Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

العزلة القائمة على التقارب الكيميائي للحويصلات خارج الخلية من السوائل الحيوية لتحليل البروتيوميات وعلم الفوسفوبروتيوميكس

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65844
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Summary

يقدم هذا البروتوكول وصفا مفصلا للعزل الفعال للحويصلات البولية خارج الخلية باستخدام حبات مغناطيسية وظيفية. علاوة على ذلك ، فإنه يشمل التحليلات اللاحقة ، بما في ذلك النشاف الغربي ، والبروتينات ، وعلم الفوسفوبروتيوميكس.

Abstract

اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) من السوائل الحيوية مؤخرا اهتماما كبيرا في مجال الخزعة السائلة. يتم إطلاقها بواسطة كل نوع من الخلايا تقريبا ، وهي توفر لقطة في الوقت الفعلي للخلايا المضيفة وتحتوي على ثروة من المعلومات الجزيئية ، بما في ذلك البروتينات ، ولا سيما تلك التي تحتوي على تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) مثل الفسفرة ، باعتبارها اللاعب الرئيسي للوظائف الخلوية وظهور المرض وتطوره. ومع ذلك ، لا يزال عزل المركبات الكهربائية عن السوائل الحيوية يمثل تحديا بسبب انخفاض الغلة والشوائب من طرق عزل المركبات الكهربائية الحالية ، مما يجعل التحليل النهائي لشحنات المركبات الكهربائية ، مثل البروتينات الفوسفاتية EV ، أمرا صعبا. هنا ، نصف طريقة عزل EV سريعة وفعالة تعتمد على حبات مغناطيسية وظيفية لعزل EV من السوائل الحيوية مثل البول البشري والبروتينات النهائية وتحليل phosphoproteomics بعد عزل EV. مكن البروتوكول من تحقيق عائد استرداد مرتفع من EVs البولية والملامح الحساسة للبروتين EV و phosphoproteome. علاوة على ذلك ، يتم تناول تنوع هذا البروتوكول والاعتبارات التقنية ذات الصلة هنا.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية مغلفة بالغشاء تفرزها جميع أنواع الخلايا وهي موجودة في السوائل الحيوية مثل الدم والبول واللعاب وما إلى ذلك 1،2،3،4. تحمل المركبات الكهربائية شحنة من الجزيئات النشطة بيولوجيا المتنوعة التي تعكس الحالة الفسيولوجية والمرضية للخلايا المضيفة ، وبالتالي تعمل كعوامل حاسمة في تطور المرض4،5،6. علاوة على ذلك ، أثبتت الدراسات المكثفة أنه يمكن تحديد علامات المرض القائمة على EV قبل ظهور الأعراض أو الكشف الفسيولوجي عن الأورام5،6،7.

تعمل الفسفرة كآلية رئيسية في الإشارات الخلوية والتنظيم. لذلك ، توفر البروتينات الفوسفاتية مصدرا قيما لاكتشاف العلامات الحيوية حيث ترتبط أحداث الفسفرة الشاذة بمسارات الإشارات الخلوية غير المنظمة وتطور المرض النقيلي مثل السرطان8،9،10. على الرغم من أن ديناميكيات الفسفرة تسمح بتحديد توقيعات البروتين الفوسفاتي الخاصة بالمرض كمؤشرات حيوية محتملة ، إلا أن الوفرة المنخفضة والطبيعة الديناميكية للبروتينات الفوسفاتية تشكل تحديات كبيرة في تطوير البروتينات الفوسفاتية كمؤشرات حيوية11،12. والجدير بالذكر أن البروتينات الفوسفاتية منخفضة الوفرة المغلفة داخل المركبات الكهربائية محمية من الهضم الأنزيمي الخارجي في البيئة خارج الخلية8. وبالتالي ، توفر المركبات الكهربائية والبروتينات الفوسفاتية المشتقة من EV مصدرا مثاليا لاكتشاف العلامات الحيوية في الكشف المبكر عن السرطان والأمراض الأخرى.

على الرغم من أن تحليل فسفرة البروتين في المركبات الكهربائية يوفر موردا قيما لفهم إشارات السرطان وتشخيص المرض في المراحل المبكرة ، إلا أن الافتقار إلى طرق عزل EV الفعالة يمثل عائقا رئيسيا. يتم تحقيق عزل EV بشكل شائع من خلال الطرد المركزي التفاضلي الفائق (DUC) 13. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا وليست مناسبة للآثار السريرية بسبب انخفاض الإنتاجية وضعف التكاثر13,14. طرق عزل EV البديلة ، مثل هطول الأمطار الناجم عن البوليمر15 ، محدودة بسبب الخصوصية المنخفضة بسبب الترسيب المشترك للبروتينات غير EV. توفر الأساليب القائمة على التقارب ، بما في ذلك التقاط التقارب القائم على الأجسام المضادة16 وترشيح التقارب17 ، خصوصية محسنة ولكنها تقتصر على معدل استرداد منخفض نسبيا بسبب الحجم الصغير.

لمعالجة المشكلات المتعلقة باستكشاف ديناميكيات البروتين الفوسفاتي في المركبات الكهربائية ، طورت مجموعتنا تقنية الاسترداد والتنقية الكلية للحويصلات خارج الخلية (EVtrap) بناء على التقارب الكيميائي لالتقاط المركبات الكهربائية على حبات مغناطيسية وظيفية18. أظهرت النتائج السابقة أن طريقة عزل EV القائمة على الخرزة المغناطيسية فعالة للغاية في عزل المركبات الكهربائية من مجموعة واسعة من عينات السوائل الحيوية وقادرة على تحقيق إنتاجية EV أعلى بكثير مع تقليل التلوث مقارنة ب DUC وطرق العزل الأخرى الموجودة18,19. لقد استخدمنا بنجاح EVtrap وطريقة تخصيب الفوسفوببتيد القائمة على التيتانيوم التي طورتها مجموعتنا20 لتحديد ملامح فوسفوبروتيوم المركبات الكهربائية المشتقة من السوائل الحيوية المتنوعة وللكشف عن المؤشرات الحيوية المحتملة للبروتين الفوسفاتي لمختلف الأمراض19،21،22.

هنا ، نقدم بروتوكولا يعتمد على EVtrap لعزل المركبات الكهربائية المتداولة. يركز البروتوكول على المركبات الكهربائية البولية. نوضح أيضا توصيف المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام النشاف الغربي. ثم نقوم بتفصيل تحضير العينة واكتساب قياس الطيف الكتلي (MS) لكل من تحليلات البروتينات وعلم الفوسفوبروتيوميكس. يوفر هذا البروتوكول سير عمل فعال وقابل للتكرار لتحديد ملامح بروتين EV البولي و phosphoproteome ، مما سيسهل إجراء مزيد من الدراسات حول EVs وتطبيقاتها السريرية23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم جمع جميع عينات البول من الأفراد الأصحاء بعد الموافقة المستنيرة. كانت التجارب متوافقة مع جميع المعايير الأخلاقية التي تنطوي على عينات بشرية وتتوافق مع المبادئ التوجيهية من برنامج حماية البحوث البشرية بجامعة بوردو.

1. جمع العينات

  1. جهاز طرد مركزي 12 مل من عينة البول في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل لمدة 10 دقائق عند 2500 × جم ، 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلايا والأجسام المبرمج الكبيرة.
  2. انقل 10 مل من المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل واستمر في عزل EV.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية وإذابتها عند 37 درجة مئوية عند الاستخدام.

2. عزل EV باستخدام نهج EVtrap

  1. أضف 0.5 مل من مخزن التحميل المؤقت (نسبة 1:10 فولت / فولت) و 100 ميكرولتر من ملاط حبة EVtrap (نسبة 1:50 فولت / فولت) إلى العينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. احتضان العينة عن طريق الدوران من طرف إلى طرف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بتجميع العينة عن طريق وضع الأنبوب المخروطي سعة 15 مل على رف فاصل مغناطيسي. إزالة الطاف.
  4. أعد تعليق الخرزات في 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ماصة بلطف لإعادة تعليق الخرز المرتبط بالمركبات الكهربائية.
  5. ضع الأنبوب على رف فاصل مغناطيسي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ونضح المادة الطافية. استخدم ماصة P200 لشفط المادة الطافية تماما وتجنب شفط الخرز.
  6. اغسل الخرزات ب 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل. أضف المخزن المؤقت مباشرة بعد شفط المادة الطافية لمنع جفاف الخرز.
  7. اغسل الخرزات 2x مع 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة.
  8. احتضن الخرزات ب 100 ميكرولتر من ثلاثي إيثيل أمين 100 مللي متر طازج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واجمع المحلول المستحضر الذي يحتوي على EVs باستخدام رف فاصل مغناطيسي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: لتحضير 1 مل من 100 مللي متر ثلاثي إيثيل أمين ، قم بتخفيف 14 ميكرولتر من محلول ثلاثي إيثيل أمين في الماء.
  9. كرر الخطوة 2.8 وادمج المحاليل المستخلصة. جفف الشطف باستخدام مكثف طرد مركزي مفرغ عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا. يمكن تخزين عينات EV المجففة في -80 درجة مئوية لعدة أشهر دون آثار ضارة على الخطوات التالية أو النتائج.

3. توصيف المركبات الكهربائية عن طريق النشاف الغربي

  1. أعد تعليق 5٪ من عينة EV المجففة (ما يعادل 0.5 مل من عينة البول) في 20 ميكرولتر من 1x مخزن عينة كبريتات دوديسيل الليثيوم (LDS) مع 10 مللي مول ديثيوثريتول (DTT).
    ملاحظة: المركبات الكهربائية من 0.5 مل من البول كافية للكشف عن إشارة CD9 (علامة EV24) في النشاف الغربي.
  2. تغلي العينة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. قم بتحميل العينة على هلام بولي أكريلاميد وقم بإجراء الرحلان الكهربائي والنشاف المناعي باتباع البروتوكولات القياسية25.
  3. بعد نقل البروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين منخفض التألق (PVDF) ، قم بسد الغشاء ب 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في محلول ملحي ثلاثي التخزين 20 (TBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. لتحضير 1 لتر من المخزن المؤقت TBST ، أضف 19 mM Tris base و 137 mM NaCl و 1 mL من Tween-20 ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
  4. احتضان الغشاء بالجسم المضاد للأرانب المضاد ل CD9 بنسبة 1: 5000 في 1٪ BSA في TBST عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. اغسل الغشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما باستخدام TBST. احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الثانوية IgG المضادة للأرانب والمرتبطة ب HRP بنسبة 1: 5000 في 1٪ BSA في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل الغشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما باستخدام TBST. أضف ركائز التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) التي تم الحصول عليها تجاريا (نسبة 1: 1) على الغشاء واكتشف الإشارات على نظام تصوير التلألؤ الكيميائي.

4. تحضير العينة لتحليل البروتيوميات والفوسفوبروتيوميكس

  1. تحضير محلول تحلل طازج يحتوي على 12 مللي متر ديوكسي كولات الصوديوم (SDC) ، 12 مللي متر لورويل الصوديوم ساركوسينات (SLS) ، 100 مللي متر ثلاثي إيثيل الأمونيوم بيكربونات عازلة (TEAB) ، 10 مللي متر تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) ، 40 مللي متر كلوروأسيتاميد (CAA) ، وكوكتيلات مثبطة للفوسفاتيز 1x.
    ملاحظة: يتم سرد حلول الأسهم في وصف جدول المواد. يتم تحضير المخزن المؤقت للتحلل عن طريق إضافة محاليل المخزون لتحقيق التركيزات المطلوبة اعتمادا على الحجم المطلوب.
  2. قم بإذابة عينة EV المجففة في 100 ميكرولتر من محلول التحلل وقم بتسخين العينة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 1100 دورة في الدقيقة.
  3. بعد تبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيفها خمسة أضعاف بإضافة 400 ميكرولتر من 50 مللي متر TEAB.
  4. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم المخزن المؤقت للتحلل المخفف خمسة أضعاف مع 50 مللي متر TEAB فارغا.
  5. أضف مزيج التربسين / Lys-C عند نسبة 1:50 وزن / وزن من الإنزيم إلى البروتين واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع الرج عند 1100 دورة في الدقيقة.
  6. أضف 50 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 10٪ (TFA) لتحمض العينة.
  7. أضف 600 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل إلى العينات ودوامة الخليط لمدة 2 دقيقة.
  8. أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 3 دقائق عند 20000 × جم وإزالة الطبقة العليا (الطبقة العضوية). تجنب إزعاج الواجهة أثناء الشفط.
  9. كرر الخطوات 4.7-4.8. تجفيف المرحلة المائية باستخدام مكثف الطرد المركزي فراغ.
  10. أعد تعليق العينة المجففة في 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA لتحمض الببتيدات وتحلية العينة باستخدام طرف تحلية C18 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتكييف الطرف ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA في 80٪ أسيتونيتريل ، متبوعا ب 2x مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بتحميل عينة الببتيد المحمضة في الطرف ثم اغسل الطرف 3x ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بالتخلص من الببتيدات مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA في 80٪ أسيتونيتريل.
  11. تجفيف الشطف باستخدام مكثف الطرد المركزي فراغ. جفف 2٪ من عينة الببتيد (ما يعادل 0.2 مل من عينة البول) بشكل منفصل لتحليل البروتينات. استخدم بقية (98٪) من العينة لتحليل الفوسفوبروتيوميكس.
  12. قم بإثراء الببتيدات الفوسفوببتيد من العينة باستخدام مجموعة إثراء الفوسفوببتيد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه للتخصيب.
    1. أعد تعليق العينة المجففة في 200 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت. أضف 50 ميكرولتر من الخرز إلى العينة ورجها بقوة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل العينة بالخرز إلى الطرف المتصدع وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 100 × جم.
    2. اغسل الطرف ب 200 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت ، متبوعا بمحلول الغسيل 1 ، ثم المخزن المؤقت للغسيل 2. قم بإجراء جميع خطوات الغسيل الثلاث عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة لمدة 2 دقيقة عند 20 × جم ومرة واحدة لمدة 1 دقيقة عند 100 × جم.
    3. ضع الطرف مع الخرز في أنبوب جديد لجمع الببتيدات الفوسفوببتيدات. أضف 50 ميكرولتر من محلول الشطف إلى الطرف وأجهزة الطرد المركزي مرة واحدة لمدة دقيقتين عند 20 × جم. أضف 50 ميكرولتر أخرى من محلول الشطف إلى الطرف وأجهزة الطرد المركزي مرة واحدة لمدة دقيقتين عند 20 × جم. أجهزة الطرد المركزي مرة أخيرة لمدة 1 دقيقة في 100 × غرام.
  13. قم بتجفيف الببتيدات الفوسفاتية المشحونة باستخدام مكثف طرد مركزي مفرغ.

5. تحليل LC-MS / MS

ملاحظة: يمكن استخدام أنظمة/إعدادات LC-MS/MS المختلفة وطرق الحصول على البيانات، مثل الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA).

  1. أعد تعليق عينات البروتيوم / الفوسفوبروتيوم المجففة في 0.1٪ حمض الفورميك (المذيب أ) وقم بتحميل العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بحقن العينات في MS وقت الرحلة المحاصر للحركة الأيونية من خلال نظام الكروماتوغرافيا السائلة (LC) واستخدم طريقة Whisper 40 القياسية المحددة مسبقا في اليوم. يتم فصل الببتيدات على عمود C18 15 سم (قطر داخلي 75 ميكرومتر ، حجم جسيمات 1.9 ميكرومتر) كما هو مذكور في جدول المواد.
  3. لتحليل البروتيوميات، الحصول على البيانات باستخدام تجزئة تسلسلية متوازية للتراكم مقترنة بطريقة اكتساب مستقلة عن البيانات (dia-PASEF) مع نطاق كتلة لكل منحدر يمتد من 300-1200 m/z ومن 0.6-1.50 1/K0 مع وقت دورة يبلغ 1.38 ثانية.
  4. لتحليل الفوسفوبروتيوميكس، الحصول على البيانات باستخدام طريقة اكتساب dia-PASEF مع نطاق كتلة لكل منحدر يمتد من 400-1550 م / ض و 0.6-1.50 1 / K0 مع وقت دورة 1.38 ثانية.
  5. قم بتحميل الملفات الأولية في برنامج البروتينات وقم بإجراء استخراج الإشارات وتحديد الهوية والقياس الكمي باستخدام سير عمل اكتساب بيانات مستقل خال من المكتبة.
    1. لإعدادات البحث ، استخدم قاعدة بيانات Homo sapiens ، وأنواع هضم محددة مع إنزيمات التربسين / P ، و 7 الحد الأدنى لطول الببتيد ، و 52 الحد الأقصى لطول الببتيد ، واثنين من الانقسام المفقود ، وكارباميدوميثيل في السيستين كتعديل ثابت ، وبروتين الأسيتيل N-term ، والأكسدة في الميثيونين ، والفسفرة في سيرين ، ثريونين ، وتيروزين (لتحليل الفوسفوبروتيوميكس) كتعديلات متغيرة ، و 5 كتعديلات متغيرة قصوى. اضبط FDR على PSM والببتيد ومجموعة البروتين على 0.01.
      ملاحظة: تم استخدام برنامج Spectronaut في هذا البروتوكول. كما يتم استخدام برامج البحث عن بيانات DIA الأخرى مثل DIA-NN و PEAKS بشكل شائع. إذا تم الحصول على البيانات في وضع DDA ، فإن برامج مثل MaxQuant و Proteome Discoverer قابلة للتطبيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح هذا البروتوكول سير عمل شامل من عزل المركبات الكهربائية إلى البروتينات النهائية وتحليلات الفوسفوبروتيوميكس (الشكل 1). خضعت عينات البول الثلاثية لعزل EV. تميزت المركبات الكهربائية المعزولة بالنشاف الغربي وتمت معالجتها لاحقا لإعداد عينات البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي بما في ذلك استخراج البروتين والهضم الأنزيمي وتنظيف الببتيد. لتحليل الفوسفوبروتيوميكس ، تم إثراء الببتيدات الفوسفوببتيدات بشكل أكبر بناء على البوليمرات النانوية القابلة للذوبان في الأيونات المعدنية. تم تحليل كل من عينات الببتيد والفوسفوببتيد بواسطة قياس الطيف الكتلي عالي الدقة للحركة الأيونية في ظل الوضع المستقل عن البيانات. تم البحث في الملفات الأولية الناتجة مقابل قاعدة بيانات Homo sapiens ، وتم تنفيذ سير عمل الاستحواذ المستقل عن البيانات الخالية من المكتبة لتحديد الهوية والقياس الكمي على مستوى MS2.

لتوصيف EVs المعزولة وتقدير عائد الاسترداد ، قمنا أولا بتحميل ما يعادل 0.5 مل من البول الذي يحتوي على EVs على الجل للنشاف الغربي للكشف عن علامة EV CD9 (الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتضمين EVs المعزولة من نفس حجم البول باستخدام الطريقة الأكثر استخداما لعزل EV ، الطرد المركزي التفاضلي (DUC) ، للمقارنة. أظهرت النتائج أن EVtrap كان قادرا على إنتاج إشارات CD9 أعلى بكثير مقارنة ب DUC ، مما يشير إلى التقاط فعال للمركبات الكهربائية بواسطة الخرز. أظهرت القيم الكمية الإضافية لكل إشارة نطاق CD9 أن EVtrap حقق عائد استرداد بنسبة ~ 99٪ مقارنة بكثافة 5 أضعاف للتحكم المباشر في البول ، بينما استعاد DUC فقط ~ 1.5٪ من EVs (الشكل 2B).

من خلال تحميل 2٪ من كل عينة على LC-MS / MS للتنميط البروتيني ، حددنا > 11000 ببتيد فريد من ~ 2200 بروتين فريد (الشكل 3 أ) ، مما يشير إلى أن سير العمل هذا يوفر تغطية متعمقة لبروتين EV. لوحظت درجة عالية من التداخل في تحديد البروتين عبر العينات ، حيث تم تحديد 72٪ من البروتينات الفريدة باستمرار في جميع النسخ المتماثلة الثلاثة (الشكل 3 ب). علاوة على ذلك ، قارنا نتائج التعريف بقاعدة بيانات ExoCarta (الشكل 3C)26. والجدير بالذكر أنه من بين أفضل 100 علامة وبروتينات EV ، نجحنا في تحديد ~ 90 من بروتينات EV هذه ، مما يشير إلى تنميط غير متحيز وكامل لبروتينات EV من خلال تحليل البروتينات هذا. لتقييم الدقة الكمية ، قمنا بتقييم توزيع معاملات الاختلاف (CV) لنتائج القياس الكمي للبروتين (الشكل 3D). تشير السيرة الذاتية المتوسطة المنخفضة (5.7٪) إلى قابلية التكرار العالية وموثوقية الإجراء ، بما في ذلك عزل EV وإعداد العينات واكتشاف مرض التصلب العصبي المتعدد.

بالنسبة لتحليل الفوسفوبروتيوميكس ، استخدمنا 98٪ من كل عينة ببتيد لإثراء الفوسفوببتيد وحددنا ~ 800 ببتيدات فوسفوببتيدات فريدة تقابل ~ 350 بروتينا فوسفاتيا فريدا (الشكل 4 أ). أسفر التخصيب عن متوسط 72٪ ببتيدات فوسفوسيرين (pS) ، و 22٪ فوسفوثريونين (pT) ، و 6٪ ببتيدات فوسفوتيروزين (pY) ، على التوالي (الشكل 4B). من حيث قابلية استنساخ تحديد التكرارات الثلاثة ، تم تحديد 42٪ من الببتيدات الفوسفوببتيدات بواسطة جميع التحليلات الثلاثة ، وكان هناك تداخل ~ 50٪ بين كل تحليلين (الشكل 4C). تم تحديد سيرة ذاتية متوسطة بنسبة 21.8٪ للقياس الكمي للفوسفوببتيدات ، مما يشير إلى قابلية استنساخ كمية مقبولة باستخدام هذا البروتوكول (الشكل 4D).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل التخطيطي المستخدم لعزل الحويصلة البولية خارج الخلية (EV) والتحليلات النهائية. يتم عزل EVs من عينات البول من خلال نهج الاسترداد الكلي والحويصلات خارج الخلية والتنقية (EVtrap) ، وتخضع EVs المعزولة مباشرة لتحليل النشاف الغربي. لتحليل LC-MS / MS ، يتم استخراج البروتينات من EVs وهضمها في الببتيدات. يمكن استخدام عينات الببتيد بعد خطوات التنظيف لتحليل البروتينات أو تحليل الفوسفوبروتيوميكس بعد إثراء الفوسفوببتيد. يتم تحليل كل من عينات البروتيوميات والفوسفوبروتيوميكس بواسطة LC-MS / MS. ثم يتم إجراء التحديد والقياس الكمي باستخدام طريقة سير عمل الاستحواذ المستقل للبيانات (DIA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توصيف المركبات الكهربائية المعزولة بواسطة النشاف الغربي . (أ) الكشف عن علامة EV CD9 من 0.1 مل من عينة البول المباشرة (ن = 1) ، EVs المعزولة باستخدام نهج الطرد المركزي التفاضلي (ن = 3) ، والمركبات الكهربائية المعزولة باستخدام نهج EVtrap (ن = 3). (ب) يتم تقديم القياس الكمي لإشارات النشاف الغربية في (أ) كنسبة مئوية للاسترداد بالنسبة لعينة البول المباشرة (شدة 5 أضعاف = 100٪). بالنسبة لعينات DUC و EVtrap ، يعرض مخطط الشريط متوسط الشدة والانحرافات المعيارية (ممثلة بأشرطة الخطأ) من النسخ الثلاثية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل البروتيوميات للمركبات الكهربائية المعزولة. أ: إجمالي عدد البروتينات والببتيدات الفريدة المحددة في ثلاث نسخ. (ب) مخطط فن يوضح التداخل في البروتينات الفريدة المحددة بين التكرارات. (ج) عدد البروتينات الفريدة المحددة المقابلة لأعلى 100 علامة EV في قاعدة بيانات ExoCarta. (د) مخطط الكثافة الذي يوضح توزيع معامل التغير (CV) لتحديد كمية البروتين. يتم تمييز متوسط قيمة السيرة الذاتية بخط أحمر متقطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل الفوسفوبروتيوميكس للمركبات الكهربائية المعزولة. (أ) إجمالي عدد البروتينات الفوسفاتية الفريدة المحددة والببتيدات الفوسفاتية في ثلاث نسخ. (ب) النسبة المئوية لتكوين الببتيدات pSTY بعد إثراء الفوسفوببتيد. (ج) مخطط فن يوضح التداخل في الفوسفوببتيدات الفريدة المحددة بين التكرارات. (د) مخطط الكثافة الذي يوضح توزيع السيرة الذاتية لتحديد كمية الفوسفوببتيد. يتم تمييز متوسط قيمة السيرة الذاتية بخط أحمر متقطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد العزل الفعال للمركبات الكهربائية شرطا أساسيا للكشف عن البروتينات منخفضة الوفرة والبروتينات الفوسفاتية في المركبات الكهربائية. على الرغم من تطوير العديد من الطرق لتلبية هذه الحاجة ، لا تزال الغالبية تعاني من قيود مثل ضعف التعافي أو انخفاض قابلية التكاثر ، مما يعيق استخدامها في الدراسات واسعة النطاق والإعدادات السريرية الروتينية. يعتبر DUC بشكل عام الطريقة الأكثر شيوعا لعزل EV ، وعادة ما يتم تطبيق خطوات الغسيل الإضافية للمساعدة في زيادة نقاء المركبات الكهربائية المستهدفة27,28. يؤدي هذا الإجراء إلى عملية DUC أكثر مملة وتستغرق وقتا طويلا (> 6 ساعات). علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن انخفاض عائد استرداد EV بعد DUC من خلال دراسات متعددة ،29،30 ويظهر في النتائج في الشكل 2. بالمقارنة ، يوفر EVtrap عزلا فعالا للمركبات الكهربائية (< 1 ساعة) وعائد استرداد مرتفع (الشكل 2). والجدير بالذكر أن التطبيق الناجح لسير العمل هذا يمثل تقدما حاسما لتحديد علامات EV المهمة لمختلف الأمراض والسرطانات19،21،22 ومع ذلك ، فإن EVtrap غير قادر على عزل مجموعات فرعية محددة من المركبات الكهربائية ، مثل الحويصلات الدقيقة أو exosomes ، لأنه يلتقط جميع سكان EV.

في هذا البروتوكول ، استخدمنا 2٪ و 98٪ من عينة الببتيد لتحليل البروتينات وعلم الفوسفوبروتيوميكس. نظرا لأن EVs المعزولة من 10 مل من البول بواسطة EVtrap تنتج عادة 100-200 ميكروغرام من إجمالي البروتينات ، فإن 98٪ من الببتيدات بعد الهضم والتنظيف كافية لإثراء الفوسفوببتيد. إذا كانت هناك حاجة إلى خطوة وضع العلامات ، مثل وضع العلامات الترادفية على علامة الكتلة (TMT) ، لتحليل MS الكمي ، فيمكن إجراء قياس تركيز الببتيد بعد خطوة التحلية لتطبيع كمية الببتيد وتحسين دقة القياس الكمي31.

بينما يسلط هذا البروتوكول الضوء في المقام الأول على استخدام EVtrap لعزل EVs البولية ، تجدر الإشارة إلى أن تنوع هذا النهج قد تم إثباته في معالجة أنواع العيناتالمختلفة 32،33،34. بناء على النتائج السابقة ، كانت الحالة المستخدمة في هذا البروتوكول قابلة للتطبيق لعزل EVs من وسائط زراعة الخلايا. لعزل EVs المفرزة بالخلايا ، تزرع الخلايا تحت ظروف FBS الخالية من مصل الأبقار الجنيني (FBS) أو المستنفدة EV لمنع العزلة المشتركة للمركبات الكهربائية المفرطة المشتقة من FBS مع EVs المفرزة بالخلايا ، مما سيقوض موثوقية النتائج35. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تمييز EVs المعزولة من أنواع العينات الأخرى من خلال تحليل النشاف الغربي باستخدام العديد من علامات EV الشائعة ، بما في ذلك CD9 و CD63 و CD81 وجين حساسية الورم 101 بروتين (TSG101) و ALG-2-interacting protein X (ALIX) 36.

لزيادة التغطية وتحسين القياس الكمي في تحليل MS ، يعد إنشاء مكتبة خاصة بالمشروع للبحث في بيانات DIA خيارا بديلا. نظرا لتعقيد الأطياف المنتجة في وضع DIA ، فإن المكتبة الطيفية التي تحتوي على مجموعة من الأطياف المرجعية مفيدة لزيادة الثقة في تحديد الهوية وتحسين التغطية. يمكن إنشاء مكتبات طيفية عالية الجودة عن طريق إجراء تحليل DDA على نفس العينات أو العينات المجزأةمسبقا 37. يمكن أيضا استخدام المكتبة لتحديد النوافذ المثلى ل dia-PASEF وزيادة تحسين تحديدالهوية 38.

يوفر البروتوكول المقدم مجتمعة طريقة بسيطة وفعالة لعزل المركبات الكهربائية من عينات البول لتحليل البروتينات وعلم الفوسفوبروتيوميكس. من خلال تنفيذ هذا البروتوكول ، نتوقع تحسين الكشف عن البروتينات الكهربائية منخفضة الوفرة والبروتينات الفوسفاتية كمؤشرات حيوية للكشف عن الأمراض في المراحل المبكرة والمراقبة الطولية. علاوة على ذلك ، يتمتع الباحثون بفرصة كبيرة للنهوض بمجال أبحاث المركبات الكهربائية والمساهمة في استراتيجيات تشخيصية وعلاجية أفضل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عن مصلحة مالية متنافسة. أنطون إليوك و دبليو آندي تاو هما مؤسسان مشاركان لشركة Tymora Analytical Operations ، التي طورت حبات EVtrap وقامت بتسويق مجموعة إثراء الفوسفوببتيد PolyMAC.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 3RF1AG064250 و R44CA239845.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Life Science Products M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1005
15 mL conical centrifuge tube Corning  352097
15 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074P2
Benchtop incubated shaker Bioer DIS-87999-3367802 Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13403S
Chloroacetamide Sigma -Aldrich C0267-100G Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate  Fisher Scientific  E145-4 Precipitates detergents
Evosep One  Evosep Liquid chromatography system
Evotips Evosep EV2013 Sample loading for Evosep One system 
EVtrap Tymora Analytical Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF Membrane Sigma -Aldrich IPFL00010 Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen NP0322BOX Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
PBS ThermoFisher 10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 Bruker  1893473 Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma -Aldrich P5726-5ML 100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Sigma -Aldrich P0044-1ML 100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit Tymora Analytical Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate  Sigma -Aldrich D6750-10G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate  Sigma -Aldrich L9150-50G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT Bruker Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips  Glygen TT2C18.96 Desalting method
Triethylamine Sigma -Aldrich 471283-100ML For EV elution. 
Triethylammonium bicabonate buffer Sigma -Aldrich T7408-100ML 1 M
Trifluoroacetic acid Sigma -Aldrich 302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma -Aldrich C4706 Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX ThermoFisher PIA41007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  5. Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
  6. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
  7. Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
  8. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  9. Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
  10. Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
  11. Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
  12. Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
  13. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
  16. Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
  17. Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
  18. Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
  19. Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
  20. Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
  21. Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
  22. Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
  23. Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
  24. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  27. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
  28. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
  29. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
  30. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  31. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
  32. Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
  33. Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
  34. Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
  35. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  36. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
  37. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
  38. Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).

Tags

قائم على التقارب الكيميائي ، العزل ، الحويصلات خارج الخلية ، السوائل الحيوية ، تحليل البروتينات ، تحليل الفوسفوبروتيوميكس ، الخزعة السائلة ، تعديلات ما بعد الترجمة ، الفسفرة ، الوظائف الخلوية ، بداية المرض ، تطور المرض ، طرق العزل ، الخرز المغناطيسي ، البول البشري ، تحليل المصب ، عائد الشفاء ، EVs البولية ، الملامح الحساسة ، البروتين ، الفوسفوبروتيوم ، الاعتبارات الفنية
العزلة القائمة على التقارب الكيميائي للحويصلات خارج الخلية من السوائل الحيوية لتحليل البروتيوميات وعلم الفوسفوبروتيوميكس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y. K., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, … More

Liu, Y. K., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, W. A. Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65844, doi:10.3791/65844 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter