Summary
Настоящий протокол содержит подробное описание эффективного выделения внеклеточных пузырьков мочи с использованием функционализированных магнитных шариков. Кроме того, он включает в себя последующие анализы, включая вестерн-блоттинг, протеомику и фосфопротеомику.
Abstract
Внеклеточные везикулы (ВВ) из биожидкостей в последнее время привлекли значительное внимание в области жидкостной биопсии. Высвобождаемые почти каждым типом клеток, они обеспечивают моментальный снимок клеток-хозяев в режиме реального времени и содержат множество молекулярной информации, включая белки, в частности, с посттрансляционными модификациями (PTM), такими как фосфорилирование, как основной игрок клеточных функций, а также возникновения и прогрессирования заболевания. Тем не менее, изоляция электромобилей от биожидкостей остается сложной задачей из-за низкого выхода и примесей от существующих методов изоляции электромобилей, что затрудняет последующий анализ грузов электромобилей, таких как фосфопротеины электромобилей. В этой статье мы опишем быстрый и эффективный метод выделения ВВ, основанный на функционализированных магнитных шариках для выделения ВВ из биожидкостей, таких как моча человека, а также анализ последующей протеомики и фосфопротеомики после выделения ВВ. Протокол обеспечил высокую рекуперацию ВВ в моче и чувствительные профили протеома и фосфопротеома ВВ. Кроме того, здесь рассматриваются универсальность этого протокола и соответствующие технические соображения.
Introduction
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой мембранные наночастицы, секретируемые всеми типами клеток и присутствующие в биожидкостях, таких как кровь, моча, слюна и т. д.1,2,3,4. ВВ несут груз разнообразных биологически активных молекул, которые отражают физиологическое и патологическое состояние клеток-хозяев и, следовательно, функционируют как решающие факторы в прогрессировании заболевания 4,5,6. Более того, обширные исследования установили, что маркеры заболевания, основанные на ВВ, могут быть идентифицированы до появления симптомов или физиологического обнаружения опухолей 5,6,7.
Фосфорилирование действует как ключевой механизм клеточной сигнализации и регуляции. Таким образом, фосфопротеины являются ценным источником для обнаружения биомаркеров, поскольку аберрантные события фосфорилирования связаны с нарушением регуляции клеточных сигнальных путей и развитием метастатических заболеваний, таких как рак 8,9,10. Несмотря на то, что профилирование динамики фосфорилирования позволяет идентифицировать специфичные для заболевания сигнатуры фосфопротеинов в качестве потенциальных биомаркеров, низкая распространенность и динамический характер фосфопротеинов создают серьезные проблемы при разработке фосфопротеинов в качестве биомаркеров11,12. Примечательно, что малораспространенные фосфопротеины, инкапсулированные в ВВ, защищены от внешнего ферментативного расщепления во внеклеточной среде8. Следовательно, ВВ и фосфопротеины, полученные из ВВ, являются идеальным источником для обнаружения биомаркеров при выявлении рака и других заболеваний на ранних стадиях.
Несмотря на то, что анализ фосфорилирования белков в ВВ является ценным ресурсом для понимания сигнализации рака и диагностики заболевания на ранних стадиях, отсутствие эффективных методов выделения ВВ представляет собой серьезное препятствие. Изоляция EV обычно достигается с помощью дифференциального ультрацентрифугирования (DUC)13. Однако этот метод занимает много времени и не подходит для клинических исследований из-за низкой пропускной способности и плохой воспроизводимости13,14. Альтернативные подходы к выделению ВВ, такие как полимер-индуцированное осаждение15, ограничены низкой специфичностью из-за совместного осаждения белков, не относящихся к ВВ. Подходы, основанные на аффинити, включая аффинный захват на основе антител16 и аффинную фильтрацию17, обеспечивают повышенную специфичность, но ограничены относительно низкой скоростью восстановления из-за малого объема.
Для решения проблем, связанных с изучением динамики фосфопротеинов в ВВ, наша группа разработала метод полного восстановления и очистки внеклеточных везикул (EVtrap), основанный на химическом сродстве для захвата ВВ на функционализированных магнитных шариках18. Предыдущие результаты показали, что этот метод изоляции ВВ на основе магнитных шариков очень эффективен при выделении ВВ из широкого спектра образцов биожидкости и способен достичь гораздо более высокого выхода ВВ при минимизации загрязнения по сравнению с DUC и другими существующими методами изоляции18,19. Мы успешно использовали EVtrap и метод обогащения фосфопептидами на основе титана, разработанный нашей группой20, для профилирования фосфопротеома ВВ, полученных из различных биожидкостей, и для обнаружения потенциальных фосфопротеиновых биомаркеров для различных заболеваний 19,21,22.
Здесь мы представляем протокол на основе EVtrap для изоляции циркулирующих электромобилей. Протокол фокусируется на ВВ мочевыводящих путей. Мы также демонстрируем характеристику изолированных ВВ с помощью вестерн-блоттинга. Затем мы подробно описываем подготовку образцов и сбор данных с помощью масс-спектрометрии (МС) как для протеомики, так и для фосфопротеомного анализа. Этот протокол обеспечивает эффективный и воспроизводимый рабочий процесс для профилирования протеома и фосфопротеома ВВ мочи, что будет способствовать дальнейшим исследованиям ВВ и их клиническому применению23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все образцы мочи были взяты у здоровых людей после получения информированного согласия. Эксперименты соответствовали всем этическим стандартам, касающимся образцов на людях, и соответствовали руководящим принципам Программы защиты исследований на людях Университета Пердью.
1. Отбор проб
- Центрифуга 12 мл образца мочи в конической центрифужной пробирке объемом 15 мл в течение 10 мин при 2 500 x g, 4 °C для удаления клеточного мусора и крупных апоптотических тел.
- Перелейте 10 мл надосадочной жидкости в новую пробирку объемом 15 мл и приступайте к изоляции ВВ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить, а образцы можно хранить при температуре -80 °C и размораживать при 37 °C после использования.
2. Изоляция EV с использованием подхода EVtrap
- Добавьте в образец 0,5 мл загрузочного буфера (соотношение 1:10 по объему) и 100 мкл суспензии EVtrap (соотношение 1:50 по объему) в соответствии с инструкциями производителя.
- Инкубируют образец путем сквозного вращения в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Гранулируйте образец, поместив коническую пробирку объемом 15 мл на штатив магнитного сепаратора. Удалите надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте гранулы в 1 мл промывочного буфера и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Осторожно пипеткой, чтобы снова взвесить шарики, связанные с EV.
- Поместите пробирку на штатив магнитного сепаратора для микроцентрифуг объемом 1,5 мл и аспирируйте надосадочную жидкость. Используйте пипетку P200 для полного аспирации надосадочной жидкости и избегайте аспирации шариков.
- Промойте бусины 1 мл буфера для стирки. Добавьте буфер сразу после аспирации надосадочной жидкости, чтобы предотвратить высыхание шариков.
- Промойте шарики 2 раза 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) при комнатной температуре.
- Инкубируют гранулы со 100 мкл свежеприготовленного 100 мМ триэтиламина в течение 10 мин при комнатной температуре и собирают элюированный раствор, содержащий ЭВ, с помощью штатива магнитного сепаратора для микроцентрифуг объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 1 мл 100 мМ триэтиламина разведите 14 мкл раствора триэтиламина в воде. - Повторите шаг 2.8 и смешайте элюированные растворы. Высушите элюат с помощью вакуумной центрифуги-концентратора при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно приостановить здесь. Высушенные образцы EV можно хранить при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев без неблагоприятного влияния на последующие этапы или результаты.
3. Характеристика ВВ методом вестерн-блоттинга
- Ресуспендировать 5% высушенного образца EV (эквивалентно 0,5 мл образца мочи) в 20 мкл 1x буфера образца додецилсульфата лития (LDS) с 10 мМ дитиотрейтолом (DTT).
ПРИМЕЧАНИЕ: ВВ из 0,5 мл мочи достаточно для обнаружения сигнала CD9 (маркер EV24) при вестерн-блоттинге. - Прокипятите образец в течение 5 мин при температуре 95 °C. Нагружают образец на полиакриламидный гель и проводят электрофорез и иммуноблоттинг по стандартным протоколам25.
- После переноса белков на мембрану из поливинилиденфторида с низкой флуоресценцией (ПВДФ) блокируют мембрану 1%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА) в трис-буферном физиологическом твин-20 (TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре. Для приготовления 1 л буфера TBST добавляют 19 мМ Tris base, 137 мМ NaCl и 1 мл Tween-20; отрегулируйте рН до 7,4 с помощью HCl.
- Инкубируют мембрану с антителами кролика к CD9 в соотношении 1:5 000 в 1% БСА в ТБСТ при 4 °C в течение ночи или в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Промойте мембрану 3 раза по 5 минут каждый с TBST. Инкубируют мембрану с антикроличьими IgG, HRP-связанными вторичными антителами в соотношении 1:5000 в 1% БСА в ТБСТ в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промойте мембрану 3 раза по 5 минут каждый с TBST. Добавьте коммерчески полученные подложки с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) (соотношение 1:1) на мембрану и детектируйте сигналы на хемилюминесцентной системе визуализации.
4. Пробоподготовка для протеомного и фосфопротеомного анализа
- Приготовьте свежий лизисный буфер, содержащий 12 мМ дезоксихолата натрия (SDC), 12 мМ лауроилсаркозината натрия (SLS), 100 мМ бикарбонатного буфера триэтиламмония (TEAB), 10 мМ трис-(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), 40 мМ хлорацетамида (CAA) и 1x коктейли ингибитора фосфатазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные решения перечислены в описании таблицы материалов. Лизисный буфер готовят путем добавления исходных растворов для достижения желаемых концентраций в зависимости от требуемого объема. - Высушенный образец EV растворяют в 100 мкл лизисного буфера и нагревают образец в течение 10 мин при 95 °C при встряхивании при 1 100 об/мин.
- После охлаждения образца до комнатной температуры разбавьте его в пять раз, добавив 400 мкл 50 мМ TEAB.
- Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа BCA в соответствии с инструкциями производителя. Используйте буфер для лизиса, разбавленный в пять раз 50 мМ TEAB в качестве заготовки.
- Добавьте смесь трипсина/Lys-C в соотношении фермент/белок 1:50 и инкубируйте образец при 37 °C в течение ночи при встряхивании при 1100 об/мин.
- Добавьте 50 мкл 10% трифторуксусной кислоты (ТЖК) для подкисления образца.
- Добавьте к образцам 600 мкл этилацетата и перемешайте смесь в течение 2 мин.
- Центрифугируют образец в течение 3 мин при 20 000 x g и удаляют верхний слой (органический слой). Не нарушайте интерфейс во время аспирации.
- Повторите шаги 4.7-4.8. Высушите водную фазу с помощью вакуумной центрифуги-концентратора.
- Ресуспендируйте высушенный образец в 200 мкл 0,1% ТЖК для подкисления пептидов и обессолийте образец с помощью насадки для обессоливания C18 в соответствии с инструкциями производителя. Кондиционируйте наконечник 200 мкл 0,1% ТЖК в 80% ацетонитриле, а затем 2 раза 200 мкл 0,1% ТФК. Загрузите образец подкисленного пептида в наконечник, а затем промойте наконечник 3 раза 200 мкл 0,1% TFA. Элюируют пептиды с помощью 200 мкл 0,1% ТЖК в 80% ацетонитриле.
- Высушите элюат с помощью вакуумной центрифуги-концентратора. Высушите 2% образца пептида (эквивалентно 0,2 мл образца мочи) отдельно для анализа протеомики. Остальную часть (98%) образца используют для фосфопротеомного анализа.
- Обогащают фосфопептиды из образца с помощью набора для обогащения фосфопептидами в соответствии с инструкцией производителя. Выполните действия, описанные ниже для обогащения.
- Суспендант высушенного образца в 200 мкл загрузочного буфера. Добавьте 50 мкл гранул к образцу и энергично встряхивайте в течение 20 минут при комнатной температуре. Загрузите образец с шариками на фритированный наконечник и центрифугируйте в течение 1 мин при 100 x g.
- Промойте наконечник 200 мкл загрузочного буфера, затем промывочного буфера 1, затем промывочного буфера 2. Выполните все три этапа стирки, центрифугируя один раз в течение 2 минут при 20 x g и один раз в течение 1 минуты при 100 x g.
- Поместите наконечник с бусинами в новую пробирку, чтобы собрать элюированные фосфопептиды. Добавьте 50 мкл элюирующего буфера к наконечнику и центрифугируйте один раз в течение 2 минут при 20 x g. Добавьте еще 50 мкл элюирующего буфера к наконечнику и центрифугируйте один раз в течение 2 минут при 20 x g. Центрифугируйте в последний раз в течение 1 мин при 100 x g.
- Высушите элюированные фосфопептиды с помощью вакуумного центрифужного концентратора.
5. Анализ ЖХ-МС/МС
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать различные системы/настройки LC-MS/MS и методы сбора данных, такие как сбор данных (DDA).
- Высушенные образцы протеома/фосфопротеома повторно суспендировать в 0,1% муравьиной кислоте (растворитель А) и загрузить образцы в соответствии с инструкциями производителя.
- Вводят образцы в захваченную ионную подвижность с помощью системы жидкостной хроматографии (ЖХ) и используют предустановленный стандартизированный метод Whisper 40 образцов в день. Пептиды разделяют на колонке C18 диаметром 15 см (внутренний диаметр 75 мкм, размер частиц 1,9 мкм), как указано в таблице материалов.
- Для протеомного анализа данные собирают с помощью метода параллельного накопления-последовательной фрагментации в сочетании с методом сбора данных, не зависящим от данных (dia-PASEF) с диапазоном масс на рампу от 300 до 1200 м/з и от 0,6 до 1,50 1/K0 с временем цикла 1,38 с.
- Для анализа фосфопротеомики данные собирают методом dia-PASEF с диапазоном масс на рампу от 400 до 1550 м/з и 0,6-1,50 1/K0 с временем цикла 1,38 с.
- Загружайте необработанные файлы в программное обеспечение для протеомики и выполняйте извлечение, идентификацию и количественное определение сигналов с помощью независимого от библиотеки рабочего процесса сбора данных.
- Для настройки поиска используйте базу данных Homo sapiens , специфические типы пищеварения с ферментами трипсин/Р, 7 минимальную длину пептида, 52 максимальную длину пептида, два пропущенных расщепления, карбамидометил в цистеине в качестве фиксированной модификации, N-член ацетильного белка, окисление в метионине и фосфорилирование в серине, треонине и тирозине (для анализа фосфопротеомики) в качестве вариабельных модификаций и 5 в качестве максимальных вариабельных модификаций. Установите FDR в группе PSM, пептидов и белков на 0,01.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовалось программное обеспечение Spectronaut. Также широко используется другое программное обеспечение для поиска данных DIA, такое как DIA-NN и PEAKS. Если данные были получены в режиме DDA, применимо такое программное обеспечение, как MaxQuant и Proteome Discoverer.
- Для настройки поиска используйте базу данных Homo sapiens , специфические типы пищеварения с ферментами трипсин/Р, 7 минимальную длину пептида, 52 максимальную длину пептида, два пропущенных расщепления, карбамидометил в цистеине в качестве фиксированной модификации, N-член ацетильного белка, окисление в метионине и фосфорилирование в серине, треонине и тирозине (для анализа фосфопротеомики) в качестве вариабельных модификаций и 5 в качестве максимальных вариабельных модификаций. Установите FDR в группе PSM, пептидов и белков на 0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол демонстрирует комплексный рабочий процесс от изоляции ВВ до последующего анализа протеомики и фосфопротеомики (рис. 1). Тройные образцы мочи подвергали выделению ВВ. Изолированные ВВ были охарактеризованы вестерн-блоттингом и впоследствии обработаны для подготовки образцов протеомики на основе масс-спектрометрии, включая экстракцию белка, ферментативное разложение и пептидную очистку. Для фосфопротеомного анализа фосфопептиды дополнительно обогащали на основе растворимых нанополимеров, инфункционализированных ионами металлов. Образцы пептидов и фосфопептидов анализировали методом масс-спектрометрии подвижности ионов высокого разрешения в режиме, не зависящем от данных. Поиск полученных необработанных файлов проводился по базе данных Homo sapiens , а также был выполнен независимый от библиотек процесс сбора данных для идентификации и количественной оценки на уровне MS2.
Чтобы охарактеризовать изолированные ВВ и оценить выход для восстановления, мы сначала загрузили эквивалент 0,5 мл мочи, содержащей ВВ, в гель для вестерн-блоттинга для выявления маркера ВВ CD9 (рис. 2А). Кроме того, для сравнения мы включили ВВ, выделенные из одного и того же объема мочи, используя наиболее часто используемый метод выделения ВВ — дифференциальное ультрацентрифугирование (DUC). Результаты показали, что EVtrap способен генерировать гораздо более высокие сигналы CD9 по сравнению с DUC, что указывает на эффективный захват EV шариками. Дальнейшие количественные значения для каждого сигнала CD9-диапазона показали, что EVtrap достиг восстановительного выхода ~99% по сравнению с 5-кратной интенсивностью прямого контроля мочи, в то время как DUC восстановил только ~1,5% EV (рис. 2B).
Загружая 2% каждого образца в ЖХ-МС/МС для протеомного профилирования, мы идентифицировали > 11 000 уникальных пептидов из ~2 200 уникальных белков (рис. 3A), что указывает на то, что этот рабочий процесс обеспечивает углубленный охват протеома EV. Наблюдалась высокая степень совпадения в идентификации белков в разных образцах, при этом 72% уникальных белков были последовательно идентифицированы во всех трех репликатах (рис. 3B). Кроме того, мы сравнили результаты идентификации с базой данных ExoCarta (рис. 3C)26. Примечательно, что из 100 лучших EV-маркеров и белков мы успешно идентифицировали ~90 из этих EV-белков, что предполагает непредвзятое и полное профилирование EV-белков с помощью этого протеомного анализа. Для оценки количественной точности мы дополнительно оценили распределение коэффициентов вариации (CV) для результатов количественного определения белка (рис. 3D). Низкий средний CV (5,7%) указывает на высокую воспроизводимость и надежность процедуры, включая изоляцию ВВ, пробоподготовку и выявление РС.
Для анализа фосфопротеомики мы использовали 98% каждого образца пептида для обогащения фосфопептидами и идентифицировали ~800 уникальных фосфопептидов, соответствующих ~350 уникальным фосфопротеинам (рис. 4А). Обогащение дало в среднем 72% пептидов фосфосерина (pS), 22% фосфотреонина (pT) и 6% пептидов фосфотирозина (pY) соответственно (рис. 4B). С точки зрения воспроизводимости идентификации трех репликатов, 42% фосфопептидов были идентифицированы во всех трех анализах, и было обнаружено перекрытие ~50% между каждыми двумя анализами (рис. 4C). Для количественного определения фосфопептидов была определена средняя CV 21,8%, что позволяет предположить приемлемую количественную воспроизводимость с использованием этого протокола (рис. 4D).
Рисунок 1: Схематический рабочий процесс, используемый для выделения внеклеточного везикулы мочи (ВВ) и последующего анализа. ВВ выделяют из образцов мочи с помощью метода полного восстановления и очистки внеклеточных везикул (EVtrap), а выделенные ВВ непосредственно подвергают анализу вестерн-блоттинга. Для анализа ЖХ-МС/МС белки извлекаются из ВВ и перевариваются в пептиды. Образцы пептидов после этапов очистки могут быть использованы для анализа протеомики или анализа фосфопротеомики после обогащения фосфопептидом. Образцы как протеомики, так и фосфопротеомики анализируются с помощью ЖХ-МС/МС. Идентификация и количественная оценка затем выполняются с использованием метода независимого сбора данных (DIA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика изолированных ВВ методом вестерн-блоттинга. (A) Обнаружение маркера CD9 EV из 0,1 мл прямого образца мочи (n=1), ВВ, выделенных с помощью дифференциального центрифугирования (DUC) (n=3), и ВВ, выделенных с помощью метода EVtrap (n=3). (В) Количественная оценка сигналов вестерн-блоттинга в (А) представлена в виде процентного восстановления по отношению к прямому образцу мочи (5-кратная интенсивность = 100%). Для образцов DUC и EVtrap гистограмма отображает средние интенсивности и стандартные отклонения (представленные столбцами погрешности) от трипликатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Протеомный анализ изолированных ВВ . (А) Общее количество идентифицированных уникальных белков и пептидов в трипликатах. (B) Диаграмма Венна, показывающая перекрытие идентифицированных уникальных белков между репликатами. (C) Количество идентифицированных уникальных белков, соответствующих 100 основным маркерам EV в базе данных ExoCarta. (D) График плотности, показывающий распределение коэффициента вариации (CV) для количественного определения белка. Медианное значение CV выделено красной пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Фосфопротеомный анализ изолированных ВВ . (А) Общее количество идентифицированных уникальных фосфопротеинов и фосфопептидов в трипликатах. (Б) Процентный состав пептидов pSTY после обогащения фосфопептидами. (C) Диаграмма Венна, показывающая перекрытие идентифицированных уникальных фосфопептидов между репликатами. (D) График плотности, показывающий распределение CV для количественного определения фосфопептидов. Медианное значение CV выделено красной пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эффективная изоляция ВВ является необходимой предпосылкой для обнаружения малораспространенных белков и фосфопротеинов в ВВ. Несмотря на разработку многочисленных методов для удовлетворения этой потребности, большинство из них по-прежнему страдают от ограничений, таких как плохое восстановление или низкая воспроизводимость, которые препятствуют их использованию в крупномасштабных исследованиях и рутинных клинических условиях. DUC, как правило, считается наиболее распространенным методом изоляции электромобилей, и дополнительные этапы промывки обычно применяются для повышения чистоты целевых EV27,28. Эта процедура приводит к более утомительному и трудоемкому процессу DUC (> 6 часов). Более того, в многочисленных исследованиях сообщалось о низком выходе EV после DUC,29,30 и показано в результатах на рисунке 2. Для сравнения, EVtrap обеспечивает эффективную изоляцию EV (< 1 ч) и высокий выход рекуперации (рис. 2). Примечательно, что успешное применение этого рабочего процесса знаменует собой решающий шаг вперед в идентификации значимых маркеров ВВ для различных заболеваний и рака 19,21,22 Однако EVtrap не способен изолировать конкретные субпопуляции ВВ, такие как микровезикулы или экзосомы, поскольку он захватывает всю популяцию ВВ.
В этом протоколе мы использовали 2% и 98% образца пептида для анализа протеомики и фосфопротеомики. Поскольку ВВ, выделенные из 10 мл мочи с помощью EVtrap, обычно дают 100-200 мкг общих белков, 98% пептидов после переваривания и очистки достаточно для обогащения фосфопептидами. Если для количественного анализа МС требуется этап маркировки, такой как маркировка тандемной масс-метки (ТМТ), то для нормализации количества пептидов и повышения точности количественного определения31 может быть выполнено измерение концентрации пептидов после этапа обессоливания.
Несмотря на то, что этот протокол в первую очередь подчеркивает использование EVtrap для выделения ВВ мочи, следует отметить, что универсальность этого подхода была продемонстрирована при обработке различных типов образцов32,33,34. Исходя из предыдущих результатов, условие, используемое в этом протоколе, было применимо для выделения ВВ из питательных сред клеток. Для выделения секретируемых клетками ВВ клетки культивируют в условиях фетальной бычьей сыворотки крови (ФБС) без ФБС или в условиях ВВ, истощенных ВВ, чтобы предотвратить совместное выделение избыточных ВВ, полученных из ФБС, с секретируемыми клетками ВВ, что подорвет надежность результатов35. Кроме того, изолированные ВВ из других типов образцов могут быть охарактеризованы с помощью вестерн-блоттинга с использованием нескольких распространенных маркеров ВВ, включая CD9, CD63, CD81, белок гена восприимчивости к опухоли 101 (TSG101) и ALG-2-взаимодействующий белок X (ALIX)36.
Для увеличения охвата и улучшения количественной оценки в анализе РС альтернативным вариантом является создание проектной библиотеки для поиска данных DIA. Из-за сложности спектров, получаемых в режиме DIA, спектральная библиотека, содержащая коллекцию эталонных спектров, полезна для повышения достоверности идентификации и улучшения покрытия. Высококачественные спектральные библиотеки могут быть получены путем выполнения DDA-анализа на одних и тех же образцах или предварительно фракционированных образцах37. Библиотека также может быть использована для определения оптимальных окон для dia-PASEF и дальнейшего улучшения идентификации38.
В совокупности представленный протокол представляет собой простой и эффективный метод выделения ВВ из образцов мочи для анализа протеомики и фосфопротеомики. Внедрение этого протокола позволит улучшить обнаружение малораспространенных белков EV и фосфопротеинов в качестве биомаркеров для выявления заболевания на ранних стадиях и лонгитюдного мониторинга. Кроме того, у исследователей есть прекрасная возможность продвинуться вперед в области исследований электромобилей и внести свой вклад в улучшение диагностических и терапевтических стратегий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют о конкурирующем финансовом интересе. Антон Илюк (Anton Iliuk) и В. Энди Тао (W. Andy Tao) являются соучредителями компании Tymora Analytical Operations, которая разработала гранулы EVtrap и коммерциализировала набор для обогащения фосфопептидов PolyMAC.
Acknowledgments
Эта работа была частично профинансирована грантами NIH 3RF1AG064250 и R44CA239845.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A.
- Singh, V., et al.
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R.
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
