's) zoals fosforylering, als de belangrijkste speler van cellulaire functies en het begin en de progressie van de ziekte. De isolatie van EV's uit biovloeistoffen blijft echter een uitdaging vanwege de lage opbrengsten en onzuiverheden van de huidige EV-isolatiemethoden, waardoor de stroomafwaartse analyse van EV-lading, zoals EV-fosfoproteïnen, moeilijk wordt. Hier beschrijven we een snelle en effectieve EV-isolatiemethode op basis van gefunctionaliseerde magnetische kralen voor EV-isolatie uit biovloeistoffen zoals menselijke urine en stroomafwaartse proteomics- en fosfoproteomics-analyse na EV-isolatie. Het protocol maakte een hoog terugwinningsrendement van urinaire EV's en gevoelige profielen van EV-proteoom en fosfoproteoom mogelijk. Verder komen hier ook de veelzijdigheid van dit protocol en relevante technische overwegingen aan bod.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraaningekapselde nanodeeltjes die door alle soorten cellen worden uitgescheiden en aanwezig zijn in biovloeistoffen zoals bloed, urine, speeksel, enz.1,2,3,4. EV's vervoeren een lading van diverse bioactieve moleculen die de fysiologische en pathologische toestand van hun gastheercellen weerspiegelen en daarom fungeren als cruciale factoren in ziekteprogressie 4,5,6. Bovendien hebben uitgebreide studies aangetoond dat op EV gebaseerde ziektemarkers kunnen worden geïdentificeerd voorafgaand aan het begin van de symptomen of de fysiologische detectie van tumoren 5,6,7.
Fosforylering fungeert als een belangrijk mechanisme in cellulaire signalering en regulatie. Daarom bieden fosfoproteïnen een waardevolle bron voor de ontdekking van biomarkers, aangezien afwijkende fosforyleringsgebeurtenissen geassocieerd zijn met ontregelde cellulaire signaalroutes en de ontwikkeling van metastatische ziekten zoals kanker 8,9,10. Hoewel het profileren van de fosforyleringsdynamiek de identificatie van ziektespecifieke fosfoproteïnesignaturen als potentiële biomarkers mogelijk maakt, vormen de lage abundantie en dynamische aard van fosfoproteïnen grote uitdagingen bij de ontwikkeling van fosfoproteïnen als biomarkers11,12. Met name de laag-overvloedige fosfoproteïnen die zijn ingekapseld in EV's worden beschermd tegen externe enzymatische vertering in de extracellulaire omgeving8. Bijgevolg bieden EV's en van EV afgeleide fosfoproteïnen een ideale bron voor de ontdekking van biomarkers bij de vroege detectie van kanker en andere ziekten.
Hoewel analyse van eiwitfosforylering in EV's een waardevolle bron biedt voor het begrijpen van kankersignalering en ziektediagnose in een vroeg stadium, vormt het gebrek aan efficiënte EV-isolatiemethoden een grote barrière. EV-isolatie wordt gewoonlijk bereikt door differentiële ultracentrifugatie (DUC)13. Deze methode is echter tijdrovend en niet geschikt voor klinische implicaties vanwege de lage doorvoer en slechte reproduceerbaarheid13,14. Alternatieve EV-isolatiebenaderingen, zoals polymeer-geïnduceerde precipitatie15, worden beperkt door een lage specificiteit als gevolg van co-precipitatie van niet-EV-eiwitten. Op affiniteit gebaseerde benaderingen, waaronder op antilichamen gebaseerde affiniteitsvangst16 en affiniteitsfiltratie17, bieden een verbeterde specificiteit, maar zijn beperkt tot een relatief laag herstelpercentage vanwege het kleine volume.
Om de problemen bij het onderzoeken van de dynamiek van fosfoproteïnen in EV's aan te pakken, heeft onze groep een extracellulaire blaasjes total recovery and purification (EVtrap)-techniek ontwikkeld op basis van chemische affiniteit om EV's op te vangen op gefunctionaliseerde magnetische kralen18. Eerdere resultaten hebben aangetoond dat deze EV-isolatiemethode op basis van magnetische parels zeer effectief is in het isoleren van EV's uit een breed scala aan biovloeistofmonsters en in staat is om een veel hogere EV-opbrengst te bereiken terwijl verontreiniging wordt geminimaliseerd in vergelijking met DUC en andere bestaande isolatiemethoden18,19. We hebben met succes gebruik gemaakt van EVtrap en een op titanium gebaseerde fosfopeptideverrijkingsmethode die is ontwikkeld door onze groep20 om het fosfoproteoom van EV's afgeleid van diverse biovloeistoffen te profileren en om potentiële fosfoproteïne-biomarkers voor verschillende ziekten te detecteren 19,21,22.
Hier presenteren we een protocol op basis van EVtrap voor het isoleren van circulerende EV's. Het protocol richt zich op de urinaire EV's. We demonstreren ook de karakterisering van geïsoleerde EV's met behulp van western blotting. Vervolgens beschrijven we de monstervoorbereiding en de verwerving van massaspectrometrie (MS) voor zowel proteomics- als fosfoproteomics-analyses. Dit protocol biedt een efficiënte en reproduceerbare workflow voor het profileren van het urinaire EV-proteoom en fosfoproteoom, wat verdere studies naar EV's en hun klinische toepassingen zal vergemakkelijken23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle urinemonsters werden verzameld bij gezonde personen na geïnformeerde toestemming. De experimenten voldeden aan alle ethische normen met betrekking tot menselijke monsters en aan de richtlijnen van het Purdue University Human Research Protection Program.
1. Monstername
- Centrifugeer 12 ml urinemonster in een conische centrifugebuis van 15 ml gedurende 10 minuten bij 2.500 x g, 4 °C om celresten en grote apoptotische lichamen te verwijderen.
- Breng 10 ml van het supernatans over in een nieuwe buis van 15 ml en ga verder met EV-isolatie.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de monsters kunnen bij gebruik bij -80 °C worden bewaard en bij 37 °C worden ontdooid.
2. EV-isolatie met behulp van de EVtrap-aanpak
- Voeg 0,5 ml laadbuffer (verhouding 1:10 v/v) en 100 μl EVtrap-parelslurry (verhouding 1:50 v/v) toe aan het monster volgens de instructies van de fabrikant.
- Incubeer het monster door middel van end-over-end rotatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Pelleteer het monster door de conische buis van 15 ml op een magnetisch scheidingsrek te plaatsen. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de korrels in 1 ml wasbuffer en breng de suspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Pipette voorzichtig om de EV-gebonden kralen opnieuw te suspenderen.
- Plaats de buis op een magneetseparatorrek van 1,5 ml microcentrifugebuis en zuig het supernatant op. Gebruik een P200-pipet om het supernatans volledig op te zuigen en te voorkomen dat de korrels worden opgezogen.
- Was de kralen met 1 ml wasbuffer. Voeg de buffer direct na het opzuigen van het supernatans toe om uitdroging van de korrels te voorkomen.
- Was de korrels 2x met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op kamertemperatuur.
- Incubeer de korrels met 100 μL vers bereide 100 mM triethylamine gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en vang de geëlueerde oplossing met EV's op met behulp van een 1,5 ml microcentrifugebuis magnetisch scheidingsrek.
OPMERKING: Om 1 ml triethylamine van 100 mM te bereiden, verdunt u 14 μL triethylamine-oplossing in water. - Herhaal stap 2.8 en combineer de geëlueerde oplossingen. Droog het eluaat met behulp van een vacuümcentrifugeconcentrator bij 4 °C.
OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd. Gedroogde EV-monsters kunnen enkele maanden bij -80 °C worden bewaard zonder nadelige gevolgen voor de volgende stappen of de resultaten.
3. Karakterisering van EV's door western blotting
- Resuspendeer 5% van het gedroogde EV-monster (overeenkomend met 0,5 ml van het urinemonster) in 20 μL 1x lithiumdodecylsulfaat (LDS)-monsterbuffer met 10 mM dithiothreitol (DTT).
OPMERKING: EV's van 0,5 ml urine zijn voldoende voor het detecteren van CD9-signaal (een EV-marker24) in western blotting. - Kook het monster gedurende 5 minuten bij 95 °C. Laad het monster op een polyacrylamidegel en voer elektroforese en immunoblotting uit volgens standaardprotocollen25.
- Nadat u de eiwitten hebt overgebracht naar een polyvinylideenfluoride (PVDF)-membraan met lage fluorescentie, blokkeert u het membraan met 1% runderserumalbumine (BSA) in tris-gebufferde zoutoplossing tween-20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Om 1 L TBST-buffer te bereiden, voegt u 19 mM Tris-base, 137 mM NaCl en 1 ml Tween-20 toe; pas de pH aan tot 7,4 met behulp van HCl.
- Incubeer membraan met anti-CD9-antilichaam van konijnen in een verhouding van 1:5.000 in 1% BSA in TBST bij 4 °C 's nachts of gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was het membraan 3x gedurende 5 minuten met TBST. Incubeer het membraan met anti-konijn IgG, HRP-gekoppeld secundair antilichaam in een verhouding van 1:5000 in 1% BSA in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was het membraan 3x gedurende 5 minuten met TBST. Voeg de commercieel verkregen verbeterde chemiluminescentie (ECL) substraten (1:1 verhouding) toe aan het membraan en detecteer signalen op een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem.
4. Monstervoorbereiding voor proteomics- en fosfoproteomics-analyse
- Bereid verse lysisbuffer met 12 mM natriumdeoxycholaat (SDC), 12 mM natriumlauroylsarcosinaat (SLS), 100 mM triethylammoniumbicarbonaatbuffer (TEAB), 10 mM tris-(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP), 40 mM chlooracetamide (CAA) en 1x fosfataseremmercocktails.
OPMERKING: De voorraadoplossingen staan vermeld in de beschrijving van de Materiaaltabel. De lysisbuffer wordt bereid door de voorraadoplossingen toe te voegen om de gewenste concentraties te bereiken, afhankelijk van het benodigde volume. - Los het gedroogde EV-monster op in 100 μL lysisbuffer en verwarm het monster gedurende 10 minuten bij 95 °C met schudden bij 1.100 rpm.
- Na afkoeling van het monster tot kamertemperatuur, verdunt u het vijfvoudig door 400 μL 50 mM TEAB toe te voegen.
- Meet de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-testkit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik de lysisbuffer vijfvoudig verdund met 50 mM TEAB als blanco.
- Voeg het mengsel trypsine/Lys-C toe in een enzym-eiwitverhouding van 1:50 w/w en incubeer het monster een nacht bij 37 °C onder schudden bij 1.100 tpm.
- Voeg 50 μL 10% trifluorazijnzuur (TFA) toe om het monster aan te zuren.
- Voeg 600 μL ethylacetaat toe aan de monsters en draai het mengsel gedurende 2 minuten.
- Centrifugeer het monster gedurende 3 minuten op 20.000 x g en verwijder de bovenste laag (organische laag). Voorkom dat de interface wordt verstoord tijdens het opzuigen.
- Herhaal stap 4.7-4.8. Droog de waterige fase met behulp van een vacuümcentrifugeconcentrator.
- Resuspendeer het gedroogde monster in 200 μL 0,1% TFA om peptiden aan te zuren en ontzout het monster met behulp van een C18-ontzouttip volgens de instructies van de fabrikant. Conditioneer de tip met 200 μL 0,1% TFA in 80% acetonitril, gevolgd door 2x met 200 μL 0,1% TFA. Laad het aangezuurde peptidemonster in de tip en was de tip vervolgens 3x met 200 μL 0,1% TFA. Elute de peptiden met 200 μL 0,1% TFA in 80% acetonitril.
- Droog het eluaat met behulp van een vacuümcentrifugeconcentrator. Droog 2% van het peptidemonster (overeenkomend met 0,2 ml van het urinemonster) apart voor proteomics-analyse. Gebruik de rest (98%) van het monster voor fosfoproteomics-analyse.
- Verrijk fosfopeptiden uit het monster met behulp van een fosfopeptideverrijkingskit volgens de instructies van de fabrikant. Voer de hieronder beschreven stappen uit voor verrijking.
- Resuspendeer het gedroogde monster in 200 μl laadbuffer. Voeg 50 μL van de korrels toe aan het monster en schud krachtig gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Laad het monster met de parels tot aan de gefritte punt en centrifugeer gedurende 1 minuut op 100 x g.
- Was de punt met 200 μL laadbuffer, gevolgd door wasbuffer 1 en vervolgens wasbuffer 2. Voer alle drie de wasstappen uit door één keer gedurende 2 minuten te centrifugeren op 20 x g en één keer gedurende 1 minuut op 100 x g.
- Doe de punt met kralen in een nieuw buisje om de geëlueerde fosfopeptiden op te vangen. Voeg 50 μL elutiebuffer toe aan de tip en centrifugeer eenmaal gedurende 2 minuten op 20 x g. Voeg nog eens 50 μL elutiebuffer toe aan de tip en centrifugeer eenmaal gedurende 2 minuten op 20 x g. Centrifugeer nog een laatste keer gedurende 1 minuut op 100 x g.
- Droog de geëlueerde fosfopeptiden met behulp van een vacuümcentrifugeconcentrator.
5. LC-MS/MS-analyse
OPMERKING: Er kunnen verschillende LC-MS/MS-systemen/instellingen en methoden voor gegevensverzameling worden gebruikt, zoals gegevensafhankelijke acquisitie (DDA).
- Resuspendeer de gedroogde proteoom/fosfoproteoommonsters in 0,1% mierenzuur (oplosmiddel A) en laad de monsters volgens de instructies van de fabrikant.
- Injecteer de monsters in gevangen ion-mobiliteit time-of-flight MS via het vloeistofchromatografiesysteem (LC) en gebruik de vooraf ingestelde gestandaardiseerde Whisper 40 samples per dag-methode. Peptiden worden gescheiden op een C18-kolom van 15 cm (75 μm binnendiameter, 1,9 μm deeltjesgrootte) zoals vermeld in de materiaaltabel.
- Voor proteomics-analyse worden gegevens verzameld met behulp van een parallelle accumulatie-seriële fragmentatie in combinatie met data-onafhankelijke acquisitie (dia-PASEF) acquisitiemethode met een massabereik per helling van 300-1200 m/z en van 0,6-1,50 1/K0 met een cyclustijd van 1,38 s.
- Voor de analyse van fosfoproteomica worden gegevens verzameld met behulp van een dia-PASEF-acquisitiemethode met een massabereik per helling van 400-1550 m/z en 0,6-1,50 1/K0 met een cyclustijd van 1,38 s.
- Laad de RAW-bestanden in proteomics-software en voer signaalextractie, identificatie en kwantificering uit met behulp van een bibliotheekvrije gegevensonafhankelijke acquisitieworkflow.
- Gebruik voor zoekinstellingen de Homo sapiens-database , specifieke digestietypen met trypsine/P-enzymen, 7 minimale peptidelengte, 52 maximale peptidelengte, twee gemiste splitsing, carbamidomethyl bij cysteïne als vaste modificatie, acetyleiwit N-term, oxidatie bij methionine en fosforylering bij serine, threonine en tyrosine (voor fosfoproteomics-analyse) als variabele modificaties en 5 als maximale variabele modificaties. Stel de FDR in bij PSM, peptide en eiwitgroep op 0.01.
OPMERKING: In dit protocol is gebruik gemaakt van Spectronaut-software. Andere DIA-software voor het zoeken naar gegevens, zoals DIA-NN en PEAKS, wordt ook vaak gebruikt. Als gegevens in DDA-modus zijn verkregen, zijn software zoals MaxQuant en Proteome Discoverer van toepassing.
- Gebruik voor zoekinstellingen de Homo sapiens-database , specifieke digestietypen met trypsine/P-enzymen, 7 minimale peptidelengte, 52 maximale peptidelengte, twee gemiste splitsing, carbamidomethyl bij cysteïne als vaste modificatie, acetyleiwit N-term, oxidatie bij methionine en fosforylering bij serine, threonine en tyrosine (voor fosfoproteomics-analyse) als variabele modificaties en 5 als maximale variabele modificaties. Stel de FDR in bij PSM, peptide en eiwitgroep op 0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol demonstreert een uitgebreide workflow van de isolatie van EV's tot stroomafwaartse proteomics- en fosfoproteomics-analyses (Figuur 1). De drievoudige urinemonsters werden onderworpen aan EV-isolatie. De geïsoleerde EV's werden gekenmerkt door western blotting en vervolgens verwerkt voor op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-monstervoorbereiding, waaronder eiwitextractie, enzymatische vertering en het opruimen van peptiden. Voor de analyse van fosfoproteomics werden de fosfopeptiden verder verrijkt op basis van oplosbare nanopolymeren met metaalionen. Zowel peptide- als fosfopeptidemonsters werden geanalyseerd door middel van massaspectrometrie met ionenmobiliteit met hoge resolutie in gegevensonafhankelijke modus. De resulterende onbewerkte bestanden werden doorzocht in de Homo sapiens-database en er werd een bibliotheekvrije gegevensonafhankelijke acquisitieworkflow uitgevoerd voor identificatie en kwantificering op MS2-niveau.
Om de geïsoleerde EV's te karakteriseren en de terugwinningsopbrengst te schatten, laadden we eerst een equivalent van 0,5 ml urine met EV's op de gel voor western blotting om de EV-marker CD9 te detecteren (Figuur 2A). Daarnaast hebben we de EV's geïsoleerd uit hetzelfde volume urine opgenomen met behulp van de meest gebruikte methode voor EV-isolatie, differentiële ultracentrifugatie (DUC), ter vergelijking. De resultaten toonden aan dat EVtrap in staat was om veel hogere CD9-signalen te produceren in vergelijking met DUC, wat wijst op een effectieve opvang van EV's door de kralen. Verdere kwantitatieve waarden voor elk CD9-bandsignaal toonden aan dat EVtrap een herstelrendement van ~99% bereikte in vergelijking met de 5-voudige intensiteit van de directe urinecontrole, terwijl DUC slechts ~1,5% van de EV's herstelde (Figuur 2B).
Door 2% van elk monster op de LC-MS/MS te laden voor proteomische profilering, identificeerden we > 11.000 unieke peptiden van ~2.200 unieke eiwitten (Figuur 3A), wat aangeeft dat deze workflow een diepgaande dekking van EV-proteoom biedt. Er werd een hoge mate van overlap waargenomen in eiwitidentificaties tussen monsters, waarbij 72% van de unieke eiwitten consistent werd geïdentificeerd in alle drie de replicaten (Figuur 3B). Bovendien vergeleken we de identificatieresultaten met de ExoCarta-database (Figuur 3C)26. Met name uit de top 100 EV-markers en -eiwitten hebben we met succes ~90 van deze EV-eiwitten geïdentificeerd, wat wijst op een onbevooroordeelde en volledige profilering van EV-eiwitten door middel van deze proteomics-analyse. Om de kwantitatieve precisie te beoordelen, evalueerden we verder de verdeling van variatiecoëfficiënten (CV) voor de resultaten van de eiwitkwantificering (Figuur 3D). Een laag gemiddeld CV (5,7%) duidt op de hoge reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de procedure, inclusief EV-isolatie, monstervoorbereiding en MS-detectie.
Voor de fosfoproteomics-analyse gebruikten we 98% van elk peptidemonster voor de fosfopeptideverrijking en identificeerden we ~800 unieke fosfopeptiden die overeenkomen met ~350 unieke fosfoproteïnen (Figuur 4A). De verrijking leverde gemiddeld 72% fosfoserine (pS) peptiden, 22% fosfothreonine (pT) en 6% fosfotyrosine (pY) peptiden op (Figuur 4B). Wat betreft de reproduceerbaarheid van de identificatie van de drie replicaten, werd 42% van de fosfopeptiden geïdentificeerd door alle drie de analyses, en er was een overlap van ~50% tussen elke twee analyses (Figuur 4C). Voor de kwantificering van fosfopeptiden werd een gemiddeld CV van 21,8% bepaald, wat wijst op een acceptabele kwantitatieve reproduceerbaarheid met behulp van dit protocol (Figuur 4D).
Figuur 1: Schematische workflow gebruikt voor isolatie van extracellulaire blaasjes (EV) in de urine en stroomafwaartse analyses. EV's worden geïsoleerd uit urinemonsters via de extracellulaire vesikels total recovery and purification (EVtrap)-benadering, en de geïsoleerde EV's worden direct onderworpen aan western blotting-analyse. Voor LC-MS/MS-analyse worden eiwitten geëxtraheerd uit EV's en verteerd tot peptiden. De peptidemonsters na de opruimstappen kunnen worden gebruikt voor proteomics-analyse of fosfoproteomics-analyse na fosfopeptideverrijking. Zowel proteomics- als fosfoproteomics-monsters worden geanalyseerd door LC-MS/MS. Identificatie en kwantificering worden vervolgens uitgevoerd met behulp van de DIA-workflowmethode (Data Independent Acquisition). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van geïsoleerde EV's door middel van western blotting. (A) Detectie van EV-marker CD9 uit 0,1 ml direct urinemonster (n=1), EV's geïsoleerd met behulp van differentiële centrifugatie (DUC)-benadering (n=3) en EV's geïsoleerd met behulp van EVtrap-benadering (n=3). (B) Kwantificering van western blotting-signalen in (A) wordt weergegeven als het percentage herstel ten opzichte van het directe urinemonster (5-voudige intensiteit = 100%). Voor de DUC- en EVtrap-monsters worden in de staafdiagram de gemiddelde intensiteiten en standaarddeviaties (weergegeven door foutbalken) van de drievouden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Proteomics-analyse van geïsoleerde EV's . (A) Het totale aantal geïdentificeerde unieke eiwitten en peptiden in drievoud. (B) Venndiagram met de overlap in geïdentificeerde unieke eiwitten tussen replicaten. (C) Het aantal geïdentificeerde unieke eiwitten dat overeenkomt met de top 100 EV-markers in de ExoCarta-database. (D) Dichtheidsgrafiek met de verdeling van de variatiecoëfficiënt (CV) voor de kwantificering van eiwitten. De mediane CV-waarde wordt gemarkeerd met een rode stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Fosfoproteomics-analyse van geïsoleerde EV's. (A) Het totale aantal geïdentificeerde unieke fosfoproteïnen en fosfopeptiden in drievoud. (B) Procentuele samenstelling van pSTAR-peptiden na verrijking met fosfopeptiden. (C) Venndiagram met de overlap in geïdentificeerde unieke fosfopeptiden tussen replicaten. (D) Dichtheidsgrafiek met de verdeling van CV voor de kwantificering van fosfopeptiden. De mediane CV-waarde wordt gemarkeerd met een rode stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effectieve EV-isolatie is een essentiële voorwaarde voor het detecteren van laagfrequente eiwitten en fosfoproteïnen in EV's. Ondanks de ontwikkeling van talrijke methoden om aan deze behoefte te voldoen, heeft de meerderheid nog steeds last van beperkingen zoals slecht herstel of lage reproduceerbaarheid, die het gebruik ervan in grootschalige onderzoeken en routinematige klinische omgevingen belemmeren. DUC wordt over het algemeen beschouwd als de meest gebruikelijke methode voor EV-isolatie, en de extra wasstappen worden normaal gesproken toegepast om de zuiverheid van doel-EV's te helpen verhogen27,28. Deze procedure leidt tot een vervelender en tijdrovender DUC-proces (> 6 uur). Bovendien is een lage EV-terugwinningsopbrengst na DUC gerapporteerd door meerdere studies,29,30 en weergegeven in de resultaten in figuur 2. Ter vergelijking: EVtrap biedt efficiënte EV-isolatie (< 1 uur) en een hoog terugwinningsrendement (Figuur 2). Met name de succesvolle toepassing van deze workflow markeert een cruciale vooruitgang voor de identificatie van significante EV-markers voor verschillende ziekten en kankers 19,21,22 EVtrap is echter niet in staat om specifieke subpopulaties van EV's, zoals microvesikels of exosomen, te isoleren, omdat het de hele EV-populatie vastlegt.
In dit protocol gebruikten we 2% en 98% van het peptidemonster voor proteomics- en fosfoproteomics-analyses. Aangezien de EV's die door EVtrap uit 10 ml urine worden geïsoleerd, doorgaans 100-200 μg totale eiwitten opleveren, is 98% van de peptiden na vertering en opruiming voldoende voor de fosfopeptideverrijking. Als een etiketteringsstap, zoals tandem mass tag (TMT)-etikettering, vereist is voor kwantitatieve MS-analyse, kan de meting van de peptideconcentratie na de ontziltingsstap worden uitgevoerd om de hoeveelheid peptide te normaliseren en de nauwkeurigheid van de kwantificering te verbeteren31.
Hoewel dit protocol in de eerste plaats het gebruik van EVtrap voor het isoleren van urine-EV's benadrukt, is het opmerkelijk om te vermelden dat de veelzijdigheid van deze aanpak is aangetoond bij het verwerken van verschillende soorten monsters32,33,34. Op basis van eerdere resultaten was de voorwaarde die in dit protocol werd gebruikt, van toepassing op het isoleren van EV's uit celkweekmedia. Voor de isolatie van door cellen uitgescheiden EV's worden de cellen gekweekt onder foetaal runderserum (FBS)-vrije of EV-verarmde FBS-omstandigheden om gelijktijdige isolatie van overmatige FBS-afgeleide EV's met door cellen uitgescheiden EV's te voorkomen, wat de betrouwbaarheid van de resultaten zal ondermijnen35. Bovendien kunnen de geïsoleerde EV's van andere monstertypes worden gekarakteriseerd door western blotting-analyse met behulp van verschillende veel voorkomende EV-markers, waaronder CD9, CD63, CD81, tumorgevoeligheidsgen 101-eiwit (TSG101) en ALG-2-interagerend eiwit X (ALIX)36.
Om de dekking te vergroten en de kwantificering in MS-analyse te verbeteren, is het bouwen van een projectspecifieke bibliotheek voor het doorzoeken van DIA-gegevens een alternatieve optie. Vanwege de complexiteit van de spectra die in de DIA-modus worden geproduceerd, is een spectrale bibliotheek met een verzameling referentiespectra gunstig voor het vergroten van het identificatievertrouwen en het verbeteren van de dekking. Spectrale bibliotheken van hoge kwaliteit kunnen worden gegenereerd door DDA-analyse uit te voeren op dezelfde monsters of voorgefractioneerde monsters37. De bibliotheek kan ook worden gebruikt om optimale vensters voor dia-PASEF te bepalen en de identificatie verder te verbeteren38.
Alles bij elkaar biedt het gepresenteerde protocol een eenvoudige en effectieve methode voor het isoleren van EV's uit urinemonsters voor proteomics- en fosfoproteomics-analyses. Door dit protocol te implementeren, verwachten we een verbeterde detectie van laagfrequente EV-eiwitten en fosfoproteïnen als biomarkers voor ziektedetectie in een vroeg stadium en longitudinale monitoring. Bovendien hebben onderzoekers de geweldige kans om het gebied van EV-onderzoek vooruit te helpen en bij te dragen aan betere diagnostische en therapeutische strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren een concurrerend financieel belang. Anton Iliuk en W. Andy Tao zijn mede-oprichters van Tymora Analytical Operations, dat EVtrap-kralen heeft ontwikkeld en een PolyMAC-fosfopeptideverrijkingskit op de markt heeft gebracht.
Acknowledgments
Dit werk is gedeeltelijk gefinancierd door NIH-subsidies 3RF1AG064250 en R44CA239845.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A.
- Singh, V., et al.
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R.
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
