Summary
El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento eficiente de vesículas extracelulares urinarias utilizando perlas magnéticas funcionalizadas. Además, abarca análisis posteriores, como Western blot, proteómica y fosfoproteómica.
Abstract
Las vesículas extracelulares (VE) de los biofluidos han ganado recientemente una atención significativa en el campo de la biopsia líquida. Liberados por casi todos los tipos de células, proporcionan una instantánea en tiempo real de las células huésped y contienen una gran cantidad de información molecular, incluidas las proteínas, en particular aquellas con modificaciones postraduccionales (PTM) como la fosforilación, como el principal actor de las funciones celulares y la aparición y progresión de enfermedades. Sin embargo, el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de biofluidos sigue siendo un reto debido a los bajos rendimientos y las impurezas de los métodos actuales de aislamiento de los vehículos eléctricos, lo que dificulta el análisis posterior de la carga de los vehículos eléctricos, como las fosfoproteínas de los mismos. Aquí, describimos un método rápido y efectivo de aislamiento de EV basado en perlas magnéticas funcionalizadas para el aislamiento de EV de biofluidos como la orina humana y el análisis de proteómica y fosfoproteómica aguas abajo después del aislamiento de EV. El protocolo permitió un alto rendimiento de recuperación de las VE urinarias y perfiles sensibles del proteoma y el fosfoproteoma de las VE. Además, aquí también se abordan la versatilidad de este protocolo y las consideraciones técnicas pertinentes.
Introduction
Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas encapsuladas en membranas secretadas por todo tipo de células y están presentes en biofluidos como sangre, orina, saliva, etc.1,2,3,4. Los VE transportan una carga de diversas moléculas bioactivas que reflejan el estado fisiológico y patológico de sus células huésped y, por lo tanto, funcionan como factores cruciales en la progresión de la enfermedad 4,5,6. Además, amplios estudios han establecido que los marcadores de enfermedad basados en VE pueden identificarse antes de la aparición de los síntomas o de la detección fisiológica de los tumores 5,6,7.
La fosforilación actúa como un mecanismo clave en la señalización y regulación celular. Por lo tanto, las fosfoproteínas proporcionan una fuente valiosa para el descubrimiento de biomarcadores, ya que los eventos de fosforilación aberrantes se asocian con vías de señalización celular desreguladas y el desarrollo de enfermedades metastásicas como el cáncer 8,9,10. Aunque el perfil de la dinámica de fosforilación permite la identificación de firmas de fosfoproteínas específicas de la enfermedad como biomarcadores potenciales, la baja abundancia y la naturaleza dinámica de las fosfoproteínas plantean grandes desafíos en el desarrollo de fosfoproteínas como biomarcadores11,12. En particular, las fosfoproteínas de baja abundancia encapsuladas dentro de los VE están protegidas de la digestión enzimática externa en el entorno extracelular8. En consecuencia, las VE y las fosfoproteínas derivadas de las VE ofrecen una fuente ideal para el descubrimiento de biomarcadores en la detección temprana del cáncer y otras enfermedades.
Aunque el análisis de la fosforilación de proteínas en las VE ofrece un recurso valioso para comprender la señalización del cáncer y el diagnóstico de la enfermedad en etapa temprana, la falta de métodos eficientes de aislamiento de VE presenta una barrera importante. El aislamiento de EV se logra comúnmente a través de la ultracentrifugación diferencial (DUC)13. Sin embargo, este método requiere mucho tiempo y no tiene implicaciones clínicas debido al bajo rendimiento y la escasa reproducibilidad13,14. Los enfoques alternativos de aislamiento de EV, como la precipitación inducida por polímeros15, están limitados por la baja especificidad debido a la coprecipitación de proteínas no EV. Los enfoques basados en la afinidad, incluida la captura de afinidad basada en anticuerpos16 y la filtración de afinidad17, ofrecen una mayor especificidad, pero están restringidos a una tasa de recuperación relativamente baja debido al pequeño volumen.
Para abordar los problemas en la exploración de la dinámica de las fosfoproteínas en las VE, nuestro grupo ha desarrollado la técnica de recuperación y purificación total de vesículas extracelulares (EVtrap) basada en la afinidad química para capturar las VE en perlas magnéticas funcionalizadas18. Resultados anteriores han demostrado que este método de aislamiento de VE basado en perlas magnéticas es altamente efectivo para aislar EV de una amplia gama de muestras de biofluidos y es capaz de lograr un rendimiento de EV mucho mayor al tiempo que minimiza la contaminación en comparación con DUC y otros métodos de aislamiento existentes18,19. Hemos utilizado con éxito EVtrap y un método de enriquecimiento de fosfopéptidos a base de titanio desarrollado por nuestro grupo20 para perfilar el fosfoproteoma de los VE derivados de diversos biofluidos y para detectar potenciales biomarcadores de fosfoproteínas para diversas enfermedades 19,21,22.
A continuación, presentamos un protocolo basado en EVtrap para el aislamiento de vehículos eléctricos circulantes. El protocolo se centra en los EV urinarios. También demostramos la caracterización de EVs aislados mediante Western blot. A continuación, detallamos la preparación de la muestra y la adquisición por espectrometría de masas (MS) para los análisis proteómicos y fosfoproteómicos. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo eficiente y reproducible para perfilar el proteoma y el fosfoproteoma urinarios de la VE, lo que facilitará la realización de nuevos estudios sobre las VE y sus aplicaciones clínicas23.
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Protocol
Todas las muestras de orina se recogieron de individuos sanos después del consentimiento informado. Los experimentos cumplieron con todos los estándares éticos que involucran muestras humanas y se ajustan a las pautas del Programa de Protección de la Investigación Humana de la Universidad de Purdue.
1. Recogida de muestras
- Centrifugar 12 mL de muestra de orina en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL durante 10 min a 2.500 x g, 4 °C para eliminar restos celulares y cuerpos apoptóticos grandes.
- Transfiera 10 ml del sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml y proceda con el aislamiento EV.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, y las muestras se pueden almacenar a -80 °C y descongelar a 37 °C tras su uso.
2. Aislamiento de vehículos eléctricos mediante el enfoque EVtrap
- Agregue 0,5 ml de tampón de carga (relación 1:10 v/v) y 100 μl de lodo de perlas EVtrap (relación 1:50 v/v) a la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Incubar la muestra mediante rotación de extremo a extremo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Granule la muestra colocando el tubo cónico de 15 ml en una rejilla separadora magnética. Retire el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetear suavemente para volver a suspender las perlas unidas a EV.
- Coloque el tubo en una rejilla separadora magnética de tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y aspire el sobrenadante. Utilice una pipeta P200 para aspirar completamente el sobrenadante y evitar aspirar las perlas.
- Lave las perlas con 1 ml de tampón de lavado. Agregue el tampón inmediatamente después de aspirar el sobrenadante para evitar que las perlas se sequen.
- Lave las perlas 2 veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente.
- Incubar las perlas con 100 μL de trietilamina 100 mM recién preparada durante 10 min a temperatura ambiente y recoger la solución eluida que contiene EV utilizando una gradilla separadora magnética de tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
NOTA: Para preparar 1 ml de trietilamina 100 mM, diluya 14 μl de solución de trietilamina en agua. - Repita el paso 2.8 y combine las soluciones eluidas. Secar el eluido con un concentrador centrífugo de vacío a 4 °C.
NOTA: El experimento se puede pausar aquí. Las muestras secas de EV pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses sin efectos adversos en los siguientes pasos ni en los resultados.
3. Caracterización de las VE por Western blot
- Resuspender el 5% de la muestra seca de EV (equivalente a 0,5 ml de la muestra de orina) en 20 μl de tampón de muestra de 1x dodecil sulfato de litio (LDS) con 10 mM de ditiotreitol (DTT).
NOTA: Los EV de 0,5 ml de orina son suficientes para detectar la señal de CD9 (un marcador EV24) en la transferencia de WESTERN. - Hervir la muestra durante 5 min a 95 °C. Cargar la muestra en un gel de poliacrilamida y realizar electroforesis e inmunotransferencia siguiendo los protocolos estándar25.
- Después de transferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de baja fluorescencia, bloquee la membrana con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en solución salina tween-20 (TBST) tamponada con trís durante 1 h a temperatura ambiente. Para preparar 1 L de tampón TBST, agregue 19 mM de Tris base, 137 mM de NaCl y 1 mL de Tween-20; ajuste el pH a 7.4 usando HCl.
- Incubar la membrana con el anticuerpo anti-CD9 de conejo en una proporción de 1:5.000 en BSA al 1% en TBST a 4 °C durante la noche o durante 2 h a temperatura ambiente.
- Lave la membrana 3 veces durante 5 minutos cada una con TBST. Incubar la membrana con anticuerpos secundarios ligados a HRP contra la IgG de conejo en una proporción de 1:5000 en BSA al 1% en TBST durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la membrana 3 veces durante 5 minutos cada una con TBST. Agregue los sustratos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) obtenidos comercialmente (relación 1:1) en la membrana y detecte señales en un sistema de imágenes de quimioluminiscencia.
4. Preparación de muestras para análisis proteómico y fosfoproteómico
- Prepare un tampón de lisis fresco que contenga 12 mM de desoxicolato de sodio (SDC), 12 mM de laurelil sarcosinato de sodio (SLS), 100 mM de tampón de bicarbonato de trietilamonio (TEAB), 10 mM de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 40 mM de cloroacetamida (CAA) y 1 cóctel de inhibidores de fosfatasa.
NOTA: Las soluciones madre se enumeran en la descripción de la Tabla de Materiales. El tampón de lisis se prepara añadiendo las soluciones madre para conseguir las concentraciones deseadas en función del volumen requerido. - Solubilizar la muestra seca de EV en 100 μL de tampón de lisis y calentar la muestra durante 10 min a 95 °C con agitación a 1.100 rpm.
- Después de enfriar la muestra a temperatura ambiente, diluirla cinco veces añadiendo 400 μL de 50 mM de TEAB.
- Mida la concentración de proteínas con un kit de ensayo de BCA según las instrucciones del fabricante. Utilice el tampón de lisis diluido cinco veces con 50 mM de TEAB como blanco.
- Añadir la mezcla de tripsina/Lys-C a una proporción enzima-proteína de 1:50 p/p e incubar la muestra a 37 °C durante la noche agitando a 1.100 rpm.
- Añadir 50 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 10% para acidificar la muestra.
- Añadir 600 μL de acetato de etilo a las muestras y vortexar la mezcla durante 2 min.
- Centrifugar la muestra durante 3 min a 20.000 x g y retirar la capa superior (capa orgánica). Evite perturbar la interfaz durante la aspiración.
- Repita los pasos 4.7 y 4.8. Secar la fase acuosa con un concentrador centrífugo de vacío.
- Vuelva a suspender la muestra seca en 200 μL de AGT al 0,1 % para acidificar los péptidos y desalar la muestra con una punta desalinizadora C18 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Acondicionar la punta con 200 μL de AGT al 0,1% en acetonitrilo al 80%, seguido de 2x con 200 μL de AGT al 0,1%. Cargue la muestra de péptido acidificado en la punta y luego lave la punta 3 veces con 200 μL de AGT al 0,1%. Eluir los péptidos con 200 μL de AGT al 0,1% en acetonitrilo al 80%.
- Seque el eluido con un concentrador de centrífuga al vacío. Secar el 2% de la muestra peptídica (equivalente a 0,2 mL de la muestra de orina) por separado para el análisis proteómico. Utilizar el resto (98%) de la muestra para el análisis de fosfoproteómica.
- Enriquezca los fosfopéptidos de la muestra utilizando un kit de enriquecimiento de fosfopéptidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realice los pasos que se describen a continuación para el enriquecimiento.
- Vuelva a suspender la muestra seca en 200 μL de tampón de carga. Añadir 50 μL de las perlas a la muestra y agitar vigorosamente durante 20 min a temperatura ambiente. Cargue la muestra con las perlas en la punta fritada y centrifugue durante 1 min a 100 x g.
- Lave la punta con 200 μL de tampón de carga, seguido del tampón de lavado 1 y, a continuación, del tampón de lavado 2. Realice los tres pasos de lavado centrifugando una vez durante 2 min a 20 x g y otra vez durante 1 min a 100 x g.
- Coloque la punta con perlas en un tubo nuevo para recoger los fosfopéptidos eluidos. Añadir 50 μL de tampón de elución a la punta y centrifugar una vez durante 2 min a 20 x g. Añadir otros 50 μL de tampón de elución a la punta y centrifugar una vez durante 2 min a 20 x g. Centrifugar una última vez durante 1 min a 100 x g.
- Secar los fosfopéptidos eluidos utilizando un concentrador centrífugo al vacío.
5. Análisis LC-MS/MS
NOTA: Se pueden utilizar diferentes sistemas/configuraciones LC-MS/MS y métodos de adquisición de datos, como la adquisición dependiente de datos (DDA).
- Vuelva a suspender las muestras secas de proteoma/fosfoproteoma en ácido fórmico al 0,1 % (disolvente A) y cargue las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Inyecte las muestras en MS de tiempo de vuelo de movilidad iónica atrapada a través del sistema de cromatografía líquida (LC) y utilice el método estandarizado preestablecido Whisper 40 muestras por día. Los péptidos se separan en una columna C18 de 15 cm (75 μm de diámetro interior, 1,9 μm de tamaño de partícula) como se menciona en la Tabla de Materiales.
- Para el análisis proteómico, adquiera datos utilizando un método de adquisición de adquisición en serie combinado con un método de adquisición independiente de datos (dia-PASEF) con un rango de masa por rampa que abarca de 300 a 1200 m/z y de 0,6 a 1,50 1/K0 con un tiempo de ciclo de 1,38 s.
- Para el análisis de fosfoproteómica, adquiera datos utilizando un método de adquisición dia-PASEF con un rango de masa por rampa que abarca de 400-1550 m/z y 0,6-1,50 1/K0 con un tiempo de ciclo de 1,38 s.
- Cargue los archivos sin procesar en el software de proteómica y realice la extracción, identificación y cuantificación de señales mediante un flujo de trabajo de adquisición de datos independiente sin bibliotecas.
- Para la configuración de búsqueda, utilice la base de datos de Homo sapiens , tipos específicos de digestión con enzimas tripsina/P, 7 longitudes peptídicas mínimas, 52 longitudes peptídicas máximas, dos escisiones perdidas, carbamidometilo en la cisteína como modificación fija, proteína acetil N-term, oxidación en metionina y fosforilación en serina, treonina y tirosina (para análisis de fosfoproteómica) como modificaciones variables y 5 como modificaciones variables máximas. Establezca el FDR en PSM, peptídico y grupo de proteínas en 0,01.
NOTA: En este protocolo se utilizó el software Spectronaut. También se utilizan habitualmente otros programas de búsqueda de datos de DIA, como DIA-NN y PEAKS. Si los datos se adquirieron en modo DDA, se aplican software como MaxQuant y Proteome Discoverer.
- Para la configuración de búsqueda, utilice la base de datos de Homo sapiens , tipos específicos de digestión con enzimas tripsina/P, 7 longitudes peptídicas mínimas, 52 longitudes peptídicas máximas, dos escisiones perdidas, carbamidometilo en la cisteína como modificación fija, proteína acetil N-term, oxidación en metionina y fosforilación en serina, treonina y tirosina (para análisis de fosfoproteómica) como modificaciones variables y 5 como modificaciones variables máximas. Establezca el FDR en PSM, peptídico y grupo de proteínas en 0,01.
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Representative Results
Este protocolo demuestra un flujo de trabajo completo desde el aislamiento de los VE hasta los análisis de proteómica y fosfoproteómica posteriores (Figura 1). Las muestras de orina por triplicado se sometieron a aislamiento EV. Los VE aislados se caracterizaron mediante Western blot y posteriormente se procesaron para la preparación de muestras proteómicas basadas en espectrometría de masas, incluida la extracción de proteínas, la digestión enzimática y la limpieza de péptidos. Para el análisis de fosfoproteómica, los fosfopéptidos se enriquecieron aún más a base de nanopolímeros solubles funcionalizados con iones metálicos. Tanto las muestras peptídicas como las de fosfopéptidos se analizaron mediante espectrometría de masas de movilidad iónica de alta resolución en modo independiente de los datos. Los archivos sin procesar resultantes se buscaron en la base de datos de Homo sapiens , y se realizó un flujo de trabajo de adquisición independiente de datos sin biblioteca para la identificación y cuantificación a nivel MS2.
Para caracterizar los VE aislados y estimar el rendimiento de recuperación, primero cargamos un equivalente a 0,5 ml de orina que contenía VE en el gel para Western blot para detectar el marcador de EV CD9 (Figura 2A). Además, se incluyeron los VE aislados del mismo volumen de orina utilizando el método más utilizado para el aislamiento de VE, la ultracentrifugación diferencial (DUC), para la comparación. Los resultados mostraron que EVtrap fue capaz de producir señales CD9 mucho más altas en comparación con DUC, lo que indica una captura efectiva de EV por las perlas. Otros valores cuantitativos para cada señal de banda CD9 demostraron que EVtrap logró un rendimiento de recuperación de ~99% en comparación con la intensidad de 5 veces del control directo de orina, mientras que DUC solo recuperó ~1,5% de EV (Figura 2B).
Al cargar el 2% de cada muestra en el LC-MS/MS para el perfil proteómico, identificamos > 11.000 péptidos únicos de ~2.200 proteínas únicas (Figura 3A), lo que indica que este flujo de trabajo proporciona una cobertura en profundidad del proteoma EV. Se observó un alto grado de superposición en las identificaciones de proteínas entre las muestras, con un 72% de proteínas únicas identificadas consistentemente en las tres réplicas (Figura 3B). Además, se compararon los resultados de la identificación con la base de datos ExoCarta (Figura 3C)26. En particular, de los 100 principales marcadores y proteínas EV, identificamos con éxito ~ 90 de estas proteínas EV, lo que sugiere un perfil imparcial y completo de las proteínas EV a través de este análisis proteómico. Para evaluar la precisión cuantitativa, evaluamos además la distribución de los coeficientes de variación (CV) para los resultados de la cuantificación de proteínas (Figura 3D). Un CV medio bajo (5,7%) indica la alta reproducibilidad y fiabilidad del procedimiento, incluyendo el aislamiento de EV, la preparación de la muestra y la detección de SM.
Para el análisis de fosfoproteómica, utilizamos el 98% de cada muestra peptídica para el enriquecimiento de fosfopéptidos e identificamos ~800 fosfopéptidos únicos correspondientes a ~350 fosfoproteínas únicas (Figura 4A). El enriquecimiento produjo un promedio de 72% de péptidos de fosfoserina (pS), 22% de fosfotreonina (pT) y 6% de péptidos de fosfotirosina (pY), respectivamente (Figura 4B). En cuanto a la reproducibilidad de la identificación de las tres réplicas, el 42% de los fosfopéptidos fueron identificados por los tres análisis, y hubo una superposición de ~50% entre cada dos análisis (Figura 4C). Se determinó un CV medio de 21,8% para la cuantificación de fosfopéptidos, lo que sugiere una reproducibilidad cuantitativa aceptable utilizando este protocolo (Figura 4D).
Figura 1: Flujo de trabajo esquemático utilizado para el aislamiento de vesículas extracelulares (VE) urinarias y análisis posteriores. Las VE se aíslan de muestras de orina a través del enfoque de recuperación y purificación total de vesículas extracelulares (EVtrap), y las VE aisladas se someten directamente al análisis de Western blot. Para el análisis LC-MS/MS, las proteínas se extraen de los VE y se digieren en péptidos. Las muestras de péptidos después de los pasos de limpieza se pueden utilizar para el análisis proteómico o el análisis fosfoproteómico después del enriquecimiento de fosfopéptidos. Tanto las muestras de proteómica como las de fosfoproteómica se analizan mediante LC-MS/MS. A continuación, la identificación y la cuantificación se realizan mediante el método de flujo de trabajo de adquisición independiente de datos (DIA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de VE aisladas por Western blot. (A) Detección del marcador EV CD9 a partir de 0,1 ml de muestra de orina directa (n = 1), VE aislados mediante el método de centrifugación diferencial (DUC) (n = 3) y VE aislados mediante el enfoque EVtrap (n = 3). (B) La cuantificación de las señales de Western blot en (A) se presenta como el porcentaje de recuperación en relación con la muestra de orina directa (intensidad de 5 veces = 100%). Para las muestras DUC y EVtrap, el diagrama de barras muestra las intensidades medias y las desviaciones estándar (representadas por barras de error) de los triplicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis proteómico de EVs aislados . (A) El número total de proteínas y péptidos únicos identificados por triplicado. (B) Diagrama de Venn que muestra la superposición en proteínas únicas identificadas entre réplicas. (C) El número de proteínas únicas identificadas correspondientes a los 100 principales marcadores de EV en la base de datos ExoCarta. (D) Gráfico de densidad que muestra la distribución del coeficiente de variación (CV) para la cuantificación de proteínas. El valor CV mediano se resalta con una línea discontinua roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis fosfoproteómico de VE aislados . (A) El número total de fosfoproteínas y fosfopéptidos únicos identificados por triplicado. (B) Composición porcentual de los péptidos pSTY después del enriquecimiento de fosfopéptidos. (C) Diagrama de Venn que muestra la superposición de fosfopéptidos únicos identificados entre réplicas. (D) Gráfico de densidad que muestra la distribución de CV para la cuantificación de fosfopéptidos. El valor CV mediano se resalta con una línea discontinua roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El aislamiento eficaz de las VE es un requisito previo esencial para detectar proteínas y fosfoproteínas de baja abundancia en las VE. A pesar del desarrollo de numerosos métodos para satisfacer esta necesidad, la mayoría todavía sufren de limitaciones como una recuperación deficiente o una baja reproducibilidad, que impiden su utilización en estudios a gran escala y entornos clínicos rutinarios. El DUC se considera generalmente como el método más común para el aislamiento de los vehículos eléctricos, y los pasos de lavado adicionales se aplican normalmente para ayudar a aumentar la pureza de los vehículos eléctricos objetivo27,28. Este procedimiento conduce a un proceso DUC más tedioso y lento (> 6 h). Además, el bajo rendimiento de recuperación de EV después de DUC ha sido reportado por múltiples estudios,29,30 y mostrado en los resultados de la Figura 2. En comparación, EVtrap ofrece un aislamiento eficiente de EV (< 1 h) y un alto rendimiento de recuperación (Figura 2). En particular, la aplicación exitosa de este flujo de trabajo marca un avance crucial para la identificación de marcadores significativos de VE para diversas enfermedades y cánceres 19,21,22 Sin embargo, EVtrap es incapaz de aislar subpoblaciones específicas de VE, como microvesículas o exosomas, ya que captura toda la población de VE.
En este protocolo, utilizamos el 2% y el 98% de la muestra peptídica para análisis proteómicos y fosfoproteómicos. Dado que los EV aislados de 10 ml de orina por EVtrap suelen producir entre 100 y 200 μg de proteínas totales, el 98% de los péptidos después de la digestión y la limpieza son suficientes para el enriquecimiento de fosfopéptidos. Si se requiere un paso de etiquetado, como el etiquetado de etiquetas de masa en tándem (TMT), para el análisis cuantitativo de MS, se puede realizar la medición de la concentración de péptidos después del paso de desalinización para normalizar la cantidad de péptidos y mejorar la precisión de la cuantificación31.
Si bien este protocolo destaca principalmente el uso de EVtrap para aislar EV urinarios, cabe mencionar que se ha demostrado la versatilidad de este enfoque en el procesamiento de varios tipos de muestras32,33,34. Con base en los resultados previos, la condición utilizada en este protocolo fue aplicable para aislar EV de medios de cultivo celular. Para el aislamiento de las VE secretadas por células, las células se cultivan en condiciones de FBS libres de suero bovino fetal (FBS) o sin EV para evitar el coaislamiento de las VE derivadas de FBS excesivas con las VE secretadas por células, lo que socavará la fiabilidad de los resultados35. Además, las VE aisladas de otros tipos de muestras se pueden caracterizar mediante el análisis de Western blot utilizando varios marcadores comunes de EV, incluidos CD9, CD63, CD81, la proteína 101 del gen de susceptibilidad tumoral (TSG101) y la proteína X que interactúa con ALG-2 (ALIX)36.
Para aumentar la cobertura y mejorar la cuantificación en el análisis de MS, la creación de una biblioteca específica del proyecto para buscar datos DIA es una opción alternativa. Debido a la complejidad de los espectros producidos en el modo DIA, una biblioteca espectral que contenga una colección de espectros de referencia es beneficiosa para aumentar la confianza en la identificación y mejorar la cobertura. Se pueden generar bibliotecas espectrales de alta calidad realizando análisis DDA en las mismas muestras o en muestras prefraccionadas37. La biblioteca también se puede utilizar para determinar las ventanas óptimas para dia-PASEF y mejorar aún más la identificación38.
En conjunto, el protocolo presentado proporciona un método sencillo y eficaz para aislar las VE de las muestras de orina para los análisis proteómicos y fosfoproteómicos. Con la implementación de este protocolo, esperamos mejorar la detección de proteínas y fosfoproteínas EV de baja abundancia como biomarcadores para la detección de enfermedades en etapa temprana y el monitoreo longitudinal. Además, los investigadores tienen la gran oportunidad de avanzar en el campo de la investigación de los VE y contribuir a mejorar las estrategias diagnósticas y terapéuticas.
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Disclosures
Los autores declaran un interés financiero contrapuesto. Anton Iliuk y W. Andy Tao son cofundadores de Tymora Analytical Operations, que desarrolló las perlas EVtrap y comercializó el kit de enriquecimiento de fosfopéptidos PolyMAC.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido financiado en parte por las subvenciones de los NIH 3RF1AG064250 y R44CA239845.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
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