Summary
Det nuvarande protokollet ger detaljerade beskrivningar för effektiv isolering av extracellulära vesiklar i urinen med hjälp av funktionaliserade magnetiska pärlor. Dessutom omfattar den efterföljande analyser, inklusive western blotting, proteomik och fosfoproteomik.
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) från biovätskor har nyligen fått stor uppmärksamhet inom området flytande biopsi. De frigörs av nästan alla typer av celler och ger en ögonblicksbild i realtid av värdceller och innehåller en mängd molekylär information, inklusive proteiner, särskilt de med posttranslationella modifieringar (PTM) såsom fosforylering, som den viktigaste aktören för cellulära funktioner och sjukdomsdebut och progression. Isoleringen av elfordon från biovätskor är dock fortfarande utmanande på grund av låga utbyten och föroreningar från nuvarande metoder för isolering av elfordon, vilket gör det svårt att analysera elfordonslast, t.ex. fosfoproteiner från elfordon. Här beskriver vi en snabb och effektiv EV-isoleringsmetod baserad på funktionaliserade magnetiska pärlor för EV-isolering från biovätskor såsom humant urin och nedströms proteomik och fosfoproteomikanalys efter EV-isolering. Protokollet möjliggjorde ett högt återhämtningsutbyte av EV i urinen och känsliga profiler av EV-proteom och fosfoproteom. Dessutom tas detta protokolls mångsidighet och relevanta tekniska överväganden också upp här.
Introduction
Extracellulära vesiklar (EV) är membraninkapslade nanopartiklar som utsöndras av alla typer av celler och finns i biovätskor som blod, urin, saliv, etc.1,2,3,4. EV bär en last av olika bioaktiva molekyler som återspeglar värdcellernas fysiologiska och patologiska tillstånd och därför fungerar som avgörande faktorer för sjukdomsprogression 4,5,6. Dessutom har omfattande studier visat att EV-baserade sjukdomsmarkörer kan identifieras innan symtomen börjar eller den fysiologiska upptäckten av tumörer 5,6,7.
Fosforylering fungerar som en nyckelmekanism i cellulär signalering och reglering. Därför utgör fosfoproteiner en värdefull källa för upptäckt av biomarkörer eftersom avvikande fosforyleringshändelser är associerade med dysreglerade cellulära signalvägar och metastaserande sjukdomsutveckling såsom cancer 8,9,10. Även om profilering av fosforyleringsdynamik gör det möjligt att identifiera sjukdomsspecifika fosfoproteinsignaturer som potentiella biomarkörer, utgör fosfoproteiners låga förekomst och dynamiska natur stora utmaningar när det gäller att utveckla fosfoproteiner som biomarkörer11,12. Noterbart är att de lågfrekventa fosfoproteinerna inkapslade i EV är skyddade från extern enzymatisk nedbrytning i den extracellulära miljön8. Följaktligen erbjuder EV och EV-härledda fosfoproteiner en idealisk källa för upptäckt av biomarkörer i ett tidigt skede av upptäckt av cancer och andra sjukdomar.
Även om analys av proteinfosforylering i EV erbjuder en värdefull resurs för att förstå cancersignalering och tidig sjukdomsdiagnos, utgör bristen på effektiva EV-isoleringsmetoder ett stort hinder. EV-isolering uppnås vanligtvis genom differentiell ultracentrifugering (DUC)13. Denna metod är dock tidskrävande och är inte lämplig för kliniska implikationer på grund av låg genomströmning och dålig reproducerbarhet13,14. Alternativa EV-isoleringsmetoder, såsom polymerinducerad utfällning15, begränsas av låg specificitet på grund av samutfällning av icke-EV-proteiner. Affinitetsbaserade metoder, inklusive antikroppsbaserad affinitetsinfångning16 och affinitetsfiltrering17, erbjuder förbättrad specificitet men är begränsade till en relativt låg återvinningsgrad på grund av liten volym.
För att ta itu med problemen med att utforska fosfoproteindynamik i EV har vår grupp utvecklat extracellulära vesiklar total recovery and purification (EVtrap) teknik baserad på kemisk affinitet för att fånga EV på funktionaliserade magnetiska pärlor18. Tidigare resultat har visat att denna magnetiska pärlbaserade EV-isoleringsmetod är mycket effektiv för att isolera EV från ett brett spektrum av biovätskeprover och kan uppnå mycket högre EV-utbyte samtidigt som kontaminering minimeras jämfört med DUC och andra befintliga isoleringsmetoder18,19. Vi har framgångsrikt använt EVtrap och en titanbaserad fosfopeptidanrikningsmetod som utvecklats av vår grupp20 för att profilera fosfoproteomet hos EV som härrör från olika biovätskor och för att detektera potentiella fosfoproteinbiomarkörer för olika sjukdomar 19,21,22.
Här presenterar vi ett protokoll baserat på EVtrap för isolering av cirkulerande elbilar. Protokollet fokuserar på urinvägarna. Vi demonstrerar också karakteriseringen av isolerade elfordon med hjälp av western blotting. Vi beskriver sedan provberedningen och masspektrometrin (MS) för både proteomik- och fosfoproteomikanalyser. Detta protokoll ger ett effektivt och reproducerbart arbetsflöde för profilering av EV-proteomet och fosfoproteomet i urinen, vilket kommer att underlätta ytterligare studier av EV och deras kliniska tillämpningar23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla urinprover samlades in från friska individer efter informerat samtycke. Experimenten överensstämde med alla etiska standarder som involverade mänskliga prover och överensstämmer med riktlinjerna från Purdue University Human Research Protection Program.
1. Provtagning
- Centrifugera 12 ml urinprov i ett 15 ml koniskt centrifugrör i 10 minuter vid 2 500 x g, 4 °C för att avlägsna cellskräp och stora apoptotiska kroppar.
- Överför 10 ml av supernatanten till ett nytt 15 ml rör och fortsätt med EV-isolering.
OBS: Protokollet kan pausas här, och samples kan förvaras vid -80 °C och tinas vid 37 °C vid användning.
2. Isolering av elfordon med EVtrap-metoden
- Tillsätt 0,5 ml belastningsbuffert (förhållande 1:10 v/v) och 100 μl EVtrap-pärlslam (förhållande 1:50 v/v) till provet enligt tillverkarens anvisningar.
- Inkubera provet genom rotation från ände till ände i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Pelletera provet genom att placera det 15 ml koniska röret på ett magnetiskt separatorställ. Ta bort supernatanten.
- Återsuspendera pärlorna i 1 ml tvättbuffert och överför suspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pipettera försiktigt för att återsuspendera de EV-bundna pärlorna.
- Placera röret på ett 1.5 ml magnetiskt separatorställ för mikrocentrifugrör och aspirera supernatanten. Använd en P200-pipett för att helt aspirera supernatanten och undvika att aspirera pärlorna.
- Tvätta pärlorna med 1 ml tvättbuffert. Tillsätt bufferten omedelbart efter att du har aspirerat supernatanten för att förhindra att pärlorna torkar ut.
- Tvätta pärlorna 2 gånger med 1 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i rumstemperatur.
- Inkubera pärlorna med 100 μL nyberedd 100 mM trietylamin i 10 minuter vid rumstemperatur och samla upp den eluerade lösningen som innehåller EV med hjälp av ett 1,5 ml magnetiskt separatorställ för mikrocentrifugrör.
OBS: För att bereda 1 ml 100 mM trietylamin, späd 14 μL trietylaminlösning i vatten. - Upprepa steg 2.8 och kombinera de eluerade lösningarna. Torka eluatet med en vakuumcentrifugkoncentrator vid 4 °C.
OBS: Experimentet kan pausas här. Torkade EV-prover kan förvaras vid -80 °C i flera månader utan negativa effekter på följande steg eller resultaten.
3. Karakterisering av elbilar genom western blotting
- Återsuspendera 5 % av det torkade EV-provet (motsvarande 0,5 ml av urinprovet) i 20 μl 1x litiumdodecylsulfat (LDS) provbuffert med 10 mM ditiotreitol (DTT).
OBS: EV från 0.5 ml urin räcker för att detektera CD9-signalen (en EV-markör24) i western blotting. - Koka provet i 5 minuter vid 95 °C. Ladda sample på en polyakrylamidgel och utför elektrofores och immunoblot enligt standardprotokoll25.
- Efter att proteinerna har överförts till ett membran av polyvinylidenfluorid (PVDF) med låg fluorescens, blockera membranet med 1 % bovint serumalbumin (BSA) i trisbuffrad saltlösning tween-20 (TBST) i 1 timme vid rumstemperatur. För att förbereda 1 l TBST-buffert, tillsätt 19 mM Tris-bas, 137 mM NaCl och 1 ml Tween-20; justera pH till 7,4 med HCl.
- Inkubera membran med kanin-anti-CD9-antikroppar i förhållandet 1:5 000 i 1 % BSA i TBST vid 4 °C över natten eller i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet 3 gånger i 5 minuter vardera med TBST. Inkubera membranet med anti-kanin IgG, HRP-kopplad sekundär antikropp i förhållandet 1:5000 i 1% BSA i TBST i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet 3 gånger i 5 minuter vardera med TBST. Tillsätt de kommersiellt erhållna ECL-substraten (enhanced chemiluminescence) (förhållandet 1:1) på membranet och detektera signaler på ett kemiluminescensavbildningssystem.
4. Provberedning för proteomik- och fosfoproteomikanalys
- Bered färsk lyseringsbuffert innehållande 12 mM natriumdeoxikolat (SDC), 12 mM natriumlauroylsarkosinat(SLS), 100 mM trietylammoniumbikarbonatbuffert (TEAB), 10 mM tris-(2-karboxietyyl)fosfin (TCEP), 40 mM kloracetamid (CAA) och 1x fosfatashämmarcocktails.
OBS: Lagerlösningarna listas i beskrivningen av materialförteckningen. Lysbufferten bereds genom att stamlösningarna tillsätts för att uppnå önskade koncentrationer beroende på erforderlig volym. - Solubilisera det torkade EV-provet i 100 μL lysbuffert och värm provet i 10 minuter vid 95 °C med skakning vid 1 100 varv per minut.
- Efter att provet har svalnat till rumstemperatur späds det fem gånger genom att 400 μl 50 mM TEAB tillsätts.
- Mät proteinkoncentrationen med hjälp av ett BCA-analyskit enligt tillverkarens instruktioner. Använd lysbufferten femfaldigt utspädd med 50 mM TEAB som blind.
- Tillsätt trypsin/Lys-C-blandningen vid enzym-protein-förhållandet 1:50 och inkubera provet vid 37 °C över natten med skakning vid 1 100 varv per minut.
- Tillsätt 50 μl 10 % trifluorättiksyra (TFA) för att surgöra provet.
- Tillsätt 600 μl etylacetat till proverna och virvla blandningen i 2 minuter.
- Centrifugera provet i 3 minuter vid 20 000 x g och ta bort det övre lagret (organiskt lager). Undvik att störa gränssnittet under aspiration.
- Upprepa steg 4.7-4.8. Torka vattenfasen med hjälp av en vakuumcentrifugkoncentrator.
- Återsuspendera det torkade provet i 200 μL 0,1 % TFA för att surgöra peptider och avsalta provet med en C18-avsaltningsspets enligt tillverkarens instruktioner. Konditionera spetsen med 200 μL 0,1 % TFA i 80 % acetonitril, följt av 2x med 200 μL 0,1 % TFA. Ladda det surgjorda peptidprovet i spetsen och tvätta sedan spetsen 3x med 200 μL 0,1 % TFA. Eluera peptiderna med 200 μL 0,1 % TFA i 80 % acetonitril.
- Torka eluatet med en vakuumcentrifugkoncentrator. Torka 2 % av peptidprovet (motsvarande 0,2 ml av urinprovet) separat för proteomikanalys. Använd resten (98 %) av provet för fosfoproteomikanalys.
- Anrika fosfopeptider från provet med hjälp av en fosfopeptidanrikningssats enligt tillverkarens anvisningar. Utför stegen som beskrivs nedan för berikning.
- Återsuspendera det torkade provet i 200 μl belastningsbuffert. Tillsätt 50 μl av pärlorna till provet och skaka kraftigt i 20 minuter i rumstemperatur. Fyll provet med pärlorna på den friterade spetsen och centrifugera i 1 minut vid 100 x g.
- Tvätta spetsen med 200 μL laddningsbuffert, följt av tvättbuffert 1 och sedan tvättbuffert 2. Utför alla tre tvättstegen genom att centrifugera en gång i 2 minuter i 20 x g och en gång i 1 min i 100 x g.
- Sätt spetsen med pärlor i ett nytt rör för att samla upp de eluerade fosfopeptiderna. Tillsätt 50 μl elueringsbuffert till spetsen och centrifugera en gång i 2 minuter vid 20 x g. Tillsätt ytterligare 50 μl elueringsbuffert till spetsen och centrifugera en gång i 2 minuter vid 20 x g. Centrifugera en sista gång i 1 minut vid 100 x g.
- Torka de eluerade fosfopeptiderna med hjälp av en vakuumcentrifugkoncentrator.
5. LC-MS/MS-analys
OBS: Olika LC-MS/MS-system/inställningar och datainsamlingsmetoder, såsom databeroende förvärv (DDA) kan användas.
- Återsuspendera de torkade proteom-/fosfoproteomproverna i 0,1 % myrsyra (lösningsmedel A) och fyll på proverna enligt tillverkarens instruktioner.
- Injicera proverna i fångad jonrörlighetstime-of-flight MS genom vätskekromatografisystemet (LC) och använd den förinställda standardiserade Whisper 40 samples per dag-metoden. Peptider separeras på en 15 cm C18-kolonn (75 μm innerdiameter, 1,9 μm partikelstorlek) som nämns i materialtabellen.
- För proteomikanalys, samla in data med hjälp av en parallell ackumulering-seriell fragmentering i kombination med datainsamlingsmetod (dia-PASEF) med ett massintervall per ramp som sträcker sig från 300-1200 m/z och från 0,6-1,50 1/K0 med en cykeltid på 1,38 s.
- För fosfoproteomikanalys, samla in data med hjälp av en dia-PASEF-insamlingsmetod med ett massintervall per ramp som sträcker sig från 400-1550 m/z och 0,6-1,50 1/K0 med en cykeltid på 1,38 s.
- Ladda råfilerna i proteomikprogramvara och utför signalextraktion, identifiering och kvantifiering med hjälp av ett biblioteksfritt dataoberoende arbetsflöde.
- För sökinställningar, använd Homo sapiens databas, specifika digest-typer med trypsin/P-enzymer, 7 minimal peptidlängd, 52 maximal peptidlängd, två missade klyvningar, karbamidometyl vid cystein som fast modifiering, acetylprotein N-term, oxidation vid metionin och fosforylering vid serin, treonin och tyrosin (för fosfoproteomikanalys) som variabla modifieringar och 5 som maximala variabla modifieringar. Ställ in FDR vid PSM, peptid och proteingrupp till 0,01.
OBS: Spectronaut-programvara användes i detta protokoll. Andra DIA-datasökningsprogram som DIA-NN och PEAKS används också ofta. Om data har samlats in i DDA-läge är programvara som MaxQuant och Proteome Discoverer tillämpliga.
- För sökinställningar, använd Homo sapiens databas, specifika digest-typer med trypsin/P-enzymer, 7 minimal peptidlängd, 52 maximal peptidlängd, två missade klyvningar, karbamidometyl vid cystein som fast modifiering, acetylprotein N-term, oxidation vid metionin och fosforylering vid serin, treonin och tyrosin (för fosfoproteomikanalys) som variabla modifieringar och 5 som maximala variabla modifieringar. Ställ in FDR vid PSM, peptid och proteingrupp till 0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll visar ett omfattande arbetsflöde från isolering av EV till nedströms proteomik- och fosfoproteomikanalyser (figur 1). De tre urinproverna utsattes för EV-isolering. De isolerade EV:erna karakteriserades av western blotting och bearbetades därefter för masspektrometri-baserad proteomikprovberedning inklusive proteinextraktion, enzymatisk nedbrytning och peptidrengöring. För fosfoproteomikanalys anrikades fosfopeptiderna ytterligare baserat på metalljonfunktionaliserade lösliga nanopolymerer. Både peptid- och fosfopeptidprover analyserades med högupplösande masspektrometri med jonmobilitet i dataoberoende läge. Resultatråfilerna genomsöktes mot Homo sapiens databas, och biblioteksfria dataoberoende förvärvsarbetsflöden utfördes för identifiering och kvantifiering på MS2-nivå.
För att karakterisera de isolerade EV:erna och uppskatta återhämtningsutbytet laddade vi först motsvarande 0,5 ml urin innehållande EVs på gelen för western blotting för att detektera EV-markören CD9 (Figur 2A). Dessutom inkluderade vi EV isolerade från samma urinvolym med hjälp av den mest använda metoden för EV-isolering, differentiell ultracentrifugering (DUC), som jämförelse. Resultaten visade att EVtrap kunde producera mycket högre CD9-signaler jämfört med DUC, vilket tyder på en effektiv fångst av EV av pärlorna. Ytterligare kvantitativa värden för varje CD9-bandsignal visade att EVtrap uppnådde ett återvinningsutbyte på ~99 % jämfört med den 5-faldiga intensiteten för den direkta urinkontrollen, medan DUC endast återhämtade ~1,5 % av EV (figur 2B).
Genom att ladda 2 % av varje prov på LC-MS/MS för proteomisk profilering identifierade vi > 11 000 unika peptider från ~2 200 unika proteiner (figur 3A), vilket indikerar att detta arbetsflöde ger en djupgående täckning av EV-proteom. En hög grad av överlappning i proteinidentifieringar mellan proverna observerades, med 72 % av de unika proteinerna som konsekvent identifierades i alla tre replikaten (Figur 3B). Dessutom jämförde vi identifieringsresultaten med ExoCarta-databasen (figur 3C)26. Noterbart är att av de 100 främsta EV-markörerna och proteinerna identifierade vi framgångsrikt ~90 av dessa EV-proteiner, vilket tyder på en opartisk och fullständig profilering av EV-proteiner genom denna proteomikanalys. För att bedöma den kvantitativa precisionen utvärderade vi vidare fördelningen av variationskoefficienter (CV) för proteinkvantifieringsresultaten (Figur 3D). Ett lågt CV (5,7 %) indikerar procedurens höga reproducerbarhet och tillförlitlighet, inklusive EV-isolering, provberedning och MS-detektion.
För fosfoproteomikanalysen använde vi 98 % av varje peptidprov för fosfopeptidanrikningen och identifierade ~800 unika fosfopeptider motsvarande ~350 unika fosfoproteiner (Figur 4A). Anrikningen gav i genomsnitt 72 % fosfoserin (pS) peptider, 22 % fosfotreonin (pT) respektive 6 % fosfotyrosin (pY) peptider (Figur 4B). När det gäller reproducerbarheten för identifiering av de tre replikaten identifierades 42 % av fosfopeptiderna i alla tre analyserna, och det fanns en överlappning på ~50 % mellan varannan analys (figur 4C). En medelhög CV på 21,8 % bestämdes för kvantifiering av fosfopeptider, vilket tyder på en acceptabel kvantitativ reproducerbarhet med detta protokoll (Figur 4D).
Figur 1: Schematiskt arbetsflöde som används för isolering av extracellulär vesikel i urinen (EV) och nedströmsanalyser. EV isoleras från urinprover genom EVtrap-metoden (extracellular vesicles total recovery and purification), och de isolerade EV utsätts direkt för western blotting-analys. För LC-MS/MS-analys extraheras proteiner från EV och smälts till peptider. Peptidproverna efter saneringsstegen kan användas för proteomikanalys eller fosfoproteomikanalys efter fosfopeptidanrikning. Både proteomik- och fosfoproteomikprover analyseras med LC-MS/MS. Identifiering och kvantifiering utförs sedan med hjälp av dataoberoende förvärv (DIA) arbetsflödesmetod. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av isolerade EV genom western blotting. (A) Detektion av EV-markör CD9 från 0,1 ml direkt urinprov (n=1), EV isolerade med differentiell centrifugering (DUC) (n=3) och EV isolerade med EVtrap-metod (n=3). (B) Kvantifiering av western blotting-signaler i (A) presenteras som det procentuella utbytet i förhållande till det direkta urinprovet (5-faldig intensitet = 100 %). För DUC- och EVtrap-proverna visar stapeldiagrammet de genomsnittliga intensiteterna och standardavvikelserna (representerade av felstaplar) från triplikaten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Proteomikanalys av isolerade EV . (A) Det totala antalet identifierade unika proteiner och peptider i trilikat. (B) Venndiagram som visar överlappningen mellan replikat i identifierade unika proteiner. (C) Antalet identifierade unika proteiner som motsvarar de 100 främsta EV-markörerna i ExoCarta-databasen. D) Densitetsdiagram som visar fördelningen av variationskoefficienten (CV) för proteinkvantifiering. Medianvärdet för CV är markerat med en röd streckad linje. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Fosfoproteomikanalys av isolerade EVs . (A) Det totala antalet identifierade unika fosfoproteiner och fosfopeptider i trilikat. (B) Procentuell sammansättning av pSTY-peptider efter fosfopeptidanrikning. (C) Venndiagram som visar överlappningen i identifierade unika fosfopeptider mellan replikat. D) Densitetsdiagram som visar fördelningen av CV för bestämning av fosfopeptider. Medianvärdet för CV är markerat med en röd streckad linje. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv EV-isolering är en viktig förutsättning för att detektera proteiner och fosfoproteiner med låg förekomst i EV. Trots utvecklingen av många metoder för att uppfylla detta behov lider majoriteten fortfarande av begränsningar som dålig återhämtning eller låg reproducerbarhet, vilket hindrar deras användning i storskaliga studier och rutinmässiga kliniska miljöer. DUC anses allmänt vara den vanligaste metoden för isolering av elfordon, och de extra tvättstegen tillämpas normalt för att öka renheten hos målfordon27,28. Denna procedur leder till en mer omständlig och tidskrävande DUC-process (> 6 timmar). Dessutom har lågt EV-återvinningsutbyte efter DUC rapporterats av flera studier,29,30 och visas i resultaten i figur 2. Som jämförelse erbjuder EVtrap effektiv EV-isolering (< 1 timme) och ett högt återvinningsutbyte (figur 2). Den framgångsrika tillämpningen av detta arbetsflöde markerar ett avgörande framsteg för identifieringen av signifikanta EV-markörer för olika sjukdomar och cancerformer 19,21,22 EVtrap är dock oförmögen att isolera specifika subpopulationer av EV, såsom mikrovesiklar eller exosomer, eftersom den fångar upp hela EV-populationen.
I detta protokoll använde vi 2 % och 98 % av peptidprovet för proteomik- och fosfoproteomikanalyser. Eftersom EV som isoleras från 10 ml urin med EVtrap vanligtvis ger 100-200 μg totala proteiner, är 98 % av peptiderna efter matsmältning och sanering tillräckliga för fosfopeptidanrikningen. Om ett märkningssteg, såsom tandem mass tag (TMT) -märkning, krävs för kvantitativ MS-analys, kan peptidkoncentrationsmätning efter avsaltningssteget utföras för att normalisera peptidmängden och förbättra noggrannheten i kvantifieringen31.
Även om detta protokoll främst belyser användningen av EVtrap för att isolera urin-EV, är det värt att nämna att mångsidigheten i detta tillvägagångssätt har visats vid bearbetning av olika provtyper32,33,34. Baserat på tidigare resultat var villkoret som användes i detta protokoll tillämpligt för att isolera EV från cellodlingsmedia. För isolering av cellutsöndrade EV odlas cellerna under fetalt bovint serum (FBS) fria eller EV-utarmade FBS-förhållanden för att förhindra samisolering av överdrivna FBS-härledda EV med cellutsöndrade EV, vilket kommer att undergräva resultatens tillförlitlighet35. Dessutom kan de isolerade EV:erna från andra provtyper karakteriseras genom western blotting-analys med hjälp av flera vanliga EV-markörer, inklusive CD9, CD63, CD81, tumörkänslighetsgen 101-protein (TSG101) och ALG-2-interagerande protein X (ALIX)36.
För att öka täckningen och förbättra kvantifieringen i MS-analyser är det ett alternativ att bygga upp ett projektspecifikt bibliotek för sökning i DIA-data. På grund av komplexiteten hos de spektra som produceras i DIA-läget är ett spektralbibliotek som innehåller en samling referensspektra fördelaktigt för att öka identifieringssäkerheten och förbättra täckningen. Spektralbibliotek av hög kvalitet kan genereras genom att utföra DDA-analys på samma prover eller förfraktionerade prover37. Biblioteket kan också användas för att bestämma optimala fönster för dia-PASEF och ytterligare förbättra identifieringen38.
Sammantaget ger det presenterade protokollet en enkel och effektiv metod för att isolera EV från urinprover för proteomik- och fosfoproteomikanalyser. Genom att implementera detta protokoll förväntar vi oss förbättrad detektion av EV-proteiner och fosfoproteiner med låg förekomst som biomarkörer för tidig sjukdomsdetektion och longitudinell övervakning. Dessutom har forskare en stor möjlighet att främja forskningen om elfordon och bidra till bättre diagnostiska och terapeutiska strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar ett konkurrerande ekonomiskt intresse. Anton Iliuk och W. Andy Tao är medgrundare av Tymora Analytical Operations, som utvecklat EVtrap-pärlor och kommersialiserat PolyMAC-fosfopeptidanrikningskit.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis finansierats av NIH-anslagen 3RF1AG064250 och R44CA239845.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A.
- Singh, V., et al.
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R.
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
