Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

בידוד מבוסס זיקה כימית של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים לצורך פרוטאומיקה וניתוח פוספופרוטאומיקה

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65844
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מפורטים לבידוד יעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות בשתן באמצעות חרוזים מגנטיים פונקציונליים. יתר על כן, הוא מקיף ניתוחים מאוחרים יותר, כולל כתמים מערביים, פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מנוזלים ביולוגיים זכו לאחרונה לתשומת לב משמעותית בתחום הביופסיה הנוזלית. הם משוחררים כמעט על ידי כל סוג של תא, מספקים תמונת מצב בזמן אמת של תאים מארחים ומכילים שפע של מידע מולקולרי, כולל חלבונים, במיוחד אלה עם שינויים לאחר תרגום (PTM) כגון זרחון, כשחקן העיקרי של תפקודי התא והתפרצות המחלה והתקדמותה. עם זאת, הבידוד של כלי רכב חשמליים מנוזלים ביולוגיים נותר מאתגר בשל תפוקות נמוכות וזיהומים משיטות הבידוד הנוכחיות של כלי רכב חשמליים, מה שהופך את הניתוח במורד הזרם של מטעני EV, כגון פוספופרוטאינים של EV, לקשה. במאמר זה אנו מתארים שיטת בידוד מהירה ויעילה של כלי רכב חשמליים המבוססת על חרוזים מגנטיים פונקציונליים לבידוד EV מנוזלים ביולוגיים כגון שתן אנושי וניתוח פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה במורד הזרם לאחר בידוד EV. הפרוטוקול איפשר תשואת התאוששות גבוהה של כלי רכב חשמליים בשתן ופרופילים רגישים של פרוטאום EV ופוספופרוטום. יתר על כן, הרבגוניות של פרוטוקול זה ושיקולים טכניים רלוונטיים מטופלים גם כאן.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים עטופים בקרום המופרשים על ידי כל סוגי התאים ונמצאים בנוזלים ביולוגיים כגון דם, שתן, רוק וכו'.1,2,3,4. כלי רכב חשמליים נושאים מטען של מולקולות ביו-אקטיביות מגוונות המשקפות את המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התאים המארחים שלהם, ולכן מתפקדות כגורמים מכריעים בהתקדמות המחלה 4,5,6. יתר על כן, מחקרים מקיפים קבעו כי ניתן לזהות סמני מחלה מבוססי EV לפני הופעת הסימפטומים או גילוי פיזיולוגי של גידולים 5,6,7.

זרחן פועל כמנגנון מפתח באיתות ובוויסות תאי. לכן, פוספופרוטאינים מספקים מקור רב ערך לגילוי סמנים ביולוגיים מכיוון שאירועי זרחן חריגים קשורים למסלולי איתות תאיים לא מווסתים ולהתפתחות מחלות גרורתיות כגון סרטן 8,9,10. למרות שיצירת פרופיל של דינמיקת זרחן מאפשרת זיהוי של חתימות פוספופרוטאין ספציפיות למחלה כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים, השפע הנמוך והאופי הדינמי של פוספופרוטאינים מציבים אתגרים גדולים בפיתוח פוספופרוטאינים כסמנים ביולוגיים11,12. יש לציין כי הפוספופרוטאינים בעלי השפע הנמוך הכלולים ברכב חשמלי מוגנים מפני עיכול אנזימטי חיצוני בסביבה חוץ-תאית8. כתוצאה מכך, כלי רכב חשמליים ופוספופרוטאינים שמקורם ברכב חשמלי מציעים מקור אידיאלי לגילוי סמנים ביולוגיים בגילוי מוקדם של סרטן ומחלות אחרות.

למרות שניתוח של זרחן חלבונים בכלי רכב חשמליים מציע משאב רב ערך להבנת איתות סרטן ואבחון מחלות בשלב מוקדם, היעדר שיטות יעילות לבידוד רכב חשמלי מהווה חסם משמעותי. בידוד EV מושג בדרך כלל באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (DUC)13. עם זאת, שיטה זו גוזלת זמן ואינה מתאימה להשלכות קליניות בשל תפוקה נמוכה ויכולת שחזור ירודה13,14. גישות חלופיות לבידוד EV, כגון משקעים15 המושרים על ידי פולימרים, מוגבלות על ידי ספציפיות נמוכה עקב משקעים משותפים של חלבונים שאינם EV. גישות מבוססות זיקה, כולל לכידת זיקה מבוססת נוגדנים16 וסינון זיקה17, מציעות ספציפיות משופרת אך מוגבלות לשיעור התאוששות נמוך יחסית עקב נפח קטן.

כדי להתמודד עם הבעיות בחקר דינמיקת הפוספופרוטאינים בכלי רכב חשמליים, הקבוצה שלנו פיתחה טכניקת שחזור וטיהור כולל של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVtrap) המבוססת על זיקה כימית ללכידת כלי רכב חשמליים על גבי חרוזים מגנטיים פונקציונליים18. תוצאות קודמות הראו כי שיטת בידוד EV מבוססת חרוזים מגנטיים זו יעילה ביותר בבידוד כלי רכב חשמליים ממגוון רחב של דגימות נוזל ביולוגי ומסוגלת להשיג תפוקת EV גבוהה בהרבה תוך מזעור הזיהום בהשוואה ל- DUC ושיטות בידוד קיימות אחרות18,19. השתמשנו בהצלחה ב-EVtrap ובשיטת העשרת פוספו-פפטידים מבוססת טיטניום שפותחה על ידי קבוצה20 שלנו כדי ליצור פרופיל של פוספופרוטאום של כלי רכב חשמליים שמקורם בנוזלים ביולוגיים מגוונים ולזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים של פוספופרוטאין למחלות שונות 19,21,22.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על EVtrap לבידוד של כלי רכב חשמליים במחזור. הפרוטוקול מתמקד ברכבים חשמליים בדרכי השתן. כמו כן, אנו מדגימים אפיון של כלי רכב חשמליים מבודדים באמצעות כתם מערבי. לאחר מכן אנו מפרטים את הכנת הדגימה ורכישת ספקטרומטריית מסה (MS) הן עבור ניתוח פרוטאומיקה והן עבור ניתוח פוספופרוטאומיקה. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה וניתנת לשחזור עבור פרופיל של פרוטאום EV בשתן ופוספופרוטום, אשר יאפשר מחקרים נוספים על כלי רכב חשמליים והיישומים הקליניים שלהם23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל דגימות השתן נאספו מאנשים בריאים לאחר הסכמה מדעת. הניסויים עמדו בכל הסטנדרטים האתיים הכוללים דגימות אנושיות ותאמו את ההנחיות של תוכנית הגנת המחקר האנושי של אוניברסיטת פרדו.

1. איסוף דוגמאות

  1. צנטריפוגה 12 מ"ל של דגימת שתן בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל למשך 10 דקות ב 2,500 x גרם, 4 ° C כדי להסיר פסולת תאים וגופים אפופטוטיים גדולים.
  2. מעבירים 10 מ"ל של הסופרנאטנט לצינור חדש של 15 מ"ל וממשיכים בבידוד EV.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וניתן לאחסן את הדגימות ב -80 ° C ולהפשיר ב 37 ° C בעת השימוש.

2. בידוד EV בגישת EVtrap

  1. הוסף 0.5 מ"ל של מאגר העמסה (יחס של 1:10 v/v) ו- 100 μL של תמיסת חרוזי EVtrap (יחס של 1:50 v/v) לדגימה בהתאם להוראות היצרן.
  2. דגרו על הדגימה על ידי סיבוב מקצה לקצה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. גלולה את הדגימה על ידי הנחת צינור חרוטי 15 מ"ל על מדף מפריד מגנטי. הסר את supernatant.
  4. השהה מחדש את החרוזים ב 1 מ"ל של חיץ כביסה ולהעביר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. פיפטה עדינה להשעיה מחדש של החרוזים הקשורים לרכב חשמלי.
  5. מניחים את הצינור על מתלה מפריד מגנטי של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ושאפו את הסופרנטנט. השתמשו בפיפטת P200 כדי לשאוף לחלוטין את הסופרנאטנט ולהימנע משאיפת החרוזים.
  6. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה. מוסיפים את החיץ מיד לאחר שאיפת הסופרנאטנט כדי למנוע מהחרוזים להתייבש.
  7. שטפו את החרוזים 2x עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר.
  8. דגרו על החרוזים עם 100 מיקרוליטר של טריאתילאמין טרי 100 מילימטר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואספו את התמיסה המדוללת המכילה כלי רכב חשמליים באמצעות מתלה מפריד מגנטי של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: כדי להכין 1 מ"ל של 100 mM triethylamine, לדלל 14 μL של תמיסת triethylamine במים.
  9. חזור על שלב 2.8 ושלב את הפתרונות המדוללים. יבש את הפולט באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום ב 4 ° C.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן. ניתן לאחסן דגימות EV מיובשות בטמפרטורה של -80°C למשך מספר חודשים ללא השפעות שליליות על השלבים הבאים או על התוצאות.

3. אפיון כלי רכב חשמליים לפי כתם מערבי

  1. יש להשהות מחדש 5% מדגימת הרכב החשמלי המיובש (שווה ערך ל-0.5 מ"ל של דגימת השתן) ב-20 מיקרוליטר של מאגר דגימת ליתיום דודציל סולפט (LDS) 1x עם 10 mM dithiothreitol (DTT).
    הערה: כלי רכב חשמליים מ-0.5 מ"ל שתן מספיקים לזיהוי אות CD9 (סמן EV24) בכתמים מערביים.
  2. מרתיחים את הדגימה במשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. טען את הדגימה על ג'ל פוליאקרילאמיד ובצע אלקטרופורזה ואימונובלוטציה בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים25.
  3. לאחר העברת החלבונים לקרום פלואוריד פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) בעל פלואורסצנטיות נמוכה, חסום את הממברנה עם אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) ב-tris-buffered salt tween-20 (TBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. כדי להכין 1 ליטר של מאגר TBST, הוסף בסיס Tris של 19 mM, 137 mM NaCl ו- 1 מ"ל של Tween-20; התאם את ה- pH ל- 7.4 באמצעות HCl.
  4. דגירה על ממברנה עם נוגדן ארנב נגד CD9 ביחס של 1:5,000 ב-1% BSA ב-TBST ב-4°C למשך לילה או למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  5. שטפו את הממברנה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם TBST. לדגור על הממברנה עם נוגדן משני נגד ארנב IgG, HRP ביחס של 1:5000 ב-1% BSA ב-TBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  6. שטפו את הממברנה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם TBST. הוסף את מצעי הכימילומינסנציה המשופרת (ECL) המתקבלים באופן מסחרי (יחס של 1:1) לממברנה וזהה אותות במערכת הדמיה כימילומינסנטית.

4. הכנת דגימה לניתוח פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה

  1. הכינו חיץ ליזיס טרי המכיל 12 mM נתרן deoxycholate (SDC), 12 mM נתרן lauroyl sarcosinate (SLS), 100 mM triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB), 10 mM tris-(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP), 40 mM chloroacetamide (CAA), 1x phosphatase inhibitor קוקטיילים.
    הערה: פתרונות המלאי מפורטים בתיאור של טבלת החומרים. חיץ הליזיס מוכן על ידי הוספת תמיסות המלאי להשגת הריכוזים הרצויים בהתאם לנפח הנדרש.
  2. יש להמיס את דגימת הרכב החשמלי המיובשת ב-100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ולחמם את הדגימה למשך 10 דקות ב-95°C עם טלטול ב-1,100 סל"ד.
  3. לאחר קירור הדגימה לטמפרטורת החדר, לדלל אותה פי חמישה על ידי הוספת 400 μL של 50 mM TEAB.
  4. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת BCA בהתאם להוראות היצרן. השתמש במאגר הליזיס המדולל פי חמישה עם 50 mM TEAB כריק.
  5. הוסיפו את תערובת טריפסין/Lys-C ביחס אנזים-חלבון של 1:50 ואט/וואט ודגרו על הדגימה בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה עם ניעור ב-1,100 סל"ד.
  6. הוסף 50 μL של 10% חומצה trifluoroacetic (TFA) כדי להחמיץ את הדגימה.
  7. מוסיפים 600 μL של אתיל אצטט לדגימות ומערבלים את התערובת במשך 2 דקות.
  8. צנטריפוגה את הדגימה למשך 3 דקות ב 20,000 x גרם ולהסיר את השכבה העליונה (שכבה אורגנית). הימנע מלהפריע לממשק במהלך השאיפה.
  9. חזור על שלבים 4.7-4.8. יבש את הפאזה המימית באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום.
  10. יש להשהות מחדש את הדגימה המיובשת ב-200 μL של 0.1% TFA כדי להחמיץ-פפטידים ולהפיל את הדגימה באמצעות חוד התפלה C18 בהתאם להוראות היצרן. מצב את החוד עם 200 μL של 0.1% TFA ב 80% acetonitrile, ואחריו 2x עם 200 μL של 0.1% TFA. טען את דגימת הפפטיד החומצי לתוך הקצה ולאחר מכן שטוף את הקצה 3x עם 200 μL של 0.1% TFA. יש להקפיד על הפפטידים עם 200 μL של 0.1% TFA ב-80% אצטוניטריל.
  11. יבש את הפולט באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום. יבש 2% מדגימת הפפטיד (שווה ערך ל -0.2 מ"ל של דגימת השתן) בנפרד לניתוח פרוטאומיקה. השתמש בשאר (98%) של המדגם לניתוח פוספופרוטאומיקה.
  12. העשרת פוספופפטידים מהדגימה באמצעות ערכת העשרת פוספופפטידים בהתאם להוראות היצרן. בצע את השלבים המתוארים להלן להעשרה.
    1. השהה מחדש את הדגימה המיובשת ב 200 μL של מאגר העמסה. הוסיפו 50 מיקרוליטר של חרוזים לדגימה ונערו נמרצות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. טען את הדגימה עם החרוזים לקצה השבור ולצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 100 x גרם.
    2. שטפו את החוד עם 200 μL של חיץ העמסה, לאחר מכן חיץ כביסה 1, ולאחר מכן חיץ כביסה 2. בצע את כל שלושת שלבי הכביסה על ידי צנטריפוגה פעם למשך 2 דקות ב- 20 x g ופעם אחת למשך דקה אחת ב- 100 x g.
    3. שים את הקצה עם חרוזים לתוך צינור חדש כדי לאסוף את phosphopeptides מדולל. הוסף 50 μL של חיץ elution לקצה וצנטריפוגה פעם אחת למשך 2 דקות ב- 20 x g. הוסף עוד 50 μL של חיץ אלוציה לקצה וצנטריפוגה פעם אחת למשך 2 דקות ב- 20 x g. צנטריפוגה פעם אחת אחרונה למשך דקה אחת ב 100 x גרם.
  13. יבשו את הפוספפטידים המדוללים באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום.

5. ניתוח LC-MS/MS

הערה: ניתן להשתמש במערכות/הגדרות LC-MS/MS שונות ובשיטות איסוף נתונים, כגון רכישה תלוית נתונים (DDA).

  1. יש להשהות מחדש את דגימות הפרוטאום/פוספופרוטאום המיובשות בחומצה פורמית 0.1% (ממס A) ולהעמיס את הדגימות בהתאם להוראות היצרן.
  2. הזריקו את הדגימות לתוך טרשת נפוצה לכודה בזמן טיסה של ניידות יונים באמצעות מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית (LC) והשתמשו בשיטת Whisper 40 דגימות ליום המתוקננת שנקבעה מראש. הפפטידים מופרדים על עמוד C18 בגודל 15 ס"מ (קוטר פנימי של 75 מיקרומטר, גודל חלקיקים של 1.9 מיקרומטר) כפי שמוזכר בטבלת החומרים.
  3. לניתוח פרוטאומיקה, רכוש נתונים באמצעות פיצול מצטבר-טורי מקבילי בשילוב עם שיטת רכישה בלתי תלויה בנתונים (dia-PASEF) עם טווח מסה לכל רמפה המשתרע בין 300-1200 m/z ובין 0.6-1.50 1/K0 עם זמן מחזור של 1.38 שניות.
  4. לניתוח פוספופרוטאומיקה, קבל נתונים בשיטת רכישת dia-PASEF עם טווח מסה לכל רמפה המשתרע בין 400-1550 m/z ו- 0.6-1.50 1/K0 עם זמן מחזור של 1.38 שניות.
  5. טען את הקבצים הגולמיים לתוכנת פרוטאומיקה ובצע חילוץ, זיהוי וכימות אותות באמצעות זרימת עבודה של רכישת נתונים עצמאית ללא ספריה.
    1. להגדרות חיפוש, השתמש במסד הנתונים של הומו ספיינס , סוגי תקציר ספציפיים עם אנזימי טריפסין/P, 7 אורך פפטיד מינימלי, 52 אורך פפטיד מרבי, שני מחשופים שהוחמצו, קרבמידומתיל בציסטאין כשינוי קבוע, חלבון אצטיל מונח N, חמצון במתיונין, וזרחן בסרין, תראונין וטירוזין (לניתוח פוספופרוטאומיקה) כשינויים משתנים, ו-5 כשינויים משתנים מרביים. הגדר את FDR בקבוצת PSM, פפטיד וחלבון ל- 0.01.
      הערה: תוכנת Spectronaut שימשה בפרוטוקול זה. תוכנות אחרות לחיפוש נתוני DIA כגון DIA-NN ו- PEAKS נמצאות גם הן בשימוש נפוץ. אם הנתונים הושגו במצב DDA, תוכנות כגון MaxQuant ו- Proteome Discoverer ישימות .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מדגים זרימת עבודה מקיפה מבידוד של כלי רכב חשמליים ועד לניתוחי פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה במורד הזרם (איור 1). דגימות השתן המשולשות היו נתונות לבידוד EV. כלי הרכב החשמליים שבודדו התאפיינו בקרישה מערבית ולאחר מכן עובדו להכנת דגימות פרוטאומיקה מבוססות ספקטרומטריית מסות, כולל מיצוי חלבונים, עיכול אנזימטי וניקוי פפטידים. לצורך ניתוח פוספופרוטאומיקה, הפוספו-פפטידים הועשרו עוד יותר בהתבסס על ננו-פולימרים מסיסים המתפקדים על ידי יוני מתכת. הן דגימות פפטיד והן דגימת פוספופפטיד נותחו על ידי ספקטרומטריית מסה של ניידות יונים ברזולוציה גבוהה במצב שאינו תלוי בנתונים. התוצאה בוצעה חיפוש בקבצים גולמיים מול מסד הנתונים של הומו ספיינס , ובוצעה זרימת עבודה של רכישה ללא תלות בנתונים ללא ספרייה לצורך זיהוי וכימות ברמת MS2.

כדי לאפיין את כלי הרכב החשמליים המבודדים ולהעריך את תפוקת ההתאוששות, העמסנו תחילה כמות שוות ערך של 0.5 מ"ל שתן המכיל כלי רכב חשמליים על הג'ל לצורך כתישה מערבית כדי לזהות את סמן ה-EV CD9 (איור 2A). בנוסף, כללנו את כלי הרכב החשמליים שבודדו מאותו נפח שתן בשיטה הנפוצה ביותר לבידוד ר"ח, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (DUC), לשם השוואה. התוצאות הראו כי EVtrap היה מסוגל לייצר אותות CD9 גבוהים בהרבה בהשוואה ל- DUC, מה שמצביע על לכידה יעילה של כלי רכב חשמליים על ידי החרוזים. ערכים כמותיים נוספים עבור כל אות פס CD9 הראו כי EVtrap השיג תפוקת התאוששות של ~99% בהשוואה לעוצמה של פי 5 של בקרת השתן הישירה, בעוד DUC התאושש רק ~ 1.5% של כלי רכב חשמליים (איור 2B).

על-ידי העמסת 2% מכל דגימה על LC-MS/MS לצורך יצירת פרופיל פרוטאומי, זיהינו > 11,000 פפטידים ייחודיים מ~2,200 חלבונים ייחודיים (איור 3A), מה שמצביע על כך שתהליך העבודה הזה מספק כיסוי מעמיק של פרוטאום EV. נצפתה רמה גבוהה של חפיפה בזיהוי חלבונים בין דגימות, כאשר 72% מהחלבונים הייחודיים זוהו באופן עקבי בכל שלושת הרפליקטים (איור 3B). יתר על כן, השווינו את תוצאות הזיהוי עם מסד הנתונים ExoCarta (איור 3C)26. יש לציין כי מתוך 100 הסמנים והחלבונים המובילים של EV, זיהינו בהצלחה ~90 של חלבוני EV אלה, דבר המצביע על פרופיל מלא ובלתי משוחד של חלבוני EV באמצעות ניתוח פרוטאומיקה זה. כדי להעריך את הדיוק הכמותי, הערכנו עוד יותר את התפלגות מקדמי השונות (CV) עבור תוצאות כימות החלבונים (איור 3D). קורות חיים בינוניים נמוכים (5.7%) מצביעים על אמינות ואמינות גבוהה של ההליך, כולל בידוד EV, הכנת דגימות וזיהוי טרשת נפוצה.

לצורך ניתוח הפוספופרוטאומיקה, השתמשנו ב-98% מכל דגימת פפטיד להעשרת פוספו-פטידים, וזיהינו ~800 פוספו-פפטידים ייחודיים המתאימים ל~350 פוספופרוטאינים ייחודיים (איור 4A). ההעשרה הניבה בממוצע 72% פפטידים של פוספוסרין (pS), 22% פוספוטריאונין (pT) ו-6% פפטידים פוספוטירוזין (pY), בהתאמה (איור 4B). במונחים של יכולת הזיהוי של שלושת ההעתקים, 42% מהפוספו-פפטידים זוהו על-ידי כל שלושת הניתוחים, והייתה חפיפה של ~50% בין כל שני ניתוחים (איור 4C). CV בינוני של 21.8% נקבע לכימות פוספופטידים, דבר המצביע על יכולת שחזור כמותית מקובלת באמצעות פרוטוקול זה (איור 4D).

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה סכמטית המשמשת לבידוד שלפוחית חוץ-תאית בשתן (EV) וניתוחים במורד הזרם. כלי רכב חשמליים מבודדים מדגימות שתן באמצעות גישת ההתאוששות והטיהור הכולל של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVtrap), והרכבים החשמליים המבודדים עוברים ישירות ניתוח כתמים מערביים. עבור ניתוח LC-MS/MS, חלבונים מופקים מכלי רכב חשמליים ומתעכלים לפפטידים. דגימות הפפטיד לאחר שלבי הניקוי יכולות לשמש לניתוח פרוטאומיקה או ניתוח פוספופרוטאומיקה לאחר העשרת פוספופפטידים. הן דגימות פרוטאומיקה והן דגימות פוספופרוטאומיקה מנותחות על ידי LC-MS/MS. זיהוי וכימות מבוצעים לאחר מכן באמצעות שיטת זרימת עבודה של רכישה עצמאית של נתונים (DIA). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אפיון כלי רכב חשמליים מבודדים לפי כתמים מערביים . (A) זיהוי סמן EV CD9 מ-0.1 מ"ל דגימת שתן ישירה (n=1), כלי רכב חשמליים שבודדו בגישת צנטריפוגה דיפרנציאלית (DUC) (n=3), ורכבים חשמליים שבודדו בגישת EVtrap (n=3). (B) כימות אותות הקרישה המערביים ב-(A) מוצג כאחוז ההחלמה ביחס לדגימת השתן הישירה (עוצמה של פי 5 = 100%). עבור דגימות DUC ו- EVtrap, תרשים העמודות מציג את העוצמות הממוצעות וסטיות התקן (המיוצגות על-ידי קווי שגיאה) מהטריפליקטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח פרוטאומיקה של כלי רכב חשמליים מבודדים . (A) המספר הכולל של חלבונים ופפטידים ייחודיים שזוהו בטריפליקטים. (B) דיאגרמת Venn המציגה את החפיפה בחלבונים ייחודיים מזוהים בין משכפלים. (C) מספר החלבונים הייחודיים שזוהו המתאימים ל-100 הסמנים העליונים של EV במסד הנתונים של ExoCarta. (D) תרשים צפיפות המציג את התפלגות מקדם השונות (CV) לכימות חלבונים. ערך קורות החיים החציוני מסומן בקו מקווקו אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח פוספופרוטאומיקה של כלי רכב חשמליים מבודדים . (A) המספר הכולל של פוספופרוטאינים ופוספופטידים ייחודיים שזוהו בטריפליקטים. (B) הרכב אחוזים של פפטידים pSTY לאחר העשרת פוספופפטידים. (C) דיאגרמת חיתוך קבוצות (Venn) המציגה את החפיפה בפוספו-פפטידים ייחודיים מזוהים בין עותקים משוכפלים. (D) תרשים צפיפות המציג את התפלגות CV לכימות פוספופפטידים. ערך קורות החיים החציוני מסומן בקו מקווקו אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בידוד יעיל של EV הוא תנאי מוקדם חיוני לאיתור חלבונים ופוספופרוטאינים בשפע נמוך בכלי רכב חשמליים. למרות פיתוחן של שיטות רבות למילוי צורך זה, רובן עדיין סובלות ממגבלות כגון התאוששות לקויה או יכולת שחזור נמוכה, המעכבות את השימוש בהן במחקרים רחבי היקף ובמסגרות קליניות שגרתיות. DUC נחשבת בדרך כלל לשיטה הנפוצה ביותר לבידוד רכב חשמלי, ושלבי השטיפה הנוספים מיושמים בדרך כלל כדי לסייע בהגברת הטוהר של כלי רכב חשמליים27,28. הליך זה מוביל לתהליך DUC מייגע יותר וגוזל זמן רב יותר (> 6 שעות). יתר על כן, תפוקת התאוששות נמוכה של רכב חשמלי לאחר DUC דווחה על ידי מחקרים רבים,29,30 והוצגה בתוצאות באיור 2. לשם השוואה, EVtrap מציע בידוד יעיל של כלי רכב חשמליים (< שעה אחת) ותפוקת התאוששות גבוהה (איור 2). יש לציין כי היישום המוצלח של תהליך עבודה זה מסמן התקדמות מכרעת בזיהוי סמני EV משמעותיים עבור מחלות וסוגי סרטן שונים 19,21,22 עם זאת, EVtrap אינו מסוגל לבודד תת-אוכלוסיות ספציפיות של כלי רכב חשמליים, כגון מיקרו-שלפוחיות או אקסוזומים, מכיוון שהוא לוכד את כל אוכלוסיית הרכב החשמלי.

בפרוטוקול זה השתמשנו ב-2% וב-98% מדגימת הפפטיד לניתוחי פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה. מאחר שכלי הרכב החשמליים שבודדו מ-10 מ"ל שתן על ידי EVtrap מניבים בדרך כלל 100-200 מיקרוגרם של חלבונים בסך הכל, 98% מהפפטידים לאחר העיכול והניקוי מספיקים להעשרת הזרחן. אם נדרש שלב תיוג, כגון תיוג תג מסה טנדם (TMT), לצורך ניתוח כמותי של טרשת נפוצה, ניתן לבצע מדידת ריכוז פפטידים לאחר שלב ההתפלה כדי לנרמל את כמות הפפטיד ולשפר את דיוק הכימות31.

בעוד פרוטוקול זה מדגיש בעיקר את השימוש ב- EVtrap לבידוד כלי רכב חשמליים בשתן, ראוי לציין כי הרבגוניות של גישה זו הודגמה בעיבוד סוגי דגימות שונים32,33,34. בהתבסס על תוצאות קודמות, התנאי ששימש בפרוטוקול זה היה ישים לבידוד כלי רכב חשמליים ממדיית תרביות תאים. לצורך בידוד של כלי רכב חשמליים המופרשים על ידי תאים, התאים מעובדים בתנאי FBS נטולי נסיוב בקר עוברי (FBS) או מדוללי EV כדי למנוע בידוד משותף של כלי רכב חשמליים מוגזמים שמקורם ב-FBS עם כלי רכב חשמליים המופרשים תאים, מה שיערער את אמינות התוצאות35. בנוסף, ניתן לאפיין את כלי הרכב החשמליים המבודדים מסוגי דגימות אחרים על ידי ניתוח כתמים מערביים באמצעות מספר סמנים נפוצים של EV, כולל CD9, CD63, CD81, חלבון גן רגישות לגידול 101 (TSG101) וחלבון אינטראקציה ALG-2 X (ALIX)36.

כדי להגדיל את הכיסוי ולשפר את הכימות בניתוח טרשת נפוצה, בניית ספרייה ספציפית לפרויקט לחיפוש נתוני DIA היא אפשרות חלופית. בשל מורכבות הספקטרום המיוצר במצב DIA, ספרייה ספקטרלית המכילה אוסף של ספקטרום ייחוס מועילה להגברת ביטחון הזיהוי ולשיפור הכיסוי. ניתן ליצור ספריות ספקטרליות באיכות גבוהה על ידי ביצוע ניתוח DDA על אותן דגימות או דגימות מפוצלות מראש37. הספרייה יכולה לשמש גם כדי לקבוע חלונות אופטימליים עבור dia-PASEF ולשפר עוד יותר את הזיהוי38.

יחד, הפרוטוקול המוצג מספק שיטה פשוטה ויעילה לבידוד כלי רכב חשמליים מדגימות שתן לצורך ניתוח פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה. על ידי יישום פרוטוקול זה, אנו מצפים לזיהוי משופר של חלבוני EV ופוספופרוטאינים בעלי שפע נמוך כסמנים ביולוגיים לגילוי מחלות בשלב מוקדם ולניטור אורכי. יתר על כן, לחוקרים יש הזדמנות גדולה לקדם את תחום המחקר של EV ולתרום לאסטרטגיות אבחון וטיפול טובות יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על אינטרס כלכלי מתחרה. אנטון איליוק ואנדי טאו הם מייסדים שותפים של Tymora Analytical Operations, שפיתחה חרוזי EVtrap וערכה מסחרית להעשרת פוספופטיד PolyMAC.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענקי NIH 3RF1AG064250 ו- R44CA239845.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Life Science Products M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1005
15 mL conical centrifuge tube Corning  352097
15 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074P2
Benchtop incubated shaker Bioer DIS-87999-3367802 Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13403S
Chloroacetamide Sigma -Aldrich C0267-100G Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate  Fisher Scientific  E145-4 Precipitates detergents
Evosep One  Evosep Liquid chromatography system
Evotips Evosep EV2013 Sample loading for Evosep One system 
EVtrap Tymora Analytical Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF Membrane Sigma -Aldrich IPFL00010 Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen NP0322BOX Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
PBS ThermoFisher 10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 Bruker  1893473 Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma -Aldrich P5726-5ML 100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Sigma -Aldrich P0044-1ML 100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit Tymora Analytical Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate  Sigma -Aldrich D6750-10G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate  Sigma -Aldrich L9150-50G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT Bruker Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips  Glygen TT2C18.96 Desalting method
Triethylamine Sigma -Aldrich 471283-100ML For EV elution. 
Triethylammonium bicabonate buffer Sigma -Aldrich T7408-100ML 1 M
Trifluoroacetic acid Sigma -Aldrich 302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma -Aldrich C4706 Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX ThermoFisher PIA41007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  5. Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
  6. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
  7. Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
  8. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  9. Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
  10. Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
  11. Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
  12. Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
  13. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
  16. Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
  17. Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
  18. Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
  19. Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
  20. Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
  21. Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
  22. Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
  23. Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
  24. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  27. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
  28. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
  29. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
  30. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  31. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
  32. Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
  33. Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
  34. Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
  35. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  36. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
  37. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
  38. Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).

Tags

מבוסס זיקה כימית בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות נוזלים ביולוגיים ניתוח פרוטאומיקה ניתוח פוספופרוטאומיקה ביופסיה נוזלית שינויים לאחר תרגום זרחון תפקודים תאיים התפרצות מחלות התקדמות המחלה שיטות בידוד חרוזים מגנטיים שתן אנושי ניתוח במורד הזרם תשואת החלמה כלי רכב חשמליים בדרכי השתן פרופילים רגישים פרוטאום פוספופרוטום שיקולים טכניים
בידוד מבוסס זיקה כימית של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים לצורך פרוטאומיקה וניתוח פוספופרוטאומיקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y. K., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, … More

Liu, Y. K., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, W. A. Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65844, doi:10.3791/65844 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter