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Biochemistry

प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए बायोफ्लुइड से बाह्य पुटिकाओं का रासायनिक आत्मीयता-आधारित अलगाव

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65844
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों का उपयोग मूत्र बाह्य पुटिकाओं के कुशल अलगाव के लिए विस्तृत विवरण प्रदान करता है। इसके अलावा, इसमें बाद के विश्लेषण शामिल हैं, जिनमें पश्चिमी सोख्ता, प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स शामिल हैं।

Abstract

बायोफ्लुइड से एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) ने हाल ही में तरल बायोप्सी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है। लगभग हर प्रकार के सेल द्वारा जारी, वे मेजबान कोशिकाओं का एक वास्तविक समय स्नैपशॉट प्रदान करते हैं और प्रोटीन सहित आणविक जानकारी का खजाना होते हैं, विशेष रूप से फॉस्फोराइलेशन जैसे पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) के साथ, सेलुलर कार्यों और रोग की शुरुआत और प्रगति के मुख्य खिलाड़ी के रूप में। हालांकि, वर्तमान ईवी अलगाव विधियों से कम पैदावार और अशुद्धियों के कारण बायोफ्लुइड से ईवीएस का अलगाव चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, जिससे ईवी कार्गो का डाउनस्ट्रीम विश्लेषण, जैसे ईवी फॉस्फोप्रोटीन, मुश्किल हो जाता है। यहां, हम ईवी अलगाव के बाद मानव मूत्र और डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण जैसे बायोफ्लुइड से ईवी अलगाव के लिए कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों के आधार पर एक तेजी से और प्रभावी ईवी अलगाव विधि का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल ने मूत्र ईवीएस की उच्च वसूली उपज और ईवी प्रोटिओम और फॉस्फोप्रोटिओम के संवेदनशील प्रोफाइल को सक्षम किया। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल और प्रासंगिक तकनीकी विचारों की बहुमुखी प्रतिभा को भी यहां संबोधित किया गया है।

Introduction

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) सभी प्रकार की कोशिकाओं द्वारा स्रावित झिल्ली-एनकैप्सुलेटेड नैनोपार्टिकल्स हैं और रक्त, मूत्र, लार, आदि जैसे बायोफ्लुइड में मौजूद हैं1,2,3,4. ईवीएस विविध बायोएक्टिव अणुओं का एक माल ले जाते हैं जो उनके मेजबान कोशिकाओं की शारीरिक और रोग स्थिति को दर्शाते हैं और इसलिए रोग की प्रगति 4,5,6में महत्वपूर्ण कारक के रूप में कार्य करते हैं। इसके अलावा, व्यापक अध्ययनों ने स्थापित किया है कि ईवी-आधारित रोग मार्करों को लक्षणों की शुरुआत या ट्यूमर 5,6,7 के शारीरिक पता लगाने से पहले पहचाना जा सकता है।

फॉस्फोराइलेशन सेलुलर सिग्नलिंग और विनियमन में एक महत्वपूर्ण तंत्र के रूप में कार्य करता है। इसलिए, फॉस्फोप्रोटीन बायोमार्कर खोज के लिए एक मूल्यवान स्रोत प्रदान करते हैं क्योंकि असामान्य फॉस्फोराइलेशन घटनाएं अनियमित सेलुलर सिग्नलिंग रास्ते और मेटास्टेटिक रोग विकास जैसे कैंसर 8,9,10 से जुड़ी होती हैं। हालांकि फॉस्फोराइलेशन गतिशीलता की रूपरेखा संभावित बायोमार्कर के रूप में रोग-विशिष्ट फॉस्फोप्रोटीन हस्ताक्षर की पहचान के लिए अनुमति देती है, फॉस्फोप्रोटीन की कम बहुतायत और गतिशील प्रकृति बायोमार्कर11,12 के रूप में फॉस्फोप्रोटीन विकसित करने में बड़ी चुनौतियां पेश करती है। विशेष रूप से, ईवीएस के भीतर समझाया कम प्रचुर मात्रा में फॉस्फोप्रोटीनबाह्य वातावरण 8 में बाहरी एंजाइमेटिक पाचन से संरक्षित हैं. नतीजतन, ईवीएस और ईवी-व्युत्पन्न फॉस्फोप्रोटीन कैंसर और अन्य बीमारियों के शुरुआती चरण का पता लगाने में बायोमार्कर खोज के लिए एक आदर्श स्रोत प्रदान करते हैं।

हालांकि ईवीएस में प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन का विश्लेषण कैंसर सिग्नलिंग और प्रारंभिक चरण की बीमारी निदान को समझने के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करता है, कुशल ईवी अलगाव विधियों की कमी एक प्रमुख बाधा प्रस्तुत करती है। ईवी अलगाव आमतौर पर अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (डीयूसी)13के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। हालांकि, इस विधि समय लेने वाली है और कम throughput और गरीब प्रजनन क्षमता13,14 के कारण नैदानिक प्रभाव के लिए उपयुक्त नहीं है. वैकल्पिक ईवी अलगाव दृष्टिकोण, जैसे बहुलक-प्रेरित वर्षा15, गैर-ईवी प्रोटीन की सह-वर्षा के कारण कम विशिष्टता द्वारा सीमित हैं। एंटीबॉडी-आधारित आत्मीयता कैप्चर16 और आत्मीयतानिस्पंदन 17 सहित आत्मीयता-आधारित दृष्टिकोण, बढ़ी हुई विशिष्टता प्रदान करते हैं लेकिन छोटी मात्रा के कारण अपेक्षाकृत कम वसूली दर तक सीमित हैं।

ईवीएस में फॉस्फोप्रोटीन गतिशीलता की खोज में मुद्दों को हल करने के लिए, हमारे समूह ने कार्यात्मकचुंबकीय मोतियों पर ईवीएस को पकड़ने के लिए रासायनिक आत्मीयता के आधार पर बाह्य पुटिकाओं कुल वसूली और शुद्धि (ईवीट्रैप) तकनीक विकसित की है। पिछले परिणामों से पता चला है कि इस चुंबकीय मनका आधारित ईवी अलगाव विधि biofluid नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला से EVs अलग करने में अत्यधिक प्रभावी है और DUC और अन्य मौजूदा अलगाव विधियों18,19 की तुलना में संदूषण को कम करते हुए बहुत अधिक EV उपज प्राप्त करने में सक्षम है. हमने ईवीट्रैप और टाइटेनियम-आधारित फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन विधि का सफलतापूर्वक उपयोग किया है जो हमारे समूह20 द्वारा विकसित किया गया है ताकि विभिन्न बायोफ्लुइड से प्राप्त ईवीएस के फॉस्फोप्रोटेम को प्रोफाइल किया जा सके और विभिन्न रोगों के लिए संभावित फॉस्फोप्रोटीन बायोमार्कर का पता लगाया जा सके 19,21,22।

यहां, हम परिसंचारी ईवीएस के अलगाव के लिए ईवीट्रैप पर आधारित एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल मूत्र ईवीएस पर केंद्रित है। हम पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके पृथक ईवीएस के लक्षण वर्णन को भी प्रदर्शित करते हैं। फिर हम प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण दोनों के लिए नमूना तैयारी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) अधिग्रहण का विस्तार करते हैं। यह प्रोटोकॉल मूत्र ईवी प्रोटिओम और फॉस्फोप्रोटिओम की रूपरेखा के लिए एक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वर्कफ़्लो प्रदान करता है, जो ईवीएस और उनके नैदानिक अनुप्रयोगों पर आगे के अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा23.

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Protocol

सूचित सहमति के बाद स्वस्थ व्यक्तियों से सभी मूत्र के नमूने एकत्र किए गए थे। प्रयोग मानव नमूनों से जुड़े सभी नैतिक मानकों के अनुरूप थे और पर्ड्यू विश्वविद्यालय मानव अनुसंधान संरक्षण कार्यक्रम के दिशानिर्देशों के अनुरूप थे।

1. नमूना संग्रह

  1. सेल मलबे और बड़े एपोप्टोटिक निकायों को हटाने के लिए 2,500 x ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में मूत्र के नमूने के 12 एमएल अपकेंद्रित्र।
  2. सतह पर तैरनेवाला के 10 एमएल को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और ईवी अलगाव के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है, और नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और उपयोग पर 37 डिग्री सेल्सियस पर thawed कर सकते हैं.

2. EVtrap दृष्टिकोण का उपयोग करके EV अलगाव

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूने में लोडिंग बफर (1:10 वी/वी अनुपात) के 0.5 एमएल और ईवीट्रैप मनका घोल (1:50 वी/वी अनुपात) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अंत से अधिक अंत रोटेशन द्वारा नमूना सेते हैं.
  3. एक चुंबकीय विभाजक रैक पर 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रखकर नमूना गोली। सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  4. धोने बफर के 1 एमएल में मोती resuspended और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण. धीरे विंदुक EV बाध्य मोती resuspended करने के लिए.
  5. ट्यूब को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब चुंबकीय विभाजक रैक पर रखें और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करें। पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और मोती aspirating से बचने के लिए एक P200 विंदुक का प्रयोग करें.
  6. धोने बफर के 1 एमएल के साथ मोती धो लें. मोतियों को सूखने से रोकने के लिए सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेटिंग के तुरंत बाद बफर जोड़ें।
  7. कमरे के तापमान पर फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 1 एमएल के साथ मोती 2x धो लें।
  8. कमरे के तापमान पर 10 मिन के लिए हौसले से तैयार 100 एमएम ट्राइथाइलामाइन के 100 माइक्रोन के साथ मोतियों को इनक्यूबेट करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब चुंबकीय विभाजक रैक का उपयोग करके ईवीएस युक्त एल्यूटेड समाधान इकट्ठा करें।
    नोट: 100 एमएम ट्राइथाइलामाइन के 1 एमएल तैयार करने के लिए, पानी में ट्राइथाइलमाइन समाधान के 14 माइक्रोन को पतला करें।
  9. चरण 2.8 को दोहराएं और एल्यूटेड समाधानों को मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र सांद्रक का उपयोग कर eluate सूखी.
    नोट: प्रयोग यहाँ रोका जा सकता है. सूखे ईवी नमूनों को निम्नलिखित चरणों या परिणामों पर प्रतिकूल प्रभाव के बिना कई महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा ईवीएस की विशेषता

  1. सूखे ईवी नमूने के 5% (मूत्र नमूने के 0.5 एमएल के बराबर) को 1x लिथियम डोडेसिल सल्फेट (एलडीएस) नमूना बफर के 20 माइक्रोन में 10 एमएम डाइथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) के साथ फिर से निलंबित करें।
    नोट: मूत्र के 0.5 एमएल से ईवीएस पश्चिमी सोख्ता में सीडी 9 (एक ईवी मार्कर24) सिग्नल का पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं।
  2. 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना उबालें। एक polyacrylamide जेल पर नमूना लोड और वैद्युतकणसंचलन और immunoblotting निम्नलिखित मानक प्रोटोकॉल25.
  3. एक कम प्रतिदीप्ति polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरित करने के बाद, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए tris-buffered खारा tween-20 (TBST) में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ झिल्ली ब्लॉक. टीबीएसटी बफर के 1 एल तैयार करने के लिए, 19 एमएम ट्रिस बेस, 137 एमएम एनएसीएल, और ट्वीन -20 के 1 एमएल जोड़ें; एचसीएल का उपयोग करके पीएच को 7.4 तक समायोजित करें।
  4. खरगोश विरोधी सीडी 9 एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को 1: 5,000 अनुपात में टीबीएसटी में 1% बीएसए में 4 डिग्री सेल्सियस रात भर या कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. टीबीएसटी के साथ प्रत्येक 5 मिन के लिए झिल्ली 3x धोएं। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएसटी में 1% बीएसए में 1:5000 अनुपात में एंटी-खरगोश आईजीजी, एचआरपी से जुड़े माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  6. टीबीएसटी के साथ प्रत्येक 5 मिन के लिए झिल्ली 3x धोएं। झिल्ली पर व्यावसायिक रूप से प्राप्त बढ़ाया chemiluminescence (ईसीएल) सब्सट्रेट (1: 1 अनुपात) जोड़ें और एक chemiluminescence इमेजिंग सिस्टम पर संकेतों का पता लगाने.

4. प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करना

  1. 12 एमएम सोडियम डीऑक्सीकोलेट (एसडीसी), 12 एमएम सोडियम लॉरॉयल सरकोसिनेट (एसएलएस), 100 एमएम ट्राइथाइलमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (टीईएबी), 10 एमएम ट्रिस- (2-कार्बोक्साइथिल) फॉस्फीन (टीसीईपी), 40 एमएम क्लोरोएसेटामाइड (सीएए), और 1x फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल युक्त ताजा लाइसिस बफर तैयार करें।
    नोट: स्टॉक समाधान सामग्री की तालिका के विवरण में सूचीबद्ध हैं। लाइसिस बफर आवश्यक मात्रा के आधार पर वांछित सांद्रता प्राप्त करने के लिए स्टॉक समाधान जोड़कर तैयार किया जाता है।
  2. सूखे ईवी नमूने को लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन में घुलनशील करें और 1,100 आरपीएम पर झटकों के साथ 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूना गर्म करें।
  3. कमरे के तापमान के लिए नमूना ठंडा करने के बाद, 50 मिमी टीईएबी के 400 माइक्रोन जोड़कर इसे पांच गुना पतला करें।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए परख किट का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें। खाली के रूप में 50 मिमी टीईएबी के साथ पांच गुना पतला लाइसिस बफर का उपयोग करें।
  5. 1:50 w/w एंजाइम-टू-प्रोटीन अनुपात में ट्रिप्सिन/लिस-सी मिश्रण जोड़ें और 1,100 आरपीएम पर झटकों के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं।
  6. नमूना अम्लीय करने के लिए 10% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  7. नमूनों में एथिल एसीटेट के 600 माइक्रोन जोड़ें और 2 मिन के लिए मिश्रण को भंवर करें।
  8. 20,000 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र और ऊपरी परत (कार्बनिक परत) को हटा दें। आकांक्षा के दौरान इंटरफ़ेस को परेशान करने से बचें।
  9. चरण 4.7-4.8 दोहराएं। एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र सांद्रक का उपयोग जलीय चरण सूखी.
  10. पेप्टाइड्स को अम्लीकृत करने के लिए 0.1% TFA के 200 μL में सूखे नमूने को फिर से निलंबित करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार C18 डिसाल्टिंग टिप का उपयोग करके नमूने को डीसाल्ट करें। 80% एसीटोनिट्राइल में 0.1% टीएफए के 200 माइक्रोन के साथ टिप की स्थिति, इसके बाद 0.1% टीएफए के 200 माइक्रोन के साथ 2x के बाद। अम्लीकृत पेप्टाइड नमूना टिप में लोड करें और फिर टिप 3x को 0.1% TFA के 200 माइक्रोन के साथ धो लें। 80% एसीटोनिट्राइल में 0.1% टीएफए के 200 माइक्रोन के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें।
  11. एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र सांद्रक का उपयोग कर eluate सूखी. प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए अलग से पेप्टाइड नमूने का 2% (मूत्र नमूने के 0.2 एमएल के बराबर) सूखा। फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए नमूने के बाकी (98%) का उपयोग करें।
  12. निर्माता के निर्देशों के अनुसार फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन किट का उपयोग करके नमूने से फॉस्फोपेप्टाइड्स को समृद्ध करें। संवर्धन के लिए नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
    1. लोडिंग बफर के 200 माइक्रोन में सूखे नमूने को फिर से निलंबित करें। नमूने में मोतियों के 50 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सख्ती से हिलाएं। 100 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए फ्रिटेड टिप और अपकेंद्रित्र के लिए मोतियों के साथ नमूना लोड करें।
    2. लोडिंग बफर के 200 माइक्रोन के साथ टिप धो लें, इसके बाद बफर 1 धोएं, फिर बफर 2 धोएं। 20 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए एक बार अपकेंद्रित्र करके और 100 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए एक बार अपकेंद्रित्र करके सभी तीन धोने के चरणों का प्रदर्शन करें।
    3. मोतियों के साथ टिप को एक नई ट्यूब में रखें ताकि एल्यूटेड फॉस्फोपेप्टाइड्स इकट्ठा हो सकें। टिप करने के लिए क्षालन बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें और 20 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए एक बार अपकेंद्रित्र 20 एक्स जी पर टिप और अपकेंद्रित्र के लिए एक और 50 माइक्रोन जोड़ें। 100 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए एक अंतिम बार अपकेंद्रित्र।
  13. एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र सांद्रक का उपयोग कर eluted phosphopeptides सूखी.

5. एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण

नोट: विभिन्न एलसी-एमएस / एमएस सिस्टम / सेटिंग्स और डेटा-अधिग्रहण विधियों, जैसे डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) का उपयोग किया जा सकता है।

  1. 0.1% फॉर्मिक एसिड (विलायक ए) में सूखे प्रोटिओम / फॉस्फोप्रोटोम नमूनों को फिर से निलंबित करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूने लोड करें।
  2. तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) प्रणाली के माध्यम से फंसे आयन-गतिशीलता समय-उड़ान एमएस में नमूनों को इंजेक्ट करें और पूर्व निर्धारित मानकीकृत कानाफूसी 40 नमूने प्रति दिन विधि का उपयोग करें। पेप्टाइड्स को 15 सेमी सी 18 कॉलम (75 माइक्रोन आंतरिक व्यास, 1.9 माइक्रोन कण आकार) पर अलग किया जाता है जैसा कि सामग्री की तालिका में उल्लेख किया गया है।
  3. प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए, 300-1200 m/z से फैले रैंप प्रति मास रेंज के साथ डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (dia-PASEF) अधिग्रहण विधि के साथ संयुक्त समानांतर संचय-सीरियल विखंडन का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें और 0.6-1.50 1/K0 से 1.38 s के चक्र समय के साथ।
  4. फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए, 1.38 एस के चक्र समय के साथ 400-1550 मीटर / जेड और 0.6-1.50 1 / के0 से फैले रैंप प्रति मास रेंज के साथ एक डाया-पीएएसईएफ अधिग्रहण विधि का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें।
  5. प्रोटिओमिक्स सॉफ़्टवेयर में कच्ची फ़ाइलों को लोड करें और लाइब्रेरी-मुक्त डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण वर्कफ़्लो का उपयोग करके सिग्नल निष्कर्षण, पहचान और मात्रा का ठहराव करें।
    1. खोज सेटिंग्स के लिए, होमो सेपियन्स डेटाबेस, ट्रिप्सिन / पी एंजाइमों के साथ विशिष्ट डाइजेस्ट प्रकार, 7 न्यूनतम पेप्टाइड लंबाई, 52 अधिकतम पेप्टाइड लंबाई, दो मिस्ड क्लीवेज, सिस्टीन में कार्बामिडोमिथाइल निश्चित संशोधन के रूप में, एसिटाइल प्रोटीन एन-टर्म, मेथिओनिन पर ऑक्सीकरण, और सेरीन, थ्रेओनीन और टायरोसिन (फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए) चर संशोधनों के रूप में, और 5 अधिकतम चर संशोधनों के रूप में उपयोग करें। एफडीआर को पीएसएम, पेप्टाइड और प्रोटीन समूह पर 0.01 पर सेट करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में स्पेक्ट्रोनॉट सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। अन्य DIA डेटा खोज सॉफ़्टवेयर जैसे DIA-NN और PEAKS भी आमतौर पर उपयोग किए जाते हैं। यदि डेटा डीडीए मोड में प्राप्त किया गया था, तो मैक्सक्वांट और प्रोटिओम डिस्कवरर जैसे सॉफ्टवेयर लागू होते हैं।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल ईवीएस के अलगाव से डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण(चित्रा 1)तक एक व्यापक वर्कफ़्लो प्रदर्शित करता है। तीन प्रतियों के मूत्र के नमूनों को ईवी आइसोलेशन के अधीन किया गया। पृथक ईवीएस को पश्चिमी सोख्ता की विशेषता थी और बाद में प्रोटीन निष्कर्षण, एंजाइमेटिक पाचन और पेप्टाइड सफाई सहित मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स नमूना तैयार करने के लिए संसाधित किया गया था। फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए, फॉस्फोपेप्टाइड्स को धातु आयन-कार्यात्मक घुलनशील नैनोपॉलिमर के आधार पर और समृद्ध किया गया था। पेप्टाइड और फॉस्फोपेप्टाइड दोनों नमूनों का विश्लेषण डेटा-स्वतंत्र मोड के तहत उच्च-रिज़ॉल्यूशन आयन गतिशीलता मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा किया गया था। परिणाम कच्ची फाइलों को होमो सेपियन्स डेटाबेस के खिलाफ खोजा गया था, और पहचान और एमएस 2-स्तरीय परिमाणीकरण के लिए पुस्तकालय-मुक्त डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण वर्कफ़्लो किया गया था।

पृथक ईवीएस को चिह्नित करने और रिकवरी उपज का अनुमान लगाने के लिए, हमने पहले ईवी मार्कर सीडी9(चित्रा 2ए)का पता लगाने के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए जेल पर ईवीएस युक्त मूत्र के 0.5 एमएल के बराबर लोड किया। इसके अलावा, हमने तुलना के लिए ईवी अलगाव, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (डीयूसी) के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि का उपयोग करके मूत्र की समान मात्रा से अलग किए गए ईवीएस को शामिल किया। परिणामों से पता चला कि EVtrap DUC की तुलना में बहुत अधिक CD9 सिग्नल उत्पन्न करने में सक्षम था, जो मोतियों द्वारा EVs के प्रभावी कैप्चर का संकेत देता है। प्रत्येक सीडी 9 बैंड सिग्नल के लिए आगे मात्रात्मक मूल्यों ने प्रदर्शित किया कि ईवीट्रैप ने प्रत्यक्ष मूत्र नियंत्रण की 5 गुना तीव्रता की तुलना में ~ 99% की वसूली उपज हासिल की, जबकि डीयूसी केवल ~ 1.5% ईवीएस (चित्रा 2बी) बरामद किया।

प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग के लिए एलसी-एमएस/एमएस पर प्रत्येक नमूने का 2% लोड करके, हमने ~ 2,200 अद्वितीय प्रोटीन(चित्रा 3ए)से > 11,000 अद्वितीय पेप्टाइड्स की पहचान की, यह दर्शाता है कि यह वर्कफ़्लो ईवी प्रोटिओम का गहन कवरेज प्रदान करता है। नमूनों में प्रोटीन पहचान में ओवरलैप की एक उच्च डिग्री देखी गई, जिसमें 72% अद्वितीय प्रोटीन लगातार तीनों प्रतिकृतियों(चित्रा 3बी)में पहचाने गए। इसके अलावा, हम एक्सोकार्टा डेटाबेस (चित्रा 3 सी)26के साथ पहचान परिणामों की तुलना की. विशेष रूप से, शीर्ष 100 ईवी मार्करों और प्रोटीनों में से, हमने इन ईवी प्रोटीनों में से ~ 90 की सफलतापूर्वक पहचान की, इस प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के माध्यम से ईवी प्रोटीन की निष्पक्ष और पूर्ण रूपरेखा का सुझाव दिया। मात्रात्मक परिशुद्धता का आकलन करने के लिए, हमने प्रोटीन मात्रा का ठहराव परिणाम(चित्रा 3डी)के लिए भिन्नता (सीवी) के गुणांक के वितरण का मूल्यांकन किया। एक कम मध्यम सीवी (5.7%) प्रक्रिया की उच्च प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता को इंगित करता है, जिसमें ईवी अलगाव, नमूना तैयार करना और एमएस का पता लगाना शामिल है।

फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए, हमने फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन के लिए प्रत्येक पेप्टाइड नमूने का 98% उपयोग किया और ~ 350 अद्वितीय फॉस्फोप्रोटीन(चित्रा 4ए)के अनुरूप ~ 800 अद्वितीय फॉस्फोपेप्टाइड्स की पहचान की। संवर्धन क्रमशः 72% फॉस्फोसेरिन (पीएस) पेप्टाइड्स, 22% फॉस्फोथ्रियोनिन (पीटी), और 6% फॉस्फोटीरोसिन (पीवाई) पेप्टाइड्स, क्रमशः (चित्रा 4बी) का औसत प्राप्त हुआ। तीन प्रतिकृतियों की पहचान प्रजनन क्षमता के संदर्भ में, 42% फॉस्फोपेप्टाइड्स की पहचान सभी तीन विश्लेषणों द्वारा की गई थी, और हर दो विश्लेषणों(चित्रा 4सी)के बीच ~ 50% ओवरलैप था। 21.8% का एक मध्यम सीवी फॉस्फोपेप्टाइड्स की मात्रा का ठहराव के लिए निर्धारित किया गया था, इस प्रोटोकॉल(चित्रा 4डी)का उपयोग करके एक स्वीकार्य मात्रात्मक प्रजनन क्षमता का सुझाव देता है।

Figure 1
चित्रा 1: मूत्र बाह्य पुटिका (ईवी) और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। ईवीएस को बाह्य पुटिकाओं की कुल वसूली और शुद्धि (ईवीट्रैप) दृष्टिकोण के माध्यम से मूत्र के नमूनों से अलग किया जाता है, और पृथक ईवीएस सीधे पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के अधीन होते हैं। एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए, प्रोटीन को ईवीएस से निकाला जाता है और पेप्टाइड्स में पचाया जाता है। सफाई चरणों के बाद पेप्टाइड नमूनों का उपयोग प्रोटिओमिक्स विश्लेषण या फॉस्फोप्रोपेप्टाइड संवर्धन के बाद फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स दोनों नमूनों का विश्लेषण एलसी-एमएस / एमएस द्वारा किया जाता है। पहचान और मात्रा का ठहराव तब डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआईए) वर्कफ़्लो विधि का उपयोग करके किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पश्चिमी सोख्ता द्वारा पृथक ईवीएस की विशेषता। (ए) प्रत्यक्ष मूत्र नमूने (एन = 1) के 0.1 एमएल से ईवी मार्कर सीडी 9 का पता लगाना, ईवीएस को अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन (डीयूसी) दृष्टिकोण (एन = 3) का उपयोग करके अलग किया गया, और ईवीएस को ईवीट्रैप दृष्टिकोण (एन = 3) का उपयोग करके अलग किया गया। (बी)(ए) में पश्चिमी सोख्ता संकेतों की मात्रा का ठहराव प्रत्यक्ष मूत्र नमूना (5 गुना तीव्रता = 100%) के सापेक्ष प्रतिशत वसूली के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। DUC और EVtrap नमूनों के लिए, बार प्लॉट ट्रिप्लिकेट्स से औसत तीव्रता और मानक विचलन (त्रुटि सलाखों द्वारा प्रतिनिधित्व) प्रदर्शित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पृथक ईवीएस के प्रोटिओमिक्स विश्लेषण । (ए) तीन प्रतियों में पहचाने गए अद्वितीय प्रोटीन और पेप्टाइड्स की कुल संख्या। (बी) वेन आरेख प्रतिकृतियों के बीच पहचाने गए अद्वितीय प्रोटीन में ओवरलैप दिखा रहा है। (C) एक्सोकार्टा डेटाबेस में शीर्ष 100 EV मार्करों के अनुरूप पहचाने गए अद्वितीय प्रोटीनों की संख्या। (डी) घनत्व प्लॉट प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए भिन्नता के गुणांक (सीवी) के वितरण को दर्शाता है। औसत सीवी मूल्य को लाल धराशायी रेखा के साथ हाइलाइट किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पृथक ईवीएस के फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण । (ए) ट्रिप्लिकेट्स में पहचाने गए अद्वितीय फॉस्फोप्रोटीन और फॉस्फोपेप्टाइड्स की कुल संख्या। (बी) फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन के बाद पीएसटीवाई पेप्टाइड्स की प्रतिशत संरचना। (सी) वेन आरेख प्रतिकृतियों के बीच पहचाने गए अद्वितीय फॉस्फोपेप्टाइड्स में ओवरलैप दिखा रहा है। (डी) घनत्व प्लॉट फॉस्फोपेप्टाइड मात्रा के लिए सीवी के वितरण को दर्शाता है। औसत सीवी मूल्य को लाल धराशायी रेखा के साथ हाइलाइट किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ईवीएस में कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन और फॉस्फोप्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रभावी ईवी अलगाव एक आवश्यक शर्त है। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए कई तरीकों के विकास के बावजूद, बहुमत अभी भी खराब वसूली या कम प्रजनन क्षमता जैसी सीमाओं से पीड़ित है, जो बड़े पैमाने पर अध्ययन और नियमित नैदानिक सेटिंग्स में उनके उपयोग को बाधित करता है। DUC को आमतौर पर EV अलगाव के लिए सबसे आम तरीका माना जाता है, और अतिरिक्त धुलाई चरणों को सामान्य रूप से लक्ष्य EVs27,28 की शुद्धता बढ़ाने में मदद करने के लिए लागू किया जाता है। यह प्रक्रिया अधिक थकाऊ और समय लेने वाली DUC प्रक्रिया की ओर ले जाती है (> 6 घंटे)। इसके अलावा, डीयूसी के बाद कम ईवी रिकवरी उपज कई अध्ययनों, 29,30 द्वारा रिपोर्ट की गई है और चित्र 2 में परिणामों में दिखाया गया है। इसकी तुलना में, EVtrap कुशल EV अलगाव (< 1 h) और एक उच्च पुनर्प्राप्ति उपज(चित्र 2)प्रदान करता है। विशेष रूप से, इस वर्कफ़्लो का सफल अनुप्रयोग विभिन्न बीमारियों और कैंसर के लिए महत्वपूर्ण ईवी मार्करों की पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण प्रगति को चिह्नित करता है 19,21,22 हालांकि, ईवीट्रैप ईवीएस की विशिष्ट उप-जनसंख्या, जैसे माइक्रोवेसिकल्स या एक्सोसोम को अलग करने में असमर्थ है, क्योंकि यह पूरी ईवी आबादी को पकड़ लेता है।

इस प्रोटोकॉल में, हमने प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए पेप्टाइड नमूने के 2% और 98% का उपयोग किया। चूंकि EVtrap द्वारा मूत्र के 10 एमएल से अलग किए गए ईवीएस आमतौर पर कुल प्रोटीन के 100-200 μg का उत्पादन करते हैं, पाचन और सफाई के बाद पेप्टाइड्स का 98% फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन के लिए पर्याप्त है। यदि एक लेबलिंग कदम, जैसे अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग (टीएमटी) लेबलिंग, मात्रात्मक एमएस विश्लेषण के लिए आवश्यक है, तो डिसाल्टिंग चरण के बाद पेप्टाइड एकाग्रता माप पेप्टाइड राशि को सामान्य करने औरपरिमाणीकरण 31 की सटीकता में सुधार करने के लिए किया जा सकता है।

जबकि यह प्रोटोकॉल मुख्य रूप से मूत्र ईवीएस को अलग करने के लिए ईवीट्रैप के उपयोग पर प्रकाश डालता है, यह उल्लेख करना उल्लेखनीय है कि इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा विभिन्न नमूना प्रकारों32,33,34के प्रसंस्करण में प्रदर्शित की गई है। पिछले परिणामों के आधार पर, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की जाने वाली शर्त सेल कल्चर मीडिया से ईवीएस को अलग करने के लिए लागू थी। सेल-स्रावित ईवीएस के अलगाव के लिए, कोशिकाओं को भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) -मुक्त या ईवी-समाप्त एफबीएस स्थितियों के तहत खेती की जाती है ताकि सेल-स्रावित ईवीएस के साथ अत्यधिक एफबीएस-व्युत्पन्न ईवीएस के सह-अलगाव को रोका जा सके, जो परिणामों की विश्वसनीयता को कमजोर करेगा35. इसके अतिरिक्त, अन्य नमूना प्रकारों से पृथक ईवीएस को सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81, ट्यूमर संवेदनशीलता जीन 101 प्रोटीन (टीएसजी 101), और एएलजी -2-इंटरैक्टिंग प्रोटीन एक्स (ALIX) 36 सहित कई सामान्य ईवी मार्करों का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण की विशेषता हो सकती है।

एमएस विश्लेषण में कवरेज बढ़ाने और परिमाणीकरण में सुधार करने के लिए, डीआईए डेटा की खोज के लिए एक परियोजना-विशिष्ट पुस्तकालय का निर्माण एक वैकल्पिक विकल्प है। डीआईए मोड में उत्पादित स्पेक्ट्रा की जटिलता के कारण, एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय जिसमें संदर्भ स्पेक्ट्रा का संग्रह होता है, पहचान आत्मविश्वास बढ़ाने और कवरेज में सुधार के लिए फायदेमंद होता है। उच्च गुणवत्ता वाले वर्णक्रमीय पुस्तकालयों एक ही नमूने या पूर्व अंशनमूनों 37 पर डीडीए विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. पुस्तकालय भी dia-PASEF के लिए इष्टतम खिड़कियों का निर्धारण और आगे पहचान38 में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

एक साथ लिया गया, प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए मूत्र के नमूनों से ईवीएस को अलग करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को लागू करके, हम प्रारंभिक चरण की बीमारी का पता लगाने और अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए बायोमार्कर के रूप में कम प्रचुर मात्रा में ईवी प्रोटीन और फॉस्फोप्रोटीन का बेहतर पता लगाने की उम्मीद करते हैं। इसके अलावा, शोधकर्ताओं के पास ईवी अनुसंधान के क्षेत्र को आगे बढ़ाने और बेहतर नैदानिक और चिकित्सीय रणनीतियों में योगदान करने का शानदार अवसर है।

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Disclosures

लेखक एक प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित की घोषणा करते हैं। एंटोन इलियुक और डब्ल्यू एंडी ताओ टायमोरा एनालिटिकल ऑपरेशंस के सह-संस्थापक हैं, जिन्होंने ईवीट्रैप मोती और वाणिज्यिक पॉलीमैक फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन किट विकसित की है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान 3RF1AG064250 और R44CA239845 द्वारा आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Life Science Products M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1005
15 mL conical centrifuge tube Corning  352097
15 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074P2
Benchtop incubated shaker Bioer DIS-87999-3367802 Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13403S
Chloroacetamide Sigma -Aldrich C0267-100G Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate  Fisher Scientific  E145-4 Precipitates detergents
Evosep One  Evosep Liquid chromatography system
Evotips Evosep EV2013 Sample loading for Evosep One system 
EVtrap Tymora Analytical Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF Membrane Sigma -Aldrich IPFL00010 Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen NP0322BOX Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
PBS ThermoFisher 10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 Bruker  1893473 Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma -Aldrich P5726-5ML 100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Sigma -Aldrich P0044-1ML 100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit Tymora Analytical Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate  Sigma -Aldrich D6750-10G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate  Sigma -Aldrich L9150-50G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT Bruker Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips  Glygen TT2C18.96 Desalting method
Triethylamine Sigma -Aldrich 471283-100ML For EV elution. 
Triethylammonium bicabonate buffer Sigma -Aldrich T7408-100ML 1 M
Trifluoroacetic acid Sigma -Aldrich 302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma -Aldrich C4706 Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX ThermoFisher PIA41007

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References

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रासायनिक आत्मीयता आधारित अलगाव बाह्य पुटिकाओं बायोफ्लुइड्स प्रोटिओमिक्स विश्लेषण फॉस्फोप्रोटोमिक्स विश्लेषण तरल बायोप्सी पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों फॉस्फोराइलेशन सेलुलर फ़ंक्शंस रोग की शुरुआत रोग प्रगति अलगाव के तरीके चुंबकीय मोती मानव मूत्र डाउनस्ट्रीम विश्लेषण रिकवरी यील्ड मूत्र ईवीएस संवेदनशील प्रोफाइल प्रोटिओम फॉस्फोप्रोटिओम तकनीकी विचार
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Liu, Y. K., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, W. A. Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65844, doi:10.3791/65844 (2023).

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