Summary
O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos têm recentemente ganhado atenção significativa no campo da biópsia líquida. Liberados por quase todos os tipos de células, eles fornecem um instantâneo em tempo real das células hospedeiras e contêm uma riqueza de informações moleculares, incluindo proteínas, em particular aquelas com modificações pós-traducionais (PTMs), como a fosforilação, como o principal ator das funções celulares e do início e progressão da doença. No entanto, o isolamento de EVs de biofluidos permanece desafiador devido aos baixos rendimentos e impurezas dos métodos atuais de isolamento de EV, dificultando a análise a jusante de cargas de EV, como fosfoproteínas de EV. Aqui, descrevemos um método rápido e eficaz de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas funcionalizadas para isolamento de EV de biofluidos como urina humana e análise proteômica a jusante e fosfoproteômica após isolamento de EV. O protocolo possibilitou um alto rendimento de recuperação de EVs urinários e perfis sensíveis de proteoma EV e fosfoproteoma. Além disso, a versatilidade deste protocolo e considerações técnicas relevantes também são abordadas aqui.
Introduction
As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas encapsuladas em membrana secretadas por todos os tipos de células e estão presentes em biofluidos como sangue, urina, saliva, etc.1,2,3,4. Os EVs carregam uma carga de diversas moléculas bioativas que refletem o estado fisiológico e patológico de suas células hospedeiras e, portanto, funcionam como fatores cruciais na progressão da doença 4,5,6. Além disso, extensos estudos estabeleceram que marcadores da doença baseados em EV podem ser identificados antes do início dos sintomas ou da detecção fisiológica de tumores5,6,7.
A fosforilação atua como um mecanismo chave na sinalização e regulação celular. Portanto, as fosfoproteínas fornecem uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores, uma vez que eventos aberrantes de fosforilação estão associados a vias de sinalização celular desreguladas e ao desenvolvimento de doenças metastáticas, como o câncer8,9,10. Embora a dinâmica de fosforilação do perfil permita a identificação de assinaturas de fosfoproteínas doença-específicas como potenciais biomarcadores, a baixa abundância e a natureza dinâmica das fosfoproteínas representam grandes desafios no desenvolvimento de fosfoproteínas como biomarcadores11,12. Notavelmente, as fosfoproteínas pouco abundantes encapsuladas em EVs são protegidas da digestão enzimática externa no ambiente extracelular8. Consequentemente, EVs e fosfoproteínas derivadas de EV oferecem uma fonte ideal para a descoberta de biomarcadores na detecção em estágio inicial de câncer e outras doenças.
Embora a análise da fosforilação de proteínas em EVs ofereça um recurso valioso para a compreensão da sinalização do câncer e do diagnóstico de doenças em estágio inicial, a falta de métodos eficientes de isolamento de EV apresenta uma grande barreira. O isolamento da EV é comumente obtido por ultracentrifugação diferencial (DUC)13. No entanto, esse método é demorado e não é adequado para implicações clínicas devido ao baixo rendimento e à baixa reprodutibilidade13,14. Abordagens alternativas de isolamento de EV, como a precipitação induzida por polímero15, são limitadas pela baixa especificidade devido à co-precipitação de proteínas não-EV. Abordagens baseadas em afinidade, incluindo captura de afinidade baseada em anticorpos16 e filtração por afinidade17, oferecem especificidade aprimorada, mas são restritas a uma taxa de recuperação relativamente baixa devido ao pequeno volume.
Para abordar as questões na exploração da dinâmica de fosfoproteínas em EVs, nosso grupo desenvolveu a técnica de recuperação e purificação total de vesículas extracelulares (EVtrap) baseada na afinidade química para capturar EVs em esferas magnéticas funcionalizadas18. Resultados anteriores demonstraram que este método de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas é altamente eficaz no isolamento de EVs de uma ampla gama de amostras de biofluidos e é capaz de alcançar um rendimento de EV muito maior, minimizando a contaminação em comparação com o DUC e outros métodos de isolamento existentes18,19. Utilizamos com sucesso o EVtrap e um método de enriquecimento de fosfopeptídeos à base de titânio desenvolvido por nosso grupo20 para traçar o perfil do fosfoproteoma de EVs derivados de diversos biofluidos e detectar potenciais biomarcadores de fosfoproteínas para várias doenças 19,21,22.
Aqui, apresentamos um protocolo baseado no EVtrap para o isolamento de EVs circulantes. O protocolo se concentra nos EVs urinários. Nós também demonstramos a caracterização de EVs isolados usando western blotting. Em seguida, detalhamos a preparação da amostra e a aquisição por espectrometria de massas (MS) para análises proteômicas e fosfoproteômicas. Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho eficiente e reprodutível para o perfil do proteoma urinário do EV e do fosfoproteoma, o que facilitará estudos adicionais sobre EVs e suas aplicações clínicas23.
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Protocol
Todas as amostras de urina foram coletadas de indivíduos saudáveis após consentimento informado. Os experimentos estavam em conformidade com todos os padrões éticos envolvendo amostras humanas e em conformidade com as diretrizes do Programa de Proteção à Pesquisa em Seres Humanos da Universidade de Purdue.
1. Coleta de amostras
- Centrifugar 12 mL de amostra de urina em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL por 10 min a 2.500 x g, 4 °C para remover restos celulares e grandes corpos apoptóticos.
- Transfira 10 mL do sobrenadante para um novo tubo de 15 mL e prossiga com o isolamento EV.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser armazenadas a -80 °C e descongeladas a 37 °C após o uso.
2. Isolamento de EV usando a abordagem EVtrap
- Adicionar 0,5 ml de tampão de carga (relação 1:10 v/v) e 100 μL de pasta de esferas EVtrap (relação 1:50 v/v) à amostra de acordo com as instruções do fabricante.
- Incubar a amostra por rotação de ponta a ponta durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Pastilhar a amostra colocando o tubo cônico de 15 mL em um rack separador magnético. Remova o sobrenadante.
- Ressuspender as esferas em 1 mL de tampão de lavagem e transferir a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipetar suavemente para ressuspender as contas ligadas ao EV.
- Coloque o tubo em um rack separador magnético de tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e aspirar o sobrenadante. Use uma pipeta P200 para aspirar completamente o sobrenadante e evitar aspirar as contas.
- Lave as contas com 1 mL de tampão de lavagem. Adicione o tampão imediatamente após aspirar o sobrenadante para evitar que as contas sequem.
- Lavar as esferas 2x com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente.
- Incubar as esferas com 100 μL de trietilamina 100 mM recém-preparada durante 10 minutos à temperatura ambiente e recolher a solução eluída contendo EV utilizando um separador magnético de tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Para preparar 1 mL de trietilamina 100 mM, diluir 14 μL de solução de trietilamina em água. - Repetir o passo 2.8 e combinar as soluções eluídas. Secar o eluato utilizando um concentrador centrífugo a vácuo a 4 °C.
NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. As amostras secas de EV podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses sem efeitos adversos nas etapas seguintes ou nos resultados.
3. Caracterização de EVs por western blotting
- Ressuspender 5% da amostra de EV seca (equivalente a 0,5 mL da amostra de urina) em 20 μL de tampão de amostra 1x dodecil sulfato de lítio (LDS) com 10 mM de ditiotreitol (TDT).
NOTA: EVs de 0,5 mL de urina são suficientes para detectar o sinal CD9 (um marcador EV24) no western blotting. - Ferver a amostra durante 5 min a 95 °C. Carregar a amostra em gel de poliacrilamida e realizar eletroforese e immunoblotting seguindo protocolos padronizados25.
- Após a transferência das proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de baixa fluorescência, bloquear a membrana com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução salina tamponada trefóide-20 (TBST) por 1 h à temperatura ambiente. Para preparar 1 L de tampão TBST, adicionar 19 mM Tris base, 137 mM NaCl e 1 mL de Tween-20; ajustar o pH para 7,4 usando HCl.
- Incubar a membrana com anticorpo anti-CD9 de coelho na proporção de 1:5.000 em BSA a 1% em TBST a 4 °C durante a noite ou por 2 h à temperatura ambiente.
- Lave a membrana 3x por 5 min cada com TBST. Incubar a membrana com IgG anti-coelho, anticorpo secundário ligado à HRP na proporção de 1:5000 em BSA a 1% em TBST por 1 h à temperatura ambiente.
- Lave a membrana 3x por 5 min cada com TBST. Adicione os substratos de quimioluminescência aprimorada (ECL) obtidos comercialmente (proporção 1:1) à membrana e detecte sinais em um sistema de imagem por quimioluminescência.
4. Preparo de amostras para análise proteômica e fosfoproteômica
- Preparar tampão de lise fresco contendo 12 mM de desoxicolato de sódio (SDC), 12 mM de lauroyl sarcosinato de sódio (SLS), 100 mM tampão de bicarbonato de trietilamónio (TEAB), 10 mM de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 40 mM de cloroacetamida (CAA) e 1x cocktails de inibidores de fosfatase.
NOTA: As soluções de estoque estão listadas na descrição da Tabela de Materiais. O tampão de lise é preparado adicionando as soluções-mãe para atingir as concentrações desejadas dependendo do volume necessário. - Solubilizar a amostra de EV seca em 100 μL de tampão de lise e aquecer a amostra durante 10 min a 95 °C com agitação a 1.100 rpm.
- Depois de arrefecer a amostra à temperatura ambiente, diluir-a cinco vezes adicionando 400 μL de TEAB 50 mM.
- Meça a concentração de proteína usando um kit de ensaio de BCA de acordo com as instruções do fabricante. Use o tampão de lise diluído cinco vezes com TEAB 50 mM como branco.
- Adicionar a mistura de tripsina/Lis-C a 1:50 p/p de relação enzima/proteína e incubar a amostra a 37 °C durante a noite com agitação a 1.100 rpm.
- Adicionar 50 μL de ácido trifluoroacético (TFA) a 10% para acidificar a amostra.
- Adicionar 600 μL de acetato de etila às amostras e agitar a mistura durante 2 min.
- Centrifugar a amostra por 3 min a 20.000 x g e remover a camada superior (camada orgânica). Evite perturbar a interface durante a aspiração.
- Repita as etapas 4.7-4.8. Secar a fase aquosa usando um concentrador centrífugo a vácuo.
- Ressuspender a amostra seca em 200 μL de TFA 0,1% para acidificar peptídeos e dessalgar a amostra usando uma ponta de dessalinização C18 de acordo com as instruções do fabricante. Condicionar a ponta com 200 μL de TFA 0,1% em acetonitrila a 80%, seguido de 2x com 200 μL de TFA 0,1%. Coloque a amostra de peptídeo acidificado na ponta e, em seguida, lave a ponta 3x com 200 μL de TFA 0,1%. Eluir os peptídeos com 200 μL de TFA 0,1% em acetonitrila a 80%.
- Secar o eluato usando um concentrador centrífugo a vácuo. Secar 2% da amostra de peptídeo (equivalente a 0,2 mL da amostra de urina) separadamente para análise proteômica. Utilizar o restante (98%) da amostra para análise fosfoproteômica.
- Enriqueça os fosfopeptídeos da amostra usando um kit de enriquecimento de fosfopeptídeos de acordo com as instruções do fabricante. Execute as etapas descritas abaixo para enriquecimento.
- Ressuspender a amostra seca em 200 μL de tampão de carga. Adicionar 50 μL das contas à amostra e agitar vigorosamente durante 20 minutos à temperatura ambiente. Coloque a amostra com as contas na ponta frita e centrifuja por 1 min a 100 x g.
- Lavar a ponta com 200 μL de tampão de carga, seguido de lavar o tampão de lavagem 1 e, em seguida, lavar o tampão 2. Execute as três etapas de lavagem centrifugando uma vez por 2 min a 20 x g e uma vez por 1 min a 100 x g.
- Coloque a ponta com contas em um novo tubo para coletar os fosfopeptídeos eluídos. Adicionar 50 μL de tampão de eluição à ponta e centrifugar uma vez por 2 min a 20 x g. Adicionar mais 50 μL de tampão de eluição à ponta e centrifugar uma vez por 2 min a 20 x g. Centrifugar uma última vez por 1 min a 100 x g.
- Secar os fosfopeptídeos eluídos usando um concentrador centrífugo a vácuo.
5. Análise de LC-MS/MS
NOTA: Diferentes sistemas/configurações LC-MS/MS e métodos de aquisição de dados, como aquisição dependente de dados (DDA) podem ser usados.
- Ressuspender as amostras secas de proteoma/fosfoproteoma em ácido fórmico a 0,1% (solvente A) e carregar as amostras de acordo com as instruções do fabricante.
- Injetar as amostras em MS de tempo de voo de mobilidade iônica aprisionada através do sistema de cromatografia líquida (LC) e usar o método padronizado predefinido Whisper 40 amostras por dia. Os peptídeos são separados em uma coluna C18 de 15 cm (75 μm de diâmetro interno, tamanho de partícula de 1,9 μm) conforme mencionado na Tabela de Materiais.
- Para análise proteômica, adquira dados usando um método de aquisição de acumulação paralela-fragmentação seriada combinado com aquisição independente de dados (dia-PASEF) com uma faixa de massa por rampa abrangendo de 300-1200 m/z e de 0,6-1,50 1/K0 com um tempo de ciclo de 1,38 s.
- Para a análise fosfoproteômica, adquirir dados usando um método de aquisição dia-PASEF com uma faixa de massa por rampa abrangendo de 400-1550 m/z e 0,6-1,50 1/K0 com um tempo de ciclo de 1,38 s.
- Carregue os arquivos brutos no software proteomics e execute a extração, identificação e quantificação de sinais usando um fluxo de trabalho de aquisição independente de dados sem biblioteca.
- Para configurações de pesquisa, use o banco de dados do Homo sapiens , tipos específicos de digestos com enzimas tripsina/P, 7 comprimentos mínimos de peptídeos, 52 comprimentos máximos de peptídeos, duas clivagens perdidas, carbamidometil em cisteína como modificação fixa, proteína acetil N-termo, oxidação em metionina e fosforilação em serina, treonina e tirosina (para análise fosfoproteômica) como modificações variáveis e 5 como modificações variáveis máximas. Defina o FDR no PSM, peptídeo e grupo de proteínas como 0,01.
NOTA: O software Spectronaut foi utilizado neste protocolo. Outros softwares de busca de dados DIA, como DIA-NN e PEAKS, também são comumente usados. Se os dados foram adquiridos no modo DDA, softwares como MaxQuant e Proteome Discoverer são aplicáveis.
- Para configurações de pesquisa, use o banco de dados do Homo sapiens , tipos específicos de digestos com enzimas tripsina/P, 7 comprimentos mínimos de peptídeos, 52 comprimentos máximos de peptídeos, duas clivagens perdidas, carbamidometil em cisteína como modificação fixa, proteína acetil N-termo, oxidação em metionina e fosforilação em serina, treonina e tirosina (para análise fosfoproteômica) como modificações variáveis e 5 como modificações variáveis máximas. Defina o FDR no PSM, peptídeo e grupo de proteínas como 0,01.
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Representative Results
Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho abrangente desde o isolamento de EVs até análises proteômicas e fosfoproteômicas a jusante (Figura 1). As amostras de urina em triplicata foram submetidas ao isolamento EV. Os EVs isolados foram caracterizados por western blotting e subsequentemente processados para preparação de amostras proteômicas baseadas em espectrometria de massa, incluindo extração de proteínas, digestão enzimática e limpeza de peptídeos. Para a análise fosfoproteômica, os fosfopeptídeos foram enriquecidos com base em nanopolímeros solúveis funcionalizados com íons metálicos. Amostras de peptídeos e fosfopeptídeos foram analisadas por espectrometria de massas de mobilidade iônica de alta resolução sob modo independente de dados. Os arquivos brutos dos resultados foram pesquisados no banco de dados do Homo sapiens , e o fluxo de trabalho de aquisição independente de dados livre de biblioteca foi realizado para identificação e quantificação em nível de MS2.
Para caracterizar os EVs isolados e estimar o rendimento de recuperação, primeiramente carregamos um equivalente a 0,5 mL de urina contendo EVs no gel para western blotting para detectar o marcador EV CD9 (Figura 2A). Além disso, incluímos os EVs isolados do mesmo volume de urina usando o método mais utilizado para isolamento de VE, a ultracentrifugação diferencial (DUC), para comparação. Os resultados mostraram que o EVtrap foi capaz de produzir sinais CD9 muito mais altos em comparação com o DUC, indicando uma captura efetiva de EVs pelas contas. Valores quantitativos adicionais para cada sinal da banda CD9 demonstraram que o EVtrap alcançou um rendimento de recuperação de ~99% em comparação com a intensidade de 5 vezes do controle direto da urina, enquanto o DUC recuperou apenas ~1,5% dos EVs (Figura 2B).
Ao carregar 2% de cada amostra no LC-MS/MS para perfil proteômico, identificamos > 11.000 peptídeos únicos de ~2.200 proteínas únicas (Figura 3A), indicando que esse fluxo de trabalho fornece uma cobertura aprofundada do proteoma EV. Um alto grau de sobreposição nas identificações de proteínas entre as amostras foi observado, com 72% de proteínas únicas sendo consistentemente identificadas em todas as três réplicas (Figura 3B). Além disso, comparamos os resultados de identificação com o banco de dados ExoCarta (Figura 3C)26. Notavelmente, dos 100 principais marcadores e proteínas EV, identificamos com sucesso ~90 dessas proteínas EV, sugerindo um perfil imparcial e completo das proteínas EV através desta análise proteômica. Para avaliar a precisão quantitativa, avaliou-se ainda a distribuição dos coeficientes de variação (CV) para os resultados da quantificação das proteínas (Figura 3D). Um baixo CV médio (5,7%) indica a alta reprodutibilidade e confiabilidade do procedimento, incluindo isolamento de VE, preparo da amostra e detecção de EM.
Para a análise fosfoproteômica, utilizamos 98% de cada amostra peptídica para o enriquecimento de fosfopeptídeos e identificamos ~800 fosfopeptídeos únicos correspondentes a ~350 fosfoproteínas únicas (Figura 4A). O enriquecimento produziu uma média de 72% de peptídeos fosfoserina (pS), 22% de fosfotreonina (pT) e 6% de peptídeos de fosfotirosina (pY), respectivamente (Figura 4B). Em termos de reprodutibilidade de identificação das três repetições, 42% dos fosfopeptídeos foram identificados pelas três análises, e houve uma sobreposição de ~50% entre cada duas análises (Figura 4C). Um CV médio de 21,8% foi determinado para a quantificação de fosfopeptídeos, sugerindo uma reprodutibilidade quantitativa aceitável usando este protocolo (Figura 4D).
Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático utilizado para isolamento da vesícula extracelular (VE) urinária e análises a jusante. Os EVs são isolados de amostras de urina através da abordagem de recuperação e purificação total das vesículas extracelulares (EVtrap), e os EVs isolados são diretamente submetidos à análise de western blotting. Para a análise de LC-MS/MS, as proteínas são extraídas de EVs e digeridas em peptídeos. As amostras de peptídeos após as etapas de limpeza podem ser usadas para análise proteômica ou análise fosfoproteômica após o enriquecimento de fosfopeptídeos. Tanto as amostras proteômicas quanto as fosfoproteômicas são analisadas por LC-MS/MS. A identificação e quantificação são então realizadas usando o método de fluxo de trabalho de aquisição independente de dados (DIA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização dos EVs isolados por western blotting. (A) Detecção do marcador EV CD9 a partir de 0,1 mL de amostra de urina direta (n=1), EVs isolados por centrifugação diferencial (DUC) (n=3) e EVs isolados por EVtrap (n=3). (B) A quantificação dos sinais de western blotting em (A) é apresentada como a porcentagem de recuperação em relação à amostra de urina direta (intensidade de 5 vezes = 100%). Para as amostras DUC e EVtrap, o gráfico de barras exibe as intensidades médias e os desvios-padrão (representados por barras de erro) das triplicatas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise proteômica de EVs isolados . (A) O número total de proteínas e peptídeos únicos identificados em triplicatas. (B) Diagrama de Venn mostrando a sobreposição de proteínas únicas identificadas entre réplicas. (C) O número de proteínas únicas identificadas correspondentes aos 100 principais marcadores EV no banco de dados ExoCarta. (D) Gráfico de densidade mostrando a distribuição do coeficiente de variação (CV) para a quantificação de proteínas. O valor mediano do CV é realçado com uma linha tracejada vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise fosfoproteômica de EVs isolados . (A) O número total de fosfoproteínas e fosfopeptídeos únicos identificados em triplicatas. (B) Composição percentual de peptídeos pSTY após enriquecimento com fosfopeptídeos. (C) Diagrama de Venn mostrando a sobreposição de fosfopeptídeos únicos identificados entre réplicas. (D) Gráfico de densidade mostrando a distribuição do CV para quantificação de fosfopeptídeos. O valor mediano do CV é realçado com uma linha tracejada vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O isolamento eficaz de EV é um pré-requisito essencial para detectar proteínas e fosfoproteínas pouco abundantes em EVs. Apesar do desenvolvimento de inúmeros métodos para suprir essa necessidade, a maioria ainda sofre de limitações como má recuperação ou baixa reprodutibilidade, que impedem sua utilização em estudos em larga escala e cenários clínicos de rotina. O DUC é geralmente considerado o método mais comum para o isolamento de EV, e as etapas adicionais de lavagem são normalmente aplicadas para ajudar a aumentar a pureza dos EVs alvo27,28. Esse procedimento leva a um processo de DUC mais tedioso e demorado (> 6 h). Além disso, o baixo rendimento da recuperação da VE após a RCU foi relatado por vários estudos,29,30 e demonstrado nos resultados da Figura 2. Em comparação, o EVtrap oferece isolamento eficiente do EV (< 1 h) e um alto rendimento de recuperação (Figura 2). Notavelmente, a aplicação bem-sucedida desse fluxo de trabalho marca um avanço crucial para a identificação de marcadores significativos de EV para várias doenças e cânceres 19,21,22 No entanto, o EVtrap é incapaz de isolar subpopulações específicas de EVs, como microvesículas ou exossomos, pois captura toda a população de EV.
Neste protocolo, utilizamos 2% e 98% da amostra de peptídeo para análises proteômicas e fosfoproteômicas. Como os EVs isolados de 10 mL de urina por EVtrap tipicamente produzem 100-200 μg de proteínas totais, 98% dos peptídeos após digestão e limpeza são suficientes para o enriquecimento de fosfopeptídeos. Se uma etapa de marcação, como a marcação em tandem mass tag (TMT), for necessária para a análise quantitativa da EM, a medição da concentração de peptídeos após a etapa de dessalinização pode ser realizada para normalizar a quantidade de peptídeo e melhorar a precisão da quantificação31.
Embora esse protocolo destaque principalmente o uso do EVtrap para o isolamento de EVs urinários, vale ressaltar que a versatilidade dessa abordagem tem sido demonstrada no processamento de vários tipos de amostras32,33,34. Com base em resultados anteriores, a condição utilizada neste protocolo foi aplicável para isolar EVs de meios de cultura celular. Para o isolamento de EVs secretados por células, as células são cultivadas sob condições de SFB ou SFB com soro fetal bovino (SFB) para evitar o co-isolamento de EVs derivados de SFB excessivos com EVs secretados por células, o que prejudicará a confiabilidade dos resultados35. Além disso, os EVs isolados de outros tipos de amostra podem ser caracterizados pela análise de western blotting usando vários marcadores EV comuns, incluindo CD9, CD63, CD81, proteína 101 do gene de suscetibilidade tumoral (TSG101) e proteína X de interação com ALG-2 (ALIX)36.
Para aumentar a cobertura e melhorar a quantificação na análise de EM, a construção de uma biblioteca específica do projeto para pesquisar dados DIA é uma opção alternativa. Devido à complexidade dos espectros produzidos no modo DIA, uma biblioteca espectral contendo uma coleção de espectros de referência é benéfica para aumentar a confiança na identificação e melhorar a cobertura. Bibliotecas espectrais de alta qualidade podem ser geradas pela realização de análises DDA nas mesmas amostras ou amostras pré-fracionadas37. A biblioteca também pode ser usada para determinar janelas ideais para dia-PASEF e melhorar ainda mais a identificação38.
Em conjunto, o protocolo apresentado fornece um método simples e eficaz para isolar EVs de amostras de urina para análises proteômicas e fosfoproteômicas. Ao implementar este protocolo, esperamos melhorar a detecção de proteínas EV e fosfoproteínas de baixa abundância como biomarcadores para detecção de doença em estágio inicial e monitoramento longitudinal. Além disso, os pesquisadores têm a grande oportunidade de avançar no campo da pesquisa em EV e contribuir para melhores estratégias diagnósticas e terapêuticas.
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Disclosures
Os autores declaram um interesse financeiro concorrente. Anton Iliuk e W. Andy Tao são co-fundadores da Tymora Analytical Operations, que desenvolveu contas EVtrap e comercializou o kit de enriquecimento de fosfopeptídeos PolyMAC.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelos subsídios do NIH 3RF1AG064250 e R44CA239845.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
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