Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kjemisk affinitetsbasert isolering av ekstracellulære vesikler fra biofluider for proteomikk og fosfoproteomikkanalyse

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65844
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Summary

Den nåværende protokollen gir detaljerte beskrivelser for effektiv isolering av ekstracellulære urinvesikler ved bruk av funksjonaliserte magnetiske perler. Videre omfatter det etterfølgende analyser, inkludert vestlig blotting, proteomikk og fosfoproteomikk.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EV) fra biofluider har nylig fått betydelig oppmerksomhet innen flytende biopsi. Utgitt av nesten alle typer celler, gir de et sanntids øyeblikksbilde av vertsceller og inneholder et vell av molekylær informasjon, inkludert proteiner, spesielt de med posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) som fosforylering, som hovedspiller av cellulære funksjoner og sykdomsutbrudd og progresjon. Imidlertid er isoleringen av elbiler fra biofluider fortsatt utfordrende på grunn av lave utbytter og urenheter fra dagens EV-isolasjonsmetoder, noe som gjør nedstrømsanalysen av EV-last, som EV-fosfoproteiner, vanskelig. Her beskriver vi en rask og effektiv EV-isolasjonsmetode basert på funksjonaliserte magnetiske perler for EV-isolasjon fra biofluider som human urin og nedstrøms proteomikk og fosfoproteomikkanalyse etter EV-isolasjon. Protokollen muliggjorde et høyt utvinningsutbytte av urin-EV og følsomme profiler av EV-proteom og fosfoproteom. Videre er allsidigheten til denne protokollen og relevante tekniske hensyn også adressert her.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV) er membraninnkapslede nanopartikler utskilt av alle typer celler og er tilstede i biofluider som blod, urin, spytt, etc.1,2,3,4. Elbiler bærer en last med forskjellige bioaktive molekyler som gjenspeiler den fysiologiske og patologiske tilstanden til vertscellene, og fungerer derfor som avgjørende faktorer i sykdomsprogresjon 4,5,6. Videre har omfattende studier fastslått at EV-baserte sykdomsmarkører kan identifiseres før symptomene begynner eller den fysiologiske påvisningen av svulster 5,6,7.

Fosforylering fungerer som en nøkkelmekanisme i cellulær signalering og regulering. Derfor gir fosfoproteiner en verdifull kilde for biomarkøroppdagelse da avvikende fosforyleringshendelser er assosiert med dysregulerte cellulære signalveier og metastatisk sykdomsutvikling som kreft 8,9,10. Selv om profilering av fosforyleringsdynamikk gjør det mulig å identifisere sykdomsspesifikke fosfoproteinsignaturer som potensielle biomarkører, utgjør fosfoproteiners lave overflod og dynamiske natur store utfordringer i utviklingen av fosfoproteiner som biomarkører11,12. Spesielt er de lave fosfoproteinene innkapslet i EV beskyttet mot ekstern enzymatisk fordøyelse i det ekstracellulære miljøet8. Følgelig tilbyr EV og EV-avledede fosfoproteiner en ideell kilde for biomarkøroppdagelse i tidlig påvisning av kreft og andre sykdommer.

Selv om analyse av proteinfosforylering i elbiler gir en verdifull ressurs for å forstå kreftsignalering og sykdomsdiagnose på et tidlig stadium, utgjør mangelen på effektive EV-isolasjonsmetoder en stor barriere. EV-isolasjon oppnås vanligvis gjennom differensiell ultrasentrifugering (DUC)13. Denne metoden er imidlertid tidkrevende og er ikke egnet for kliniske implikasjoner på grunn av lav gjennomstrømning og dårlig reproduserbarhet13,14. Alternative EV-isolasjonsmetoder, som polymerindusert utfelling15, er begrenset av lav spesifisitet på grunn av samutfelling av ikke-EV-proteiner. Affinitetsbaserte tilnærminger, inkludert antistoffbasert affinitetsfangst16 og affinitetsfiltrering17, gir forbedret spesifisitet, men er begrenset til en relativt lav gjenvinningsgrad på grunn av lite volum.

For å løse problemene med å utforske fosfoproteindynamikk i EV, har vår gruppe utviklet ekstracellulære vesikler total utvinning og rensing (EVtrap) teknikk basert på kjemisk affinitet for å fange EV på funksjonaliserte magnetiske perler18. Tidligere resultater har vist at denne magnetiske perlebaserte EV-isolasjonsmetoden er svært effektiv for å isolere elbiler fra et bredt spekter av biofluidprøver og er i stand til å oppnå mye høyere EV-utbytte samtidig som forurensning minimeres sammenlignet med DUC og andre eksisterende isolasjonsmetoder18,19. Vi har med hell benyttet EVtrap og en titanbasert fosfopenptidberikelsesmetode utviklet av vår gruppe20 for å profilere fosfoproteomet til EV avledet fra forskjellige biofluider og for å oppdage potensielle fosfoproteinbiomarkører for ulike sykdommer 19,21,22.

Her presenterer vi en protokoll basert på EVtrap for isolering av sirkulerende elbiler. Protokollen fokuserer på urin-elbilene. Vi demonstrerer også karakteriseringen av isolerte elbiler ved hjelp av vestlig blotting. Deretter redegjør vi for prøvepreparering og massespektrometri (MS) for både proteomikk- og fosfoprotomikkanalyser. Denne protokollen gir en effektiv og reproduserbar arbeidsflyt for profilering av EV-proteom og fosfoproteom i urinen, noe som vil legge til rette for videre studier av EV og deres kliniske applikasjoner23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle urinprøver ble tatt fra friske personer etter informert samtykke. Forsøkene var i samsvar med alle etiske standarder som involverte menneskelige prøver og i samsvar med retningslinjene fra Purdue University Human Research Protection Program.

1. Prøveinnsamling

  1. Sentrifuge 12 ml urinprøve i et 15 ml konisk sentrifugerør i 10 minutter ved 2,500 x g, 4 °C for å fjerne cellerester og store apoptotiske legemer.
  2. Overfør 10 ml av supernatanten til et nytt 15 ml rør og fortsett med EV-isolasjon.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her, og prøvene kan oppbevares ved -80 °C og tines ved 37 °C ved bruk.

2. Elbil-isolasjon ved hjelp av EVtrap-tilnærmingen

  1. Tilsett 0,5 ml lastebuffer (1:10 v/v-forhold) og 100 μL EVtrap-perleoppslemming (1:50 v/v-forhold) til prøven i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Inkuber prøven ved end-over-end rotasjon i 30 minutter ved romtemperatur.
  3. Pellet prøven ved å plassere det koniske 15 ml koniske røret på et magnetisk separatorstativ. Fjern supernatanten.
  4. Heng kulene i 1 ml vaskebuffer igjen og overfør suspensjonen til et mikrosentrifugerør på 1,5 ml. Pipett forsiktig for å resuspendere de elbilbundne perlene.
  5. Plasser røret på et magnetisk separatorstativ på 1,5 ml mikrosentrifugerør og aspirer supernatanten. Bruk en P200-pipette for å aspirere supernatanten fullstendig og unngå å aspirere perlene.
  6. Vask perlene med 1 ml vaskebuffer. Legg til bufferen umiddelbart etter aspirasjon av supernatanten for å forhindre at perlene tørker ut.
  7. Vask kulene 2x med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) ved romtemperatur.
  8. Inkuber kulene med 100 μL nylaget 100 mM trietylamin i 10 minutter ved romtemperatur og samle den eluerte løsningen som inneholder elbiler ved hjelp av et magnetisk separatorstativ på 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    MERK: For å tilberede 1 ml trietylamin på 100 ml, fortynn 14 mikrol trietylaminoppløsning i vann.
  9. Gjenta trinn 2.8 og kombiner de eluerte løsningene. Tørk eluatet med en vakuumsentrifugekonsentrator ved 4 °C.
    MERK: Eksperimentet kan settes på pause her. Tørkede EV-prøver kan lagres ved -80 °C i flere måneder uten negative effekter på de følgende trinnene eller resultatene.

3. Karakterisering av elbiler ved vestlig blotting

  1. Resuspender 5 % av den tørkede EV-prøven (tilsvarende 0,5 ml urinprøven) i 20 μL 1x prøvebuffer av litiumdodecylsulfat (LDS) med 10 mM dithiothreitol (DTT).
    MERK: EV fra 0,5 ml urin er nok til å oppdage CD9 (en EV markør24) signal i vestlig blotting.
  2. Kok prøven i 5 min ved 95 °C. Legg prøven på en polyakrylamidgel og utfør elektroforese og immunoblotting i henhold til standardprotokoller25.
  3. Etter overføring av proteinene til en lavfluorescens polyvinylidenfluorid (PVDF) membran, blokker membranen med 1% bovint serumalbumin (BSA) i trisbufret saltvann tween-20 (TBST) i 1 time ved romtemperatur. For å forberede 1 liter TBST-buffer, tilsett 19 mM Tris-base, 137 mM NaCl og 1 ml Tween-20; juster pH til 7,4 ved hjelp av HCl.
  4. Inkuber membran med kanin-anti-CD9-antistoff i forholdet 1:5 000 i 1 % BSA i TBST ved 4 °C over natten eller i 2 timer ved romtemperatur.
  5. Vask membranen 3x i 5 min hver med TBST. Inkuber membranen med antikanin IgG, HRP-bundet sekundært antistoff ved forholdet 1:5000 i 1% BSA i TBST i 1 time ved romtemperatur.
  6. Vask membranen 3x i 5 min hver med TBST. Legg til de kommersielt oppnådde forbedrede kjemiluminescenssubstratene (ECL) (1: 1-forhold) på membranen og detekter signaler på et kjemiluminescensavbildningssystem.

4. Prøvepreparering for proteomikk og fosfoproteomikkanalyse

  1. Klargjør fersk lysisbuffer som inneholder 12 mM natriumdeoksykolat (SDC), 12 mM natriumlauroylsarkosinat (SLS), 100 mM trietylammoniumbikarbonatbuffer (TEAB), 10 mM tris-(2-karboksyetyl)fosfin (TCEP), 40 mM kloracetamid (CAA) og 1x fosfatasehemmercocktailer.
    MERK: Lagerløsningene er oppført i beskrivelsen av materialfortegnelsen. Lysisbufferen fremstilles ved å tilsette stamløsningene for å oppnå de ønskede konsentrasjonene avhengig av ønsket volum.
  2. Løselig den tørkede EV-prøven i 100 μL lysbuffer og varm prøven i 10 minutter ved 95 °C med risting ved 1,100 o / min.
  3. Etter avkjøling av prøven til romtemperatur, fortynn den fem ganger ved å tilsette 400 μL 50 mM TEAB.
  4. Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et BCA-analysesett i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk lysisbufferen fortynnet fem ganger med 50 mM TEAB som blank.
  5. Tilsett trypsin / Lys-C-blanding ved 1:50 w / w enzym-til-protein-forhold og inkuber prøven ved 37 ° C over natten med risting ved 1,100 rpm.
  6. Tilsett 50 μL 10 % trifluoreddiksyre (TFA) for å forsure prøven.
  7. Tilsett 600 μL etylacetat til prøvene og virvel blandingen i 2 minutter.
  8. Sentrifuger prøven i 3 min ved 20 000 x g og fjern det øvre laget (organisk lag). Unngå å forstyrre grensesnittet under aspirasjon.
  9. Gjenta trinn 4.7-4.8. Tørk den vandige fasen ved hjelp av en vakuumsentrifugekonsentrator.
  10. Suspender den tørkede prøven i 200 μL 0,1% TFA for å forsure peptider og desalter prøven ved hjelp av en C18 avsaltingsspiss i henhold til produsentens instruksjoner. Kondisjoner spissen med 200 μL 0,1% TFA i 80% acetonitril, etterfulgt av 2x med 200 μL på 0,1% TFA. Legg den surgjorte peptidprøven i spissen og vask deretter spissen 3x med 200 μL 0,1% TFA. Elute peptidene med 200 μL 0,1% TFA i 80% acetonitril.
  11. Tørk eluatet med en vakuumsentrifugekonsentrator. Tørk 2% av peptidprøven (tilsvarende 0,2 ml av urinprøven) separat for proteomikkanalyse. Bruk resten (98%) av prøven for fosfoproteomikkanalyse.
  12. Berik fosfopenptider fra prøven ved hjelp av et fosfopenptidberikelsessett i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør trinnene beskrevet nedenfor for berikelse.
    1. Suspender den tørkede prøven i 200 μL lastbuffer. Tilsett 50 μL av kulene i prøven og rist kraftig i 20 minutter ved romtemperatur. Legg prøven med perlene til den stekte spissen og sentrifugen i 1 min ved 100 x g.
    2. Vask spissen med 200 μL lastbuffer, etterfulgt av vaskebuffer 1, deretter vaskebuffer 2. Utfør alle tre vasketrinnene ved å sentrifugere en gang i 2 min ved 20 x g og en gang i 1 min ved 100 x g.
    3. Sett spissen med perler i et nytt rør for å samle de eluerte fosfoptidene. Tilsett 50 μL elueringsbuffer til spissen og sentrifuge en gang i 2 minutter ved 20 x g. Tilsett ytterligere 50 μL elueringsbuffer til spissen og sentrifuge en gang i 2 minutter ved 20 x g. Sentrifuge en siste gang i 1 min ved 100 x g.
  13. Tørk de eluerte fosfoplyene ved hjelp av en vakuumsentrifugekonsentrator.

5. LC-MS/MS-analyse

MERK: Ulike LC-MS/MS-systemer/innstillinger og datainnsamlingsmetoder, for eksempel dataavhengig innsamling (DDA), kan brukes.

  1. Resuspender de tørkede proteom-/fosfoproteomprøvene i 0,1 % maursyre (løsemiddel A) og legg prøvene i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Injiser prøvene i fanget ionmobilitetstid MS gjennom væskekromatografisystemet (LC) og bruk den forhåndsinnstilte standardiserte Whisper 40-prøvene per dag-metoden. Peptider separeres på en 15 cm C18-kolonne (75 μm indre diameter, 1,9 μm partikkelstørrelse) som nevnt i materialfortegnelsen.
  3. For proteomikkanalyse, samle inn data ved hjelp av en parallell akkumulering-seriell fragmentering kombinert med datauavhengig innsamlingsmetode (dia-PASEF) med et masseområde per rampe som spenner fra 300-1200 m / z og fra 0,6-1,50 1 / K0 med en syklustid på 1,38 s.
  4. For fosfoproteomikkanalyse, samle inn data ved hjelp av en dia-PASEF-innsamlingsmetode med et masseområde per rampe som spenner fra 400-1550 m / z og 0,6-1,50 1 / K0 med en syklustid på 1,38 s.
  5. Last inn råfilene i proteomikkprogramvare og utfør signalutvinning, identifikasjon og kvantifisering ved hjelp av en bibliotekfri arbeidsflyt for datainnsamling.
    1. For søkeinnstillinger, bruk Homo sapiens-databasen , spesifikke fordøyelsestyper med trypsin / P-enzymer, 7 minimal peptidlengde, 52 maksimal peptidlengde, to savnet spaltning, karbamidometyl ved cystein som fast modifikasjon, acetylprotein N-term, oksidasjon ved metionin og fosforylering ved serin, treonin og tyrosin (for fosfoproteomikkanalyse) som variable modifikasjoner og 5 som maksimale variable modifikasjoner. Sett FDR ved PSM, peptid og proteingruppe til 0,01.
      MERK: Spectronaut-programvare ble brukt i denne protokollen. Andre DIA data søker programvare som DIA-NN og PEAKS er også ofte brukt. Hvis data ble anskaffet i DDA-modus, brukes programvare som MaxQuant og Proteome Discoverer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen demonstrerer en omfattende arbeidsflyt fra isolering av elbiler til nedstrøms proteomikk og fosfoproteomikkanalyser (figur 1). De triplikate urinprøvene ble utsatt for EV-isolasjon. De isolerte elbilene ble karakterisert ved vestlig blotting og deretter behandlet for massespektrometribasert proteomikkprøvepreparering, inkludert proteinekstraksjon, enzymatisk fordøyelse og peptidopprydding. For fosfoproteomikkanalyse ble fosfoptidene ytterligere anriket basert på metallionefunksjonaliserte oppløselige nanopolymerer. Både peptid- og fosfopenptidprøver ble analysert ved høyoppløselig ionmobilitetsmassespektrometri under datauavhengig modus. Resultatråfilene ble søkt opp mot databasen Homo sapiens , og bibliotekfri datauavhengig innsamlingsarbeidsflyt ble utført for identifisering og kvantifisering på MS2-nivå.

For å karakterisere de isolerte elbilene og estimere gjenvinningsutbyttet, lastet vi først tilsvarende 0,5 ml urinholdig elbil på gelen for vestlig blotting for å oppdage EV-markøren CD9 (figur 2A). I tillegg inkluderte vi elbilene isolert fra samme urinvolum ved hjelp av den mest brukte metoden for EV-isolasjon, differensial ultrasentrifugering (DUC), for sammenligning. Resultatene viste at EVtrap var i stand til å produsere mye høyere CD9-signaler sammenlignet med DUC, noe som indikerer en effektiv fangst av elbiler av perlene. Ytterligere kvantitative verdier for hvert CD9-båndsignal viste at EVtrap oppnådde et utvinningsutbytte på ~ 99% sammenlignet med 5 ganger intensiteten av direkte urinkontroll, mens DUC bare gjenvunnet ~ 1.5% av EVs (figur 2B).

Ved å laste 2% av hver prøve på LC-MS / MS for proteomisk profilering, identifiserte vi > 11.000 unike peptider fra ~ 2.200 unike proteiner (figur 3A), noe som indikerer at denne arbeidsflyten gir en grundig dekning av EV-proteom. En høy grad av overlapping i proteinidentifikasjoner på tvers av prøver ble observert, med 72% av unike proteiner som ble konsekvent identifisert i alle tre replikater (figur 3B). Videre sammenlignet vi identifikasjonsresultatene med ExoCarta-databasen (figur 3C)26. Spesielt, ut av de 100 beste EV-markørene og proteinene, identifiserte vi vellykket ~ 90 av disse EV-proteinene, noe som tyder på en objektiv og fullstendig profilering av EV-proteiner gjennom denne proteomikkanalysen. For å vurdere den kvantitative presisjonen evaluerte vi videre fordelingen av variasjonskoeffisienter (CV) for proteinkvantifiseringsresultatene (figur 3D). En lav middels CV (5,7 %) indikerer prosedyrens høye reproduserbarhet og pålitelighet, inkludert EV-isolering, prøvepreparering og MS-deteksjon.

For fosfoproteomikkanalysen brukte vi 98% av hver peptidprøve for fosfopptidanrikningen og identifiserte ~ 800 unike fosfoptider tilsvarende ~ 350 unike fosfoproteiner (figur 4A). Anrikningen ga i gjennomsnitt henholdsvis 72 % fosfoserin (pS) peptider, 22 % fosfotreonin (pT) og 6 % fosfotyrosin (pY) peptider (figur 4B). Når det gjelder identifiseringsreproduserbarheten til de tre replikatene, ble 42 % av fosfoptidene identifisert av alle tre analysene, og det var ~50 % overlapping mellom annenhver analyse (figur 4C). En middels CV på 21,8 % ble bestemt for kvantifisering av fosfoptider, noe som tyder på en akseptabel kvantitativ reproduserbarhet ved bruk av denne protokollen (figur 4D).

Figure 1
Figur 1 Skjematisk arbeidsflyt brukt for isolering av ekstracellulære urinvesikkel (EV) og nedstrømsanalyser. Elbiler isoleres fra urinprøver gjennom den ekstracellulære vesiklene total recovery and purification (EVtrap) tilnærming, og de isolerte elbilene blir direkte utsatt for vestlig blottinganalyse. For LC-MS / MS-analyse ekstraheres proteiner fra EV og fordøyes til peptider. Peptidprøvene etter oppryddingstrinnene kan brukes til proteomikkanalyse eller fosfoproteomikkanalyse etter fosfopenptidberikelse. Både proteomikk- og fosfoproteomikkprøver analyseres av LC-MS/MS. Identifisering og kvantifisering utføres deretter ved hjelp av arbeidsflytmetoden Data Independent Acquisition (DIA). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering av isolerte elbiler ved vestlig blotting. (A) Påvisning av EV-markør CD9 fra 0,1 ml direkte urinprøve (n = 1), EV isolert ved hjelp av differensiell sentrifugering (DUC) tilnærming (n = 3) og EV isolert ved hjelp av EVtrap-tilnærming (n = 3). (B) Kvantifisering av vestlige blottingssignaler i (A) presenteres som prosentvis utvinning i forhold til direkte urinprøve (5 ganger intensitet = 100%). For DUC- og EVtrap-prøvene viser stolpeplottet gjennomsnittsintensitetene og standardavvikene (representert ved feilfelt) fra triplikatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Proteomikkanalyse av isolerte elbiler . (A) Det totale antall identifiserte unike proteiner og peptider i triplikater. (B) Venn-diagram som viser overlappingen i identifiserte unike proteiner mellom replikater. (C) Antall identifiserte unike proteiner som tilsvarer de 100 beste EV-markørene i ExoCarta-databasen. (D) Tetthetsplott som viser fordelingen av variasjonskoeffisienten (CV) for proteinkvantifisering. Median CV-verdien er uthevet med en rød stiplet linje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Fosfoproteomikkanalyse av isolerte elbiler . (A) Det totale antall identifiserte unike fosfoproteiner og fosfopenptider i triplikater. (B) Prosentvis sammensetning av pSTY peptider etter fosfopenptidanrikning. (C) Venn-diagram som viser overlappingen i identifiserte unike fosfopenptider mellom replikater. (D) Tetthetsplott som viser fordelingen av CV for fosfopenptidkvantifisering. Median CV-verdien er uthevet med en rød stiplet linje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Effektiv EV-isolasjon er en viktig forutsetning for å oppdage proteiner og fosfoproteiner med lite rikelig i elbiler. Til tross for utviklingen av mange metoder for å oppfylle dette behovet, lider flertallet fortsatt av begrensninger som dårlig utvinning eller lav reproduserbarhet, noe som hindrer bruken av dem i store studier og rutinemessige kliniske omgivelser. DUC anses generelt som den vanligste metoden for EV-isolasjon, og de ekstra vasketrinnene brukes normalt for å øke renheten til mål-EV27,28. Denne prosedyren fører til en mer kjedelig og tidkrevende DUC-prosess (> 6 timer). Videre har lavt EV-utvinningsutbytte etter DUC blitt rapportert av flere studier,29,30 og vist i resultatene i figur 2. Til sammenligning tilbyr EVtrap effektiv EV-isolasjon (< 1 time) og et høyt gjenvinningsutbytte (figur 2). Spesielt markerer den vellykkede anvendelsen av denne arbeidsflyten et avgjørende fremskritt for identifisering av betydelige EV-markører for ulike sykdommer og kreftformer 19,21,22 EVtrap er imidlertid ikke i stand til å isolere spesifikke underpopulasjoner av EV, for eksempel mikrovesikler eller eksosomer, da den fanger hele EV-befolkningen.

I denne protokollen brukte vi 2 % og 98 % av peptidprøven til proteomikk- og fosfoproteomikkanalyser. Siden elbilene isolert fra 10 ml urin ved EVtrap typisk gir 100-200 μg totale proteiner, er 98% av peptidene etter fordøyelse og opprydding tilstrekkelig for fosfoptidanrikningen. Hvis et merkingstrinn, for eksempel tandem mass tag (TMT) merking, er nødvendig for kvantitativ MS-analyse, kan peptidkonsentrasjonsmåling etter avsaltingstrinnet utføres for å normalisere peptidmengden og forbedre nøyaktigheten av kvantifisering31.

Selv om denne protokollen først og fremst fremhever bruken av EVtrap for å isolere urin-EV, er det bemerkelsesverdig å nevne at allsidigheten til denne tilnærmingen har blitt demonstrert ved behandling av forskjellige prøvetyper32,33,34. Basert på tidligere resultater var tilstanden som ble brukt i denne protokollen gjeldende for å isolere EV fra cellekulturmedier. For isolering av celleutskilte EV-er dyrkes cellene under føtalt bovint serum (FBS) -fritt eller EV-utarmet FBS-forhold for å forhindre samisolering av overdreven FBS-avledede EV med celleutskilte EV-er, noe som vil undergrave påliteligheten av resultatene35. I tillegg kan de isolerte EVene fra andre prøvetyper karakteriseres ved vestlig blottingsanalyse ved bruk av flere vanlige EV-markører, inkludert CD9, CD63, CD81, tumorfølsomhetsgen 101-protein (TSG101) og ALG-2-interagerende protein X (ALIX) 36.

For å øke dekningen og forbedre kvantifiseringen i MS-analyse, er det et alternativ å bygge et prosjektspesifikt bibliotek for å søke i DIA-data. På grunn av kompleksiteten til spektrene produsert i DIA-modus, er et spektralbibliotek som inneholder en samling referansespektra gunstig for å øke identifikasjonssikkerheten og forbedre dekningen. Spektralbiblioteker av høy kvalitet kan genereres ved å utføre DDA-analyse på de samme prøvene eller prefraksjonerte prøver37. Biblioteket kan også brukes til å bestemme optimale vinduer for dia-PASEF og ytterligere forbedre identifisering38.

Samlet gir den presenterte protokollen en enkel og effektiv metode for å isolere EV fra urinprøver for proteomikk og fosfoproteomikkanalyser. Ved å implementere denne protokollen forventer vi forbedret deteksjon av lavrikelig EV-proteiner og fosfoproteiner som biomarkører for tidlig stadium sykdomsdeteksjon og langsgående overvåking. Videre har forskere stor mulighet til å fremme feltet EV-forskning og bidra til bedre diagnostiske og terapeutiske strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer en konkurrerende økonomisk interesse. Anton Iliuk og W. Andy Tao er medstiftere av Tymora Analytical Operations, som utviklet EVtrap-perler og kommersialiserte PolyMAC fosfopenptidberikelsessett.

Acknowledgments

Dette arbeidet er delvis finansiert av NIHs bevilgninger 3RF1AG064250 og R44CA239845.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Life Science Products M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1005
15 mL conical centrifuge tube Corning  352097
15 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074P2
Benchtop incubated shaker Bioer DIS-87999-3367802 Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13403S
Chloroacetamide Sigma -Aldrich C0267-100G Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate  Fisher Scientific  E145-4 Precipitates detergents
Evosep One  Evosep Liquid chromatography system
Evotips Evosep EV2013 Sample loading for Evosep One system 
EVtrap Tymora Analytical Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF Membrane Sigma -Aldrich IPFL00010 Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen NP0322BOX Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
PBS ThermoFisher 10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 Bruker  1893473 Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma -Aldrich P5726-5ML 100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Sigma -Aldrich P0044-1ML 100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit Tymora Analytical Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate  Sigma -Aldrich D6750-10G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate  Sigma -Aldrich L9150-50G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT Bruker Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips  Glygen TT2C18.96 Desalting method
Triethylamine Sigma -Aldrich 471283-100ML For EV elution. 
Triethylammonium bicabonate buffer Sigma -Aldrich T7408-100ML 1 M
Trifluoroacetic acid Sigma -Aldrich 302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma -Aldrich C4706 Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX ThermoFisher PIA41007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  5. Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
  6. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
  7. Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
  8. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  9. Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
  10. Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
  11. Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
  12. Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
  13. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
  16. Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
  17. Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
  18. Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
  19. Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
  20. Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
  21. Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
  22. Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
  23. Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
  24. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  27. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
  28. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
  29. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
  30. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  31. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
  32. Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
  33. Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
  34. Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
  35. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  36. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
  37. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
  38. Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).

Tags

Kjemisk affinitetsbasert isolasjon ekstracellulære vesikler biofluider proteomikkanalyse fosfoproteomikkanalyse væskebiopsi posttranslasjonelle modifikasjoner fosforylering cellulære funksjoner sykdomsdebut sykdomsprogresjon isolasjonsmetoder magnetiske perler human urin nedstrømsanalyse gjenopprettingsutbytte urin-EV sensitive profiler proteom fosfoproteom tekniske hensyn
Kjemisk affinitetsbasert isolering av ekstracellulære vesikler fra biofluider for proteomikk og fosfoproteomikkanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y. K., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, … More

Liu, Y. K., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, W. A. Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65844, doi:10.3791/65844 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter