Summary
该协议描述了一种基于流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定抑制人中性粒细胞上β2整合素活化的小分子药物。
Abstract
该方案旨在建立一种利用构象变化报告抗体和高通量流式细胞术鉴定β2整合素活化的小分子拮抗剂的方法。该方法还可以作为其他基于抗体的高通量筛选方法的指南。β2整合素是白细胞特异性粘附分子，在免疫反应中至关重要。中性粒细胞依靠整合素活化排出血液，不仅可以抵抗感染，还可以参与多种炎症性疾病。控制β2整合素活化是治疗中性粒细胞相关炎症性疾病的可行方法。在该方案中，单克隆抗体 mAb24 与 β2 整合素的高亲和力头片特异性结合，用于定量分离的原代人中性粒细胞上的 β2 整合素活化。N-甲酰甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酸 （fMLP） 用作激活中性粒细胞 β2 整合素的刺激物。本研究使用了能够自动运行 384 孔板样品的高通量流式细胞仪。在3小时内评估320种化学物质对β2整合素抑制的影响。通过这种方法可以识别直接靶向β2整合素的分子或G蛋白偶联受体启动的整合素由内而外的激活信号通路中的靶分子。
Introduction
许多炎症性疾病的特征在于中性粒细胞浸润在肿胀或损伤部位1。为了浸润这些组织，中性粒细胞必须完成中性粒细胞募集级联反应，包括阻滞到内皮细胞，外渗穿过血管壁，然后募集到组织中2。循环中性粒细胞需要β2整合素激活才能完成这一级联反应，特别是在停滞阶段。因此，减少中性粒细胞粘附、外渗和募集的整合素抑制药物可有效治疗炎症性疾病 3,4。
β2整合素以前曾被靶向用于炎症性疾病。依法珠单抗是一种直接靶向整合素αLβ2的单克隆抗体，用于治疗银屑病5。然而，依法珠单抗因其致命的副作用而被撤回 - JC病毒再激活导致的进行性多灶性白质脑病6,7。基于整合素的新型抗炎疗法应考虑维持白细胞的抗感染功能，以尽量减少副作用。依法珠单抗的副作用可能是由于单克隆抗体在血液中的循环时间延长，从长远来看可能会抑制免疫功能8.最近的一项研究表明，依法利珠单抗介导 αLβ2 交联和 α4 整合素的不需要的内化，为副作用提供了另一种解释9.因此，短寿命的小分子拮抗剂可能会避免这个问题。
本文介绍了一种使用人中性粒细胞筛选小分子β2整合素拮抗剂的高通量方法。β2 整合素激活需要整合素胞外结构域的构象变化才能进入并增加其与其配体的结合亲和力。在规范的弹簧刀模型中，弯曲闭合的整合素胞外结构域首先延伸到扩展-闭合构象，然后打开其头件以完全激活的扩展-开放构象10,11,12,13。还有另一种途径，从弯曲闭合到弯曲打开和扩展打开，最终是14、15、16、17、18、19。构象特异性抗体 mAb24 与人 β2-I 样结构域中的表位结合，当胞外结构域的头饰打开时20,21,22,23。
在这里，mAb24-APC 用于确定 β2 整合素是否被激活。为了激活中性粒细胞和整合素，N-甲酰甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酸 （fMLP），一种细菌衍生的短趋化肽，可以激活中性粒细胞 β2 整合素24，在该方案中用作刺激物。当 fMLP 与中性粒细胞上的 Fpr1 结合时，涉及 G 蛋白、磷脂酶 Cβ 和磷酸肌醇 3-激酶γ的下游信号级联被激活。这些信号转导事件最终通过由内而外的信号通路18,25 导致整合素激活。除了直接与β2整合素结合并阻止整合素活化构象变化的小分子拮抗剂26外，该方法还可以检测出可以抑制β2整合素由内而外的激活信号通路中成分的化合物。自动流式细胞仪可实现高通量筛选。识别新的拮抗剂不仅可以加深我们对整合素生理学的理解，还可以为基于整合素的抗炎治疗提供转化见解。
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Protocol
根据《赫尔辛基宣言》的原则，在获得知情同意后，从去识别化的健康人类供体处获得肝素化全血样本，经康涅狄格大学健康机构审查委员会批准。已获得所有捐赠者的知情同意。本研究的纳入/排除标准经过精心制定，以确保受试者的适用性并将潜在风险降至最低。符合条件的参与者年龄在 18 至 65 岁之间，不分种族，英语流利，能够提供知情同意。被排除在外的受试者包括那些无法为自己提供知情同意的人，例如那些需要合法授权代表的人、18岁以下或65岁以上的个人、被监禁的人和孕妇。此外，参与者必须没有使用抗炎药物和炎症。当前感染或持续的慢性或急性炎症性疾病也是排除标准。最后，当前或近期有 COVID-19 感染史的个体不符合该研究的资格。这些标准旨在确保参与者的安全性和适用性，同时最大限度地减少可能影响研究结果的潜在混杂因素。
1.试剂的制备
- 中性粒细胞培养基：通过向不含酚红的RPMI-1640中加入2%人血清白蛋白来制备中性粒细胞培养基（参见 材料表）。
- fMLP溶液：用不含酚红的RPMI 1640从10mM fMLP二甲基亚砜（DMSO）储存溶液（参见 材料表）中稀释100倍来制备fMLP溶液，得到100μM fMLP溶液。
- 抗体溶液：在 10 mL 中性粒细胞培养基中稀释 120 μL 别藻蓝蛋白 （APC） 偶联单克隆抗体 mAb24 （mAb24-APC）（参见 材料表），该抗体报告了 β2 整合素的高亲和力构象，形成 1.2 μg/mL mAb24-APC 溶液。
- 化合物库：通过使用液体处理器将 5 μL 的 10 mM 文库（参见 材料表）加入 384 孔板中的 45 μL DMSO 中，将浓度为 10 mM 至 1 mM 的初始化合物库稀释至 1 mM。随后，使用液体处理器将每孔 5 μL 的 1 mM 化合物库转移到空的 384 孔板中。
- 如图1所示，四列（ 1、2、23、24）仅含有DMSO，不含化合物，在筛选中作为阳性和阴性对照。通过加入 45 μL 不含酚红的 RPMI-1640 进一步稀释每个孔，使所有化合物的最终浓度为 100 μM。
2. 从人体血液中分离中性粒细胞
- 使用血清移液管，在15mL离心管中小心地将4mL血液分层在8mL市售密度梯度培养基（参见 材料表）（图2A）中。
- 将血液在20°C下以550× g 离心30-50分钟。 逐渐使转子减速（减速系数为1）。
注意：中性粒细胞（ 图2B中的条带2）从红细胞中成功分离可能因供体而异。对于大多数供体，30 分钟的离心就足够了。然而，对于一些供体，如果分离不成功，可能需要额外的10-30分钟离心（图2C）。 - 小心地去除血浆（顶部的黄色液体）和单核细胞（上部混浊带; 图2B中的PBMC条带）使用1 mL移液管。
- 将中性粒细胞从下部混浊带（ 图2B中的中性粒细胞带）收集，并在透明液体下方约3-4mL收集到含有10mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）的15mL离心管中。将中性粒细胞悬浮液倒置2-3次，轻轻混合。
- 将悬浮液在400× g 下在20°C下离心10分钟，然后通过倾析小心地除去上清液。
- 用5mL PBS轻轻重悬沉淀，并在20°C下以300× g 离心5分钟。
- 通过倾析除去上清液，并使用真空抽吸小心地清除管口周围和管壁上的任何残留上清液。将沉淀重悬于 1 mL 中性粒细胞培养基中。
- 使用血细胞计数器计数细胞数。通常，从 8 mL 人血中获得 1 至 4 ×10 7 个中性粒细胞。
注意：中性粒细胞悬浮液中可能存在红细胞污染。红细胞不会显著影响大多数检测，并且可以防止中性粒细胞活化/启动27.红细胞在计数前需要裂解，以获得准确的中性粒细胞浓度。将 10 μL 细胞悬液加入 891 μL 去离子水中 10-30 秒以裂解红细胞，然后加入 99 μL 10× PBS 以平衡渗透压，防止中性粒细胞裂解。 - 通过加入中性粒细胞培养基，将细胞密度调节至 6.25 ×10 5 个细胞/mL。
3. 384孔板的制备
- 在 1.5 mL 离心管中，将 1 mL 抗体溶液 （1.2 μg/mL mAb24-APC） 与 0.2 mL 中性粒细胞培养基混合，制备 1 μg/mL mAb24-APC 溶液。然后，将 25 μL 该混合物加入 384 孔板（ 图 1 中的蓝色孔）中的阴性对照孔中。
- 在 15 mL 离心管中，将 9 mL 抗体溶液与 21.6 μL fMLP 溶液 （100 μM） 和 1.7784 mL 中性粒细胞培养基混合，以制备含有 1 μg/mL mAb24-APC 和 200 nM fMLP 的溶液。接下来，将 25 μL 该混合物加入 384 孔板（ 图 1 中的红色和蓝色孔）中的阳性对照和测试孔中。
- 使用多通道移液器将 5 μL 的 100 μM 化合物溶液从化合物库板转移到 384 孔板中。
- 在室温下以500× g离心液体1分钟。
注意： 要离心板，需要一个水平桶转子和板桶。
4.细胞处理
- 使用 16 通道移液器（5-50 μL 范围，384 孔板的每列）向每个孔中加入 20 μL 中性粒细胞悬浮液。使用移液管轻轻混合 5-10 次，每次移液之间保持一致的时间间隔。
注：孔中的最终浓度如下：中性粒细胞 2.5 × 105 个细胞/mL（所有孔）;mAb24-APC 0.5 μg/mL（所有孔）;fMLP 100 nM（阳性对照和测试孔）;化合物 10 μM（测试孔）。 - 在室温（RT）下，在300rpm的振荡器上孵育板10分钟。
- 使用16通道移液管（最终PFA浓度~0.91%）向每个孔中加入3μL的16%多聚甲醛（PFA）来固定细胞。然后，在冰上孵育10分钟。
注意：建议在添加中性粒细胞和PFA时，不同色谱柱之间保持一致的时间间隔。这确保了每个孔中的中性粒细胞与 fMLP 和 mAb24-APC 具有相同的孵育时间。
5. 流式细胞术
- 打开流式细胞仪（见 材料表），并确保连接到仪器的计算机也已打开。
- 确保鞘液容器已装满，废液容器为空并正确连接到仪器。
- 将 384 孔板加载到流式细胞仪的样品加载器上。确保板的 A1 孔与装载机上的 A1 标记对齐。
- 打开软件并创建一个新实验。选择 384 孔 并选择所需的荧光基团。接下来，单击“ 板设置”，拖动以选择所有孔，然后单击 “样品”。打开“高吞吐量”开关，然后在速率面板下选择 高 。
- 在音量框中，输入 50。在奇数列中选择样品，然后激活“搅拌”开关。最后，在右侧面板中命名示例。
- 单击 “绘图和门”。然后，单击 “应用 ”按钮（绿色填充圆圈上的两个箭头），随后单击 播放 按钮（三角形）。等待几秒钟以观察第一个孔中的一些细胞，然后单击 暂停 按钮。
- 调整 FSC 和 SSC 电压，以确保图上细胞的正确可视化。单击 “采集”，然后单击 播放 按钮（三角形）以开始检测。
- 流式细胞仪将依次从每个孔中取样 ~50 μL 的 1000-3000 个中性粒细胞。完成整个 384 孔板大约需要 3 小时。
- 完成所有示例后，导出 .fcs 文件以供下一步使用。
6. 数据分析
- 打开流式细胞术数据分析软件（参见 材料表）。选择包含所有 .fcs 文件的文件夹并将其拖动到软件窗口中，然后松开以将数据导入软件。
- 双击一个样品，在弹出的窗口中基于FSC和SSC28,29,30的单个中性粒细胞进行门控，如图3所示。选择门控行并将它们拖动到文件夹中，然后松开以将门控应用于该文件夹中的所有样本。
- 使用软件的表格编辑器功能计算并导出每个孔中嗜中性粒细胞的 APC 中值荧光强度 （MFI）。单击“编辑”选项卡下的“添加列”。在统计选项卡中选择中位数，选择门控群体中性粒细胞，然后选择 APC 作为参数。单击“确定”按钮。
- 返回“表格编辑器”选项卡，在“组”选项卡中选择 “所有样品 ”，然后按 “创建表格 ”按钮。将出现一个新窗口，显示创建的表。将其另存为文本、CSV 或 Excel 文件。
- 打开导出的表格，计算阳性和阴性对照样品的APC MFI的平均值和标准偏差（图4）。
- 使用以下公式计算板的 Z' 因子 （Z'）：
Z' = 1 - 3（σ p + σ n）/（μp - μn），
其中 σ p 和 σ n 分别是阳性和阴性对照的标准差，μp 和 μn 分别是阳性和阴性对照的平均值31.
注： Z' 因子表示正负对照分布的分离。Z' 为 0 表示没有分离，而 Z' 为 0.5 表示相等的分离。如先前的研究31 所述，Z' > 0.5 表示化合物筛选的极好测定方法。0.5 到 0 范围内的 Z' 是可以接受的，但它可能只能识别检测中的强命中，这需要在二次检测中进一步验证。 - 当化合物处理的中性粒细胞的APC MFI低于从阳性对照MFI中减去阳性对照MFI标准差的三倍时，将化合物视为筛选的“命中”（P = 0.0013，由 图4中的虚线表示）。
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Representative Results
来自代表性的 384 孔板筛选的数据（图 4）显示，阴性对照的 mAb24-APC MFI 为 3236 ± 110，而阳性对照的 mAb24-APC MFI 为 7588 ± 858。该板的 Z' 因子约为 0.33，在可接受的范围内31。然而，Z'需要在二次测定中进一步验证。
为了对数据进行归一化，对所有值进行了缩放，以将最大值 1 分配给正均值，将最小值 0 分配给负均值。Z'因子将在二次测定中经过更严格的验证。该板的临界值设置为 0.41，这意味着相对 MFI 低于 0.41 的样品将被视为抑制人中性粒细胞中 fMLP 诱导的 β2 整合素活化的命中。从该板中未发现命中。
为了确认该方案的有效性，使用了通过拮抗 Rac-1 功能抑制 β2 整合素活化的 Nexinhib20 和直接拮抗整合素 αLβ2 的 lifitegrast32,33。然而，将 Nexinhib20 的孵育时间调整为 1 小时，将 lifitegrast 调整为半小时。使用上述相同的缩放方法对这些实验的结果数据进行归一化。然后将这些数据点与孔板结果相结合并进行集体分析（图4）。
图 1：化合物筛选的板布局。 示意图显示了 384 孔板中筛选化合物和对照的排列。阴性对照孔以蓝色表示（第 1 列和第 23 列），阳性对照孔以红色显示（第 2 列和第 24 列）。测试孔以米色表示（第 3 至 22 列）。箭头表示读取板的顺序。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：使用密度梯度培养基分离中性粒细胞。 展示使用密度梯度培养基成功和失败分离中性粒细胞的代表性照片。（A） 最初，将 4 mL 血液分层到 8 mL 密度梯度培养基上。（B） 离心后，应可见两条混浊条带：上条带主要含有外周血单核细胞 （PBMC），下条带主要含有中性粒细胞和一些红细胞 （RBC）。大多数红细胞在底部沉淀。（C） 不成功的分离，其中红细胞未沉淀，并且未观察到中性粒细胞带。需要额外的离心（10-30 分钟）来分离中性粒细胞条带。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用 FSC/SSC 图对中性粒细胞进行门控。 代表性前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 图说明了识别中性粒细胞的门控策略。（A） 根据流式细胞仪记录的前向散射面积 （FSC-A） 和侧向散射面积 （SSC-A） 对中性粒细胞进行门控。（B） 根据前向散射的宽度 （FSC-W） 和高度 （FSC-H） 以及 （C） 侧向散射的宽度 （SSC-W） 和高度 （SSC-H） 进一步对单个单元进行门控。色标表示像元密度，随着密度的降低，从红色过渡到黄色、绿色和蓝色。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：具有代表性的 384 孔板中的筛选结果。 来自具有代表性的 384 孔板的筛选结果显示 Z' 因子为 0.3。阴性和阳性对照分别用蓝色和红色圆点表示。用各种化合物处理的测试样品表示为米色圆点。虚线表示用于识别命中的平均荧光强度 （MFI） 截止值。没有一种被测试化合物被鉴定为β2整合素拮抗剂，因为所有测试化合物的MFI值都高于临界线。测试具有不同孵育时间（Nexinhib20 1小时，lifitegrast半小时）的已知β2整合素拮抗剂的独立实验结果汇集在一起，以在此图中呈现。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
中性粒细胞刺激和染色的开始和终止由添加中性粒细胞和固定剂PFA来确定。因此，确保将中性粒细胞或PFA移液到每根色谱柱中的时间间隔相同至关重要。这确保了每个孔中嗜中性粒细胞的刺激和染色时间保持一致。由于中性粒细胞的寿命较短，从从供体采集血液到完成流式细胞术的整个实验必须在同一天进行。中性粒细胞对温度变化高度敏感，当暴露于温度快速升高时，例如从4°C过渡到室温或从室温过渡到37°C，中性粒细胞就会被激活。 此外，根据我们之前的经验，当细胞储存在冰上或4°C时，fMLP诱导的中性粒细胞β2整合素活化不会发生（数据未显示）。因此，在固定之前，全血和中性粒细胞应保持在室温或20°C（在分离离心步骤期间）。不要将全血和中性粒细胞放在冰上。
在阴性对照中对 mAb24 染色应产生非常低的结果。如果在实验中观察到较高的mAb24染色水平，请检查以下内容：（1）固定前实验期间是否有明显的温度变化;（2）中性粒细胞培养基中是否存在fMLP或内毒素污染;（3）样品处理是否过于激进，例如在移液和混合过程中产生气泡。
目前的方案使用 mAb24 来报告 β2 整合素头件的打开。从理论上讲，KIM127 是一种报告 β2 整合素延伸的单克隆抗体 34,35，可与 mAb24 联合使用以全面评估 β2 整合素构象。然而，KIM127 染色的信噪比（1.5 至 2 倍）不如 mAb24（5 至 10 倍）有利，后者通常不能在 384 孔板测定中提供令人满意的 Z' 因子。在 96 孔板测定中，可以在进行流式细胞术之前清洗样品，从而减少可溶性抗体来源的背景信号。因此，基于 KIM127 的检测可以在 96 孔板检测中进行，与 384 孔板检测相比，其通量较低。
由于该方法使用荧光强度作为读数来评估药物的整合素抑制作用，因此某些荧光药物可能会干扰结果。此外，在 10 分钟刺激期内诱导中性粒细胞死亡的有毒药物似乎也会报告整合素抑制。抑制中性粒细胞脱颗粒的药物会抑制整体 β2 整合素的表达。这些脱颗粒抑制剂也将在我们的筛选中确定。因此，需要使用其他对照进行二次筛选以确认命中的抑制作用。辅助屏幕被引用为验证和确定命中作用机制的一种手段。除了重复 mAb24 测试外，还将使用泛抗人 CD18 抗体评估细胞表面的总 CD18 表达。通过 mAb24 测量的活化 β2 整合素水平将通过总 CD18 表达进行标准化。这将使我们能够确定该药物的作用机制是否涉及拮抗整合素激活和/或抑制细胞表面CD18的表达。还应在二次筛选中进行活力测定，以排除命中的任何毒性作用。
此协议有局限性。首先，mAb24 仅在整合素处于高亲和力状态的情况下才能检测 β2 I 样结构域。因此，它不能通过减少 mAb24 结合来识别 α/β I 样变构拮抗剂，例如 lifitegrast。Lifitegrast 诱导更多的 mAb24 结合32 ，并且 mAb24 的 MFI 值异常增加（图 4）。对于这种异常值，可能需要其他检测来验证这些命中是否是 α/β I 样变构拮抗剂，如 lifitegrast。其次，该测定的Z'因子不理想，可以通过使用自动移液和搅拌来改善。不幸的是，我们的实验室缺乏必要的设备来检验这一假设。重复或三重检测将有助于识别假阳性和假阴性，以防上述方法无法进一步改善Z'因子。此外，延长孵育时间以识别更多命中可能是有益的，正如已知的β2整合素激活抑制剂Nexinhib20所观察到的那样，它需要一个小时的孵育才能产生抑制作用。本研究的重点是鉴定速效药物。研究人员应注意，他们可以修改孵育时间以满足他们的特定需求。
据我们所知，这是第一种针对β2整合素拮抗剂的高通量筛选方法。这种方法可用于鉴定直接与 β2 整合素结合的小分子化合物，并防止构象变化导致中间/高亲和力整合素状态，类似于最近描述的整合素 αIIbβ3 和 α4β126 没有“激动”特性的拮抗剂。中性粒细胞在许多炎症性疾病中至关重要，例如心肌缺血再灌注损伤36、脓毒症 37 和自身免疫性疾病38,39。与基于抗体的药物相比，小分子药物可能在治疗这些疾病方面提供更大的灵活性。来自我们屏幕的点击可以为炎症性疾病提供潜在的治疗方法。
目前的方法是基于荧光抗体的高通量筛选。由于激活报告基因抗体也可用于 β1 40,41,42,43,44、αIIbβ3 45,46 和 αL 整合素 47,48,49,50，因此该方法可以扩展到鉴定其他整合素的拮抗剂。与 β1 杂交结构域 51,52,53 结合的构象敏感抗体（如 HUTS-21）已用于高通量筛选，以鉴定极晚期抗原-4（VLA-4，整合素 α4β1）变构拮抗剂54。本筛选方法还可以修改和扩展，以发现抑制或促进其他表面受体表达的药物，例如增加囊性纤维化跨膜电导调节剂（CFTR）在囊性纤维化（CF）细胞上表面表达的化合物。在 CF 中，多个突变导致 CFTR 错误折叠，导致细胞膜上CFTR 缺失表达 55。小分子药物已被证明可以恢复 CFTR 表达56。对于方案修改，有必要将药物的孵育时间增加到几个小时，以允许蛋白质表达发生变化。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢康涅狄格大学健康中心流式细胞术核心的 Evan Jellison 博士和 Li Zhu 女士在流式细胞术方面的帮助，感谢康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Lynn Puddington 博士对仪器的支持，感谢康涅狄格大学健康中心临床研究核心的 Slawa Gajewska 女士和 Paul Appleton 博士在获取血液样本方面的帮助。我们感谢康涅狄格大学医学院的 Christopher “Kit” Bonin 博士和 Geneva Hargis 博士在科学写作和编辑本手稿方面提供的帮助。这项研究得到了美国国立卫生研究院、美国国家心脏、肺和血液研究所 （R01HL145454）、美国国家普通医学科学研究所 （P20GM121176）、美国心脏协会职业发展奖 （18CDA34110426） 和康涅狄格大学健康中心的启动基金的支持。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-channel pipettes | Thermo | 4661090N | Instrument |
| 384-well plate | Greiner | 784201 | Materials |
| APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 | BioLegend | 363410 | Reagents |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform | Agilent | 16050-102 | 384 multi-channel liquid handler |
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
| FlowJo | Becton, Dickinson & Company | NA | Software |
| Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
| Lifitegrast | Thermofisher | 50-208-2121 | Reagents |
| Nexinhib20 | Tocris | 6089 | Reagents |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | F3506 | Reagents |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagents |
| Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
| Plate shaker | Fisher | 88-861-023 | Instrument |
| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | Reagents |
| Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) | Prestwick Chemical Libraries | Ver19_384 | 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved) |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11-835-030 | Reagents |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad Laboratories | Model ZE5 | Instrument |
References
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