Summary
本プロトコルは、機能化された磁気ビーズを利用して尿中細胞外小胞を効率的に隔離するための詳細な説明を提供します。さらに、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、リン酸化プロテオミクスなどのその後の分析も網羅しています。
Abstract
生体液由来の細胞外小胞(EV)は、近年、リキッドバイオプシーの分野で大きな注目を集めています。ほぼすべての種類の細胞から放出され、宿主細胞のリアルタイムスナップショットを提供し、細胞機能や疾患の発症および進行の主要なプレーヤーとして、タンパク質、特にリン酸化などの翻訳後修飾(PTM)を持つタンパク質を含む豊富な分子情報が含まれています。しかし、現在のEV単離法では収率や不純物が少ないため、生体液からのEVの単離は依然として困難であり、EVリン酸化タンパク質などのEV貨物の下流分析は困難です。ここでは、ヒト尿などの生体液からのEV単離のための官能基化磁気ビーズに基づく迅速で効果的なEV単離法と、EV単離後の下流プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析について説明します。このプロトコルにより、尿中EVの高い回収率と、EVプロテオームおよびリン酸化プロテオームの高感度プロファイルが可能になりました。さらに、このプロトコルの汎用性と関連する技術的考慮事項についてもここで説明します。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、あらゆる種類の細胞から分泌される膜内包ナノ粒子であり、血液、尿、唾液などの体液中に存在します1,2,3,4。EVは、宿主細胞の生理学的および病理学的状態を反映する多様な生理活性分子の貨物を運んでいるため、疾患の進行における重要な要因として機能します4,5,6。さらに、広範な研究により、症状の発症または腫瘍の生理学的検出の前に、EVベースの疾患マーカーを特定できることが確立されています5,6,7。
リン酸化は、細胞のシグナル伝達と調節における重要なメカニズムとして作用します。したがって、リン酸化タンパク質は、異常なリン酸化イベントが細胞シグナル伝達経路の調節不全や癌などの転移性疾患の発症と関連しているため、バイオマーカー発見のための貴重な情報源を提供します8,9,10。リン酸化動態のプロファイリングにより、疾患特異的なリン酸化タンパク質シグネチャーを潜在的なバイオマーカーとして同定することができますが、リン酸化タンパク質の存在量が少なく、動的な性質は、バイオマーカーとしてのリン酸化タンパク質の開発において大きな課題となっています11,12。特に、EV内に内包された低存在量のリン酸化タンパク質は、細胞外環境での外部酵素消化から保護されています8。したがって、EVおよびEV由来のリン酸化タンパク質は、がんやその他の疾患の早期発見におけるバイオマーカー発見の理想的な情報源となります。
EVにおけるタンパク質のリン酸化の解析は、がんのシグナル伝達と早期疾患診断を理解するための貴重なリソースを提供しますが、効率的なEV分離法の欠如が大きな障壁となっています。EVの絶縁は、通常、差動超遠心分離(DUC)によって実現されます13。しかし、この方法は時間がかかり、スループットが低く再現性が低いため、臨床的な意味合いには適していません13,14。ポリマー誘起沈殿15などの代替EV単離アプローチは、非EVタンパク質の共沈による特異性の低さによって制限される。抗体ベースのアフィニティー捕捉16 やアフィニティー濾過17 などのアフィニティーベースのアプローチは、特異性を高めますが、容量が少ないため、回収率が比較的低く制限されます。
EVのリン酸化蛋白質動態を探る上での課題を解決するため、当グループでは、EVを機能性磁気ビーズに捕捉する化学的親和性に基づく細胞外小胞全回収精製(EVtrap)技術を開発しました18。これまでの結果から、この磁気ビーズベースのEV分離法は、幅広い生体液サンプルからEVを分離するのに非常に効果的であり、DUCや他の既存の分離方法と比較して、汚染を最小限に抑えながらはるかに高いEV収率を達成できることが実証されています18,19。私たちは、EVtrapと私たちのグループによって開発されたチタンベースのリン酸化ペプチド濃縮法を利用することに成功しました20 多様な生体液に由来するEVのリン酸化プロテオームをプロファイリングし、さまざまな疾患の潜在的なリン酸化タンパク質バイオマーカーを検出します19,21,22。
ここでは、流通するEVを分離するためのEVtrapに基づくプロトコルを紹介します。このプロトコルは、尿路EVに焦点を当てています。また、ウェスタンブロッティングを用いた絶縁型EVの特性評価についても実証しています。次に、プロテオミクス分析とリン酸化プロテオミクス分析の両方のためのサンプル調製と質量分析(MS)取得について詳しく説明します。このプロトコルは、尿中EVプロテオームとリン酸化プロテオームをプロファイリングするための効率的で再現性のあるワークフローを提供し、EVとその臨床応用に関するさらなる研究を促進します23。
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Protocol
すべての尿サンプルは、インフォームドコンセント後に健康な個人から収集されました。実験は、ヒトサンプルを含むすべての倫理基準に準拠しており、パデュー大学ヒト研究保護プログラムのガイドラインに準拠しています。
1. 検体採取
- 15 mLのコニカル遠心チューブで12 mLの尿サンプルを2,500 x g、4°Cで10分間遠心分離し、細胞の破片や大きなアポトーシス体を除去します。
- 上清 10 mL を新しい 15 mL チューブに移し、EV 単離を進めます。
注:プロトコルはここで一時停止でき、サンプルは-80°Cで保存し、使用時に37°Cで解凍できます。
2. EVtrapアプローチによるEV絶縁
- メーカーの指示に従って、0.5 mLのローディングバッファー(1:10 v/v比)と100 μLのEVtrapビーズスラリー(1:50 v/v比)をサンプルに加えます。
- サンプルを端から端まで回転させて、室温で30分間インキュベートします。
- 15 mLのコニカルチューブを磁気セパレーターラックに置いて、サンプルをペレット化します。上澄みを取り除きます。
- ビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。ピペットで静かに動かし、EVバウンドビーズを再懸濁します。
- チューブを1.5 mLの微量遠心チューブの磁気セパレーターラックに置き、上清を吸引します。P200ピペットを使用して上清を完全に吸引し、ビーズを吸引しないようにします。
- ビーズを1 mLの洗浄バッファーで洗浄します。上澄み液を吸引した直後に緩衝液を添加し、ビーズの乾燥を防ぎます。
- ビーズを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で室温で2回洗浄します。
- ビーズを調製したばかりの100 mMトリエチルアミン100 μLと室温で10分間インキュベートし、1.5 mLの微量遠心チューブ磁気セパレーターラックを使用してEVを含む溶出溶液を回収します。
注:1 mL の 100 mM トリエチルアミンを調製するには、14 μL のトリエチルアミン溶液を水で希釈します。 - ステップ 2.8 を繰り返して、溶出した溶液を混合します。4°Cの真空遠心濃縮機を使用して溶出液を乾燥させます。
注: 実験はここで一時停止できます。乾燥したEVサンプルは、-80°Cで数ヶ月間保存でき、次のステップや結果に悪影響を与えることはありません。
3. ウェスタンブロッティングによるEVの特性評価
- 乾燥した EV サンプルの 5%(尿サンプル 0.5 mL に相当)を、10 mM ジチオスレイトール(DTT)を含む 1x ドデシル硫酸リチウム(LDS)サンプルバッファー 20 μL に再懸濁します。
注:0.5 mLの尿からのEVは、ウェスタンブロッティングでCD9(EVマーカー24)シグナルを検出するのに十分です。 - サンプルを95°Cで5分間煮沸します。 サンプルをポリアクリルアミドゲルにロードし、標準プロトコル25に従って電気泳動とイムノブロッティングを行います。
- タンパク質を低蛍光ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに転写した後、トリス緩衝生理食塩水トゥイーン-20(TBST)中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)でメンブレンを室温で1時間ブロックします。TBST バッファー 1 L を調製するには、19 mM トリス塩基、137 mM NaCl、および 1 mL の Tween-20 を加えます。HClを使用してpHを7.4に調整します。
- ウサギ抗CD9抗体を1:5,000の比率で1%BSAのTBSTで4°Cで一晩、または室温で2時間インキュベートします。
- メンブレンをTBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。メンブレンを抗ウサギIgG、HRP結合二次抗体と1:5000の比率でTBST中の1%BSAで室温で1時間インキュベートします。
- メンブレンをTBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。市販の増強化学発光(ECL)基質(1:1の比率)をメンブレンに添加し、化学発光イメージングシステムでシグナルを検出します。
4. プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のためのサンプル調製
- 12 mM デオキシコール酸ナトリウム(SDC)、12 mM ラウロイルサルコシンナトリウム(SLS)、100 mM 重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー(TEAB)、10 mM トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、40 mM クロロアセトアミド(CAA)、およびホスファターゼ阻害剤カクテル 1 個を含む新鮮な溶解バッファーを調製します。
注:ストック溶液は、 材料表の説明に記載されています。溶解緩衝液は、必要な容量に応じて所望の濃度になるようにストック溶液を添加することによって調製されます。 - 乾燥したEVサンプルを100 μLの溶解緩衝液に可溶化し、1,100rpmで振とうしながらサンプルを95°Cで10分間加熱します。
- サンプルを室温まで冷却した後、400 μL の 50 mM TEAB を添加して 5 倍に希釈します。
- 製造元の指示に従って、BCAアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定します。50 mM TEAB で 5 倍に希釈した溶解バッファーをブランクとして使用します。
- 酵素とタンパク質の比率が1:50 w/wのトリプシン/Lys-Cミックスを添加し、サンプルを37°Cで一晩インキュベートし、1,100rpmで振とうします。
- 50 μL の 10% トリフルオロ酢酸(TFA)を添加してサンプルを酸性化します。
- 600 μL の酢酸エチルをサンプルに加え、混合物を 2 分間ボルテックスします。
- サンプルを20,000 x g で3分間遠心分離し、上層(有機層)を除去します。吸引中に界面を乱さないようにしてください。
- 手順4.7〜4.8を繰り返します。真空遠心濃縮機を使用して水相を乾燥させます。
- 乾燥したサンプルを 200 μL の 0.1% TFA に再懸濁してペプチドを酸性化し、メーカーの指示に従って C18 脱塩チップを使用してサンプルを脱塩します。チップを 200 μL の 0.1% TFA 含有 80% アセトニトリルでコンディショニングし、続いて 200 μL の 0.1% TFA で 2 回コンディショニングします。酸性化したペプチドサンプルをチップにロードし、200 μL の 0.1% TFA でチップを 3 回洗浄します。200 μL の 0.1% TFA 含有 80% アセトニトリルでペプチドを溶出します。
- 真空遠心濃縮機を使用して溶出液を乾燥させます。プロテオミクス解析のために、ペプチドサンプルの2%(尿サンプル0.2 mLに相当)を別々に乾燥させます。サンプルの残り(98%)をリン酸化プロテオミクス分析に使用します。
- 製造元の指示に従って、リン酸化ペプチド濃縮キットを使用してサンプルからリン酸化ペプチドを濃縮します。エンリッチメントについては、以下で説明する手順を実行します。
- 乾燥したサンプルを200 μLのローディングバッファーに再懸濁します。50 μLのビーズをサンプルに加え、室温で20分間激しく振とうします。ビーズを含むサンプルをフリットチップにロードし、100 x gで1分間遠心分離します。
- チップを 200 μL のローディングバッファーで洗浄し、続いて洗浄バッファー 1、洗浄バッファー 2 の順に洗浄します。20 x g で 2 分間、100 x g で 1 分間遠心分離して、3 つの洗浄ステップをすべて実行します。
- ビーズの入ったチップを新しいチューブに入れて、溶出したリン酸化ペプチドを回収します。チップに溶出バッファー50 μLを加え、20 x gで2分間遠心分離します 。 さらに50 μLの溶出バッファーをチップに加え、20 x gで2分間遠心分離します。最後にもう一度、100 x gで1分間遠心分離します。
- 溶出したリン酸化ペプチドを真空遠心濃縮機で乾燥させます。
5. LC-MS/MS分析
注:さまざまな LC-MS/MS システム/設定、およびデータ依存性取得(DDA)などのデータ取得方法を使用できます。
- 乾燥したプロテオーム/リン酸化プロテオームサンプルを0.1%ギ酸(溶媒A)に再懸濁し、メーカーの指示に従ってサンプルをロードします。
- 液体クロマトグラフィー(LC)システムを介してトラップイオンモビリティー飛行時間型 MS にサンプルを注入し、プリセットの標準化された Whisper 40 サンプル/日メソッドを使用します。ペプチドは、 材料表に記載されているように、15 cm の C18 カラム(内径 75 μm、粒子径 1.9 μm)で分離されます。
- プロテオミクス解析では、300-1200 m/z、0.6-1.50 1/K0 のランプあたりの質量範囲で、サイクルタイム 1.38 秒のパラレルアキュムレーションシリアルフラグメンテーションとデータ非依存取得(dia-PASEF)取得法を組み合わせてデータを取得します。
- リン酸化プロテオミクス解析では、400-1550 m/z および 0.6-1.50 1/K0 のランプあたりの質量範囲で dia-PASEF 取得法を使用し、サイクルタイムは 1.38 秒でデータを取得します。
- 生ファイルをプロテオミクスソフトウェアにロードし、ライブラリフリーのデータに依存しない取り込みワークフローを使用して、シグナルの抽出、同定、定量を行います。
- 検索設定には、 ホモ・サピエン スデータベース、トリプシン/P酵素を含む特定の消化物タイプ、7つの最小ペプチド長、52の最大ペプチド長、2つの切断ミス、固定修飾としてのシステインでのカルバミドメチル、アセチルタンパク質Nターム、メチオニンでの酸化、およびセリン、スレオニン、チロシンでのリン酸化(リン酸化プロテオミクス分析用)、および最大可変修飾として5を使用します。PSM、ペプチド、およびタンパク質群におけるFDRを0.01に設定します。
注:このプロトコルでは、Spectronautソフトウェアが使用されました。DIA-NNやPEAKSなどの他のDIAデータ検索ソフトウェアも一般的に使用されています。DDAモードでデータを取得した場合は、MaxQuantやProteome Discovererなどのソフトウェアが該当します。
- 検索設定には、 ホモ・サピエン スデータベース、トリプシン/P酵素を含む特定の消化物タイプ、7つの最小ペプチド長、52の最大ペプチド長、2つの切断ミス、固定修飾としてのシステインでのカルバミドメチル、アセチルタンパク質Nターム、メチオニンでの酸化、およびセリン、スレオニン、チロシンでのリン酸化(リン酸化プロテオミクス分析用)、および最大可変修飾として5を使用します。PSM、ペプチド、およびタンパク質群におけるFDRを0.01に設定します。
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Representative Results
このプロトコールは、EVの単離から下流のプロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析までの包括的なワークフローを実証します(図1)。三重の尿サンプルはEV分離にかけられた。単離されたEVは、ウェスタンブロッティングによって特徴付けられ、その後、タンパク質抽出、酵素消化、ペプチドクリーンアップなどの質量分析ベースのプロテオミクスサンプル調製のために処理されました。リン酸化プロテオミクス分析では、金属イオンで機能化された可溶性ナノポリマーに基づいて、リン酸化ペプチドをさらに濃縮しました。ペプチドサンプルとリン酸化ペプチドサンプルの両方を、データ非依存モードで高分解能イオンモビリティー質量分析により分析しました。結果の生ファイルを ホモ・サピエンス ・データベースと照合し、同定とMS2レベルの定量のために、ライブラリフリーのデータに依存しない取得ワークフローを実行しました。
単離されたEVの特性評価と回収率の推定のために、まずEVを含む尿相当量0.5 mLをゲルにロードしてウェスタンブロッティングを行い、EVマーカーCD9を検出しました(図2A)。さらに、比較のために、EV分離に最も使用されている方法である示差超遠心分離(DUC)を使用して、同じ量の尿から分離されたEVを含めました。その結果、EVtrapはDUCよりもはるかに高いCD9シグナルを生成できることが示され、ビーズによるEVの効果的な捕捉が示されました。各CD9バンドシグナルのさらなる定量値により、EVtrapは直接尿コントロールの5倍の強度と比較して~99%の回収率を達成したのに対し、DUCはEVの~1.5%しか回収しないことが実証されました(図2B)。
プロテオミクスプロファイリングのために各サンプルの 2% を LC-MS/MS にロードすることで、~2,200 のユニークなタンパク質から 11,000 >ユニークなペプチドを同定し(図 3A)、このワークフローが EV プロテオームを詳細にカバーしていることが示されました。サンプル間でタンパク質の同定に高い重複が観察され、3 つの繰り返しすべてで固有のタンパク質の 72% が一貫して同定されました(図 3B)。さらに、同定結果をExoCartaデータベース(図3C)26と比較した。特に、上位100のEVマーカーとタンパク質のうち、これらのEVタンパク質のうち~90の同定に成功しており、このプロテオミクス解析を通じてEVタンパク質の偏りのない完全なプロファイリングを示唆しています。定量精度を評価するために、タンパク質定量結果の変動係数(CV)の分布をさらに評価しました(図3D)。中程度のCVが低い(5.7%)ことは、EV単離、サンプル調製、MS検出など、手順の再現性と信頼性が高いことを示しています。
リン酸化プロテオミクス分析では、各ペプチドサンプルの 98% をリン酸化ペプチド濃縮に使用し、~350 の固有のリン酸化タンパク質に対応する ~800 の固有のリン酸化ペプチドを同定しました(図 4A)。濃縮により、平均72%のホスホセリン(pS)ペプチド、22%のホスホスレオニン(pT)、6%のホスホチロシン(pY)ペプチドが得られました(図4B)。3 つの複製の同定再現性に関しては、リン酸化ペプチドの 42% が 3 つの分析すべてで同定され、2 つの分析ごとに ~50% の重複がありました(図 4C)。リン酸化ペプチドの定量について中程度の CV が 21.8% と測定され、このプロトコルを使用した定量再現性が許容できることが示唆されました(図 4D)。
図1:尿中細胞外小胞(EV)の単離と下流分析に使用される概略ワークフロー。 EVは、細胞外小胞全回収精製(EVtrap)アプローチによって尿サンプルから単離され、単離されたEVはウェスタンブロッティング分析に直接かけられます。LC-MS/MS 分析では、EV からタンパク質を抽出し、ペプチドに消化します。クリーンアップステップ後のペプチドサンプルは、リン酸化ペプチド濃縮後のプロテオミクス分析またはリン酸化プロテオミクス分析に使用できます。プロテオミクスサンプルとリン酸化プロテオミクスサンプルの両方をLC-MS/MSで分析し、その後、データに依存しない取得(DIA)ワークフローメソッドを使用して同定と定量を行います。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ウェスタンブロッティングによる単離EVの特性評価 。 (A)0.1 mL の直接尿サンプル(n=1)、差動遠心分離(DUC)法で単離した EV(n=3)、EVtrap 法で単離した EV(n=3)から EV マーカー CD9 を検出しました。(B)(A)のウェスタンブロッティングシグナルの定量は、直接尿サンプル(5倍強度=100%)に対する回収率として表されます。DUCサンプルとEVtrapサンプルの場合、棒グラフには3つのサンプルからの平均強度と標準偏差(誤差範囲で表される)が表示されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:単離されたEVのプロテオミクス解析 。 (A)三重に同定された固有のタンパク質およびペプチドの総数。(B)レプリケート間で同定された固有のタンパク質のオーバーラップを示すベン図。(C)ExoCartaデータベースの上位100のEVマーカーに対応する同定された一意のタンパク質の数。(D)タンパク質定量のための変動係数(CV)の分布を示す密度プロット。CV値の中央値は赤い破線で強調表示されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:単離されたEVのリン酸化プロテオミクス分析 。 (A)三重に同定された固有のリン酸化タンパク質およびリン酸化ペプチドの総数。(B)リン酸化ペプチド濃縮後のpSTYペプチドの組成割合。(C)同定された固有のリン酸化ペプチドの複製間の重複を示すベン図。(D)リン酸化ペプチド定量のためのCVの分布を示す密度プロット。CV値の中央値は赤い破線で強調表示されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
EVの効果的な単離は、EV中の低存在量のタンパク質やリン酸化タンパク質を検出するために不可欠な前提条件です。このニーズを満たすための多くの方法が開発されているにもかかわらず、大多数は依然として回収率の低下や再現性の低さなどの制限に悩まされており、大規模な研究や日常的な臨床現場での利用を妨げています。DUCは一般にEV分離の最も一般的な方法と見なされており、通常、追加の洗浄ステップは、ターゲットEVの純度を高めるために適用されます27,28。この手順は、より面倒で時間のかかるDUCプロセス(>6時間)につながります。さらに、DUC後のEV回収率の低さは複数の研究で報告されており29,30、図2の結果に示されています。これに対し、EVtrapは効率的なEVアイソレーション(<1時間)と高い回収率を提供します(図2)。特に、このワークフローの応用の成功は、さまざまな疾患やがんの重要なEVマーカーを特定するための重要な進歩を示しています19,21,22しかし、EVtrapはEV集団全体を捕捉するため、マイクロベシクルやエクソソームなどのEVの特定の亜集団を分離することはできません。
このプロトコルでは、プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス分析にペプチドサンプルの2%および98%を使用しました。EVtrapによって10 mLの尿から単離されたEVは、通常、100〜200 μgの総タンパク質を生成するため、消化およびクリーンアップ後のペプチドの98%は、リン酸化ペプチドの濃縮に十分です。タンデム質量タグ(TMT)標識などの標識ステップが定量的MS分析に必要である場合、脱塩ステップに続くペプチド濃度測定を実施して、ペプチド量を正規化し、定量の精度を向上させることができる31。
このプロトコルは、主に尿中EVを分離するためのEVtrapの使用を強調していますが、このアプローチの汎用性がさまざまなサンプルタイプの処理で実証されていることに言及することは注目に値します32、33、34。以前の結果に基づいて、このプロトコルで使用された条件は、細胞培養培地からEVを分離するために適用されました。細胞分泌型EVの単離については、ウシ胎児血清(FBS)フリーまたはEV枯渇FBS条件下で細胞を培養し、過剰なFBS由来のEVと細胞分泌型EVの同時分離を防ぎ、結果の信頼性を損なう35。さらに、他のサンプルタイプから単離されたEVは、CD9、CD63、CD81、腫瘍感受性遺伝子101タンパク質(TSG101)、ALG-2相互作用タンパク質X(ALIX)など、いくつかの一般的なEVマーカーを使用したウェスタンブロッティング分析によって特徴付けることができます36。
MS分析のカバレッジを拡大し、定量性を向上させるには、DIAデータを検索するためのプロジェクト固有のライブラリを構築することが代替オプションです。DIAモードで生成されるスペクトルは複雑なため、参照スペクトルのコレクションを含むスペクトルライブラリは、同定の信頼性を高め、カバレッジを向上させるのに役立ちます。高品質のスペクトルライブラリは、同じ試料または前もって分画された試料37に対してDDA分析を行うことによって生成することができる。また、ライブラリは、dia−PASEFの最適なウィンドウを決定し、同定をさらに改善するためにも使用することができる38。
まとめると、提示されたプロトコルは、プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス分析のために尿サンプルからEVを分離するためのシンプルで効果的な方法を提供します。このプロトコルを実施することで、初期段階の疾患検出と縦断的モニタリングのためのバイオマーカーとして、存在量の少ないEVタンパク質とリン酸化タンパク質の検出が向上することが期待されます。さらに、研究者はEV研究の分野を前進させ、より良い診断および治療戦略に貢献する絶好の機会を得ています。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言します。Anton Iliuk と W. Andy Tao は、EVtrap ビーズを開発し、PolyMAC リン酸化ペプチド濃縮キットを商品化した Tymora Analytical Operations の共同設立者です。
Acknowledgments
この研究の一部は、NIHの助成金3RF1AG064250およびR44CA239845によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
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