Summary
このプロトコルは人間の好中球のβ2インテグリンの活発化を禁じる低分子薬剤を識別するために流れのcytometryベースの、ハイスループットのスクリーニング方法を記述する。
Abstract
このプロトコルは、β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを特定する方法を確立することを目的としており、コンフォメーション変化報告抗体とハイスループットフローサイトメトリーを利用しています。この分析法は、他の抗体ベースのハイスループットスクリーニング法のガイドとしても役立ちます。β2インテグリンは、免疫応答に重要な白血球特異的な接着分子です。好中球は、感染症と戦うだけでなく、複数の炎症性疾患に関与するために、血流から出るためにインテグリンの活性化に依存しています。β2インテグリンの活性化を制御することは、好中球関連炎症性疾患を治療するための実行可能なアプローチです。このプロトコルでは、モノクローナル抗体であるmAb24は、β2インテグリンの高親和性ヘッドピースに特異的に結合し、単離された一次ヒト好中球のβ2インテグリンの活性化を定量化するために利用されます。N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)は、好中球β2インテグリンを活性化するための刺激として使用されます。この研究では、384ウェルプレートサンプルを自動的に分析できるハイスループットフローサイトメーターを使用しました。β2 インテグリン阻害に対する 320 種類の化学物質の効果を 3 時間以内に評価します。このアプローチにより、β2インテグリンを直接標的とする分子、またはGタンパク質共役受容体開始インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の標的分子を同定することができます。
Introduction
多くの炎症性疾患は、腫れまたは損傷の部位における好中球の浸潤を特徴とする1。これらの組織に浸潤するために、好中球は、内皮への停止、血管壁を横切る血管外漏出、および組織への動員を含む好中球動員カスケードを完了する必要があります2。循環好中球は、特に停止期において、このカスケードを完了するためにβ2インテグリン活性化を必要とします。したがって、好中球の接着、血管外漏出、および動員を減少させるインテグリン阻害薬は、炎症性疾患を効果的に治療する可能性があります3,4。
β2インテグリンは、以前から炎症性疾患の標的となっていました。インテグリンαLβ2を直接標的とするモノクローナル抗体であるエファリズマブは、乾癬の治療薬として開発されました5。しかし、エファリズマブは、JCウイルスの再活性化に起因する進行性多巣性白質脳症という致命的な副作用のために中止されました6,7。新しい抗炎症インテグリンベースの治療法では、副作用を最小限に抑えるために白血球の抗感染機能を維持することを考慮する必要があります。エファリズマブの副作用は、血流中のモノクローナル抗体の循環が長引くことが原因である可能性があり、長期的には免疫機能を阻害する可能性があります8。最近の研究では、エファリズマブがαLβ2架橋とα4インテグリンの望ましくない内在化を媒介することが示されており、副作用の代替的な説明を提供しています9。したがって、短命の低分子アンタゴニストはこの問題を回避できる可能性があります。
ここでは、ヒト好中球を用いた低分子β2インテグリン拮抗薬のスクリーニングのためのハイスループット法を紹介します。β2インテグリンの活性化は、インテグリンエクトドメインへのアクセスとリガンドへの結合親和性の増加を得るために、インテグリンエクトドメインの立体配座変化を必要とします。正準スイッチブレードモデルでは、ベントクローズドインテグリンエクトドメインは、最初に拡張-閉鎖コンフォメーションまで伸長し、次にそのヘッドピースを完全に活性化された拡張-開放コンフォメーションに開きます10,11,12,13。また、ベントクローズドからベントオープン、エクステンデッドオープン、最終的には14,15,16,17,18,19までの代替経路もあります。コンフォメーション特異的抗体mAb24は、エクトドメインのヘッドピースが開いているときにヒトβ2-I様ドメインのエピトープに結合します20,21,22,23。
ここでは、mAb24-APCを使用して、β2インテグリンが活性化されているかどうかを判断します。好中球とインテグリンを活性化するために、好中球β2インテグリン24を活性化できる細菌由来の短い走化性ペプチドであるN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)をこのプロトコルの刺激として使用します。fMLPが好中球上のFpr1に結合すると、Gタンパク質、ホスホリパーゼCβ、およびホスホイノシチド3-キナーゼγを含む下流のシグナル伝達カスケードが活性化されます。これらのシグナル伝達事象は、最終的に、インサイドアウトシグナル伝達経路を介してインテグリン活性化をもたらす18,25。β2インテグリンに直接結合し、インテグリン活性化の立体構造変化を防ぐ低分子アンタゴニスト26に加えて、β2インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の成分を阻害できる化合物もこの方法で検出されます。自動フローサイトメーターにより、ハイスループットスクリーニングが可能になります。新しいアンタゴニストを同定することで、インテグリン生理学の理解が深まるだけでなく、インテグリンベースの抗炎症療法に関するトランスレーショナルな洞察が得られる可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ヘパリン処理された全血サンプルは、ヘルシンキ宣言の原則に従って、UConn Health の治験審査委員会によって承認されたインフォームド コンセントを取得した後、匿名化された健康な人間のドナーから採取されました。すべてのドナーからインフォームドコンセントが得られました。この研究の選択/除外基準は、参加者の適合性を確保し、潜在的なリスクを最小限に抑えるために慎重に開発されました。適格な参加者は、18歳から65歳で、あらゆる民族で、英語に堪能で、インフォームドコンセントを提供できる人でした。除外された参加者には、法的に権限のある代理人を必要とする人、18歳未満または65歳以上の個人、投獄された個人、妊娠中の女性など、自分でインフォームドコンセントを提供できない人が含まれていました。さらに、参加者は抗炎症薬の使用や炎症状態から解放されている必要がありました。現在の感染症または進行中の慢性または急性炎症状態も除外基準でした。最後に、COVID-19感染の既往歴がある人または最近の人は、この研究に不適格でした。これらの基準は、研究結果に影響を与える可能性のある潜在的な交絡因子を最小限に抑えながら、参加者の安全性と適合性を確保するように設計されています。
1. 試薬の調製
- 好中球培地:フェノールレッドを含まないRPMI-1640に2%ヒト血清アルブミンを添加して好中球培地を調製します( 材料表を参照)。
- fMLP溶液:10 mM fMLPジメチルスルホキシド(DMSO)保存溶液( 資料表を参照)を、フェノールレッドを含まないRPMI 1640で100倍に希釈してfMLP溶液を調製し、100 μMのfMLP溶液を生成します。
- 抗体溶液:β2インテグリンの高親和性コンフォメーションを報告するアロフィコシアニン(APC)標識モノクローナル抗体mAb24(mAb24-APC)( 資料表参照)120 μLを10 mLの好中球培地で希釈し、1.2 μg/mLのmAb24-APC溶液を調製します。
- 化合物ライブラリー:リキッドハンドラーを使用して、384ウェルプレート中のDMSO45 μLに10 mMライブラリー( 材料表を参照)5 μLを添加することにより、最初の化合物ライブラリーを10 mM〜1 mMの濃度で希釈します。続いて、リキッドハンドラーを使用して、1 mM 化合物ライブラリーのウェルあたり 5 μL を空の 384 ウェルプレートに移します。
- 図 1 に示すように、4 つのカラム( 1、2、23、24)には DMSO のみが含まれ、化合物は含まれておらず、スクリーニングのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能しました。フェノールレッドを含まないRPMI-1640を45μL添加して各ウェルをさらに希釈し、すべての化合物の最終濃度を100μMにします。
2. ヒト血液からの好中球分離
- 血清ピペットを使用して、市販の密度勾配培地( 材料表を参照)8 mLの上に4 mLの血液を15 mLの遠心分離チューブに慎重に重ねます(図2A)。
- 血液を550 × g で20°Cで30〜50分間遠心分離します。 ローターを徐々に減速します(減速係数1)。
注:赤血球からの好中球( 図2Bのバンド2)の分離の成功は、ドナーによって異なる場合があります。ほとんどのドナーでは、30分間の遠心分離で十分です。ただし、一部のドナーでは、分離が成功しない場合、さらに10〜30分の遠心分離が必要になる場合があります(図2C)。 - 血漿(上部の黄色い液体)と単核細胞(上部の曇ったバンド; 図2BのPBMCバンド)を1mLのピペットで使用しました。
- 下部の濁ったバンド( 図2Bの好中球バンド)から好中球を採取し、透明な液体の約3〜4 mL下から、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む15 mL遠心分離チューブに収集します。好中球懸濁液を2〜3回反転させて静かに混合します。
- 懸濁液を400 × g で20°Cで10分間遠心分離し、デカンティングして上清を慎重に除去します。
- ペレットを5 mLのPBSで静かに再懸濁し、300 × g で20°Cで5分間遠心分離します。
- デカントして上澄み液を取り除き、真空吸引を使用してチューブ口の周りとチューブ壁に残っている上澄みを慎重に除去します。ペレットを好中球培地1mLに再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。典型的には、1〜4〜10×7 個の好中球が8mLのヒト血液から得られた。
注:好中球懸濁液に赤血球汚染がある可能性があります。赤血球はほとんどのアッセイに大きな影響を与えず、好中球の活性化/プライミングを妨げる可能性があります27。正確な好中球濃度を得るためには、赤血球をカウントする前に溶解する必要があります。10 μLの細胞懸濁液を891 μLの脱イオン水に10〜30秒間加えて赤血球を溶解し、次に99 μLの10× PBSを加えて浸透圧のバランスを取り、好中球の溶解を防ぎます。 - 好中球培地を添加して、細胞密度を6.25×105 細胞/mLに調整します。
3. 384ウェルプレートの調製
- 1.5 mLの遠心チューブに、1 mLの抗体溶液(1.2 μg/mL mAb24-APC)と0.2 mLの好中球培地を混合して、1 μg/mLのmAb24-APC溶液を調製します。次に、この混合物 25 μL を 384 ウェルプレート( 図 1 の青色のウェル)のネガティブコントロールウェルに添加します。
- 15 mLの遠心チューブ内で、9 mLの抗体溶液を21.6 μLのfMLP溶液(100 μM)および1.7784 mLの好中球培地と混合し、1 μg/mLのmAb24-APCおよび200 nM fMLPを含む溶液を調製します。次に、この混合物 25 μL を 384 ウェルプレート( 図 1 の赤と青のウェル)のポジティブコントロールおよびテストウェルに加えます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、100 μM の化合物溶液のうち 5 μL を化合物ライブラリプレートから 384 ウェルプレートに移します。
- 液体を室温で500 × gで1分間遠心分離します。
注:プレートを遠心分離するには、スイングバケットローターとプレートバケットが必要です。
4. 細胞の処理
- 16チャンネルピペット(384ウェルプレートの各カラムで5〜50μLの範囲)を使用して、各ウェルに20μLの好中球懸濁液を加えます。ピペットを使用して5〜10回静かに混合し、各ピペッティング間の時間間隔を一定に保ちます。
注:ウェル内の最終濃度は次のとおりです:好中球2.5×105 細胞/ mL(すべてのウェル);mAb24-APC 0.5 μg/mL (全ウェル);fMLP 100 nM(ポジティブコントロールおよびテストウェル);化合物10μM(試験ウェル)。 - プレートをシェーカー上で300rpm、室温(RT)、10分間インキュベートします。
- 16チャンネルピペット(最終PFA濃度~0.91%)を使用して、各ウェルに3 μLの16%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加して細胞を固定します。その後、氷上で10分間インキュベートします。
注:好中球と PFA を添加する際には、異なるカラム間で一定の時間間隔を維持することが推奨されます。これにより、各ウェルの好中球は、fMLPおよびmAb24-APCで同じインキュベーション時間を持つようになります。
5. フローサイトメトリー
- フローサイトメーターの電源を入れ( 材料表を参照)、装置に接続されているコンピューターの電源もオンになっていることを確認します。
- シース液容器が満杯で、廃液容器が空で、機器に正しく接続されていることを確認してください。
- 384ウェルプレートをフローサイトメーターのサンプルローダーにロードします。プレートの A1 ウェルがローダーの A1 マークと揃っていることを確認します。
- ソフトウェアを開き、新しい実験を作成します。 384ウェル を選択し、目的の蛍光色素を選択します。次に、 プレート設定をクリックし、ドラッグしてすべてのウェルを選択し、 サンプルをクリックします。「高スループット」スイッチをオンにし、レートパネルの下にある 「高」 を選択します。
- ボリュームボックスに 「50」と入力します。奇数列のサンプルを選択し、「撹拌」スイッチをアクティブにします。最後に、右側のパネルでサンプルに名前を付けます。
- Plot and gateをクリックします。次に、[適用]ボタン(緑色で塗りつぶされた円の上の2つの矢印)をクリックし、続いて再生ボタン(三角形の形)をクリックします。数秒待って最初のウェルからいくつかのセルを観察し、一時停止ボタンをクリックします。
- FSC 電圧と SSC 電圧を調整して、プロット上のセルが適切に可視化されるようにします。 Acquisitionをクリックし、 再生 ボタン(三角形)をクリックしてアッセイを開始します。
- フローサイトメーターは、各ウェルから1000-3000の好中球を~50μL順次サンプリングします。384ウェルプレート全体を完成させるには、約3時間かかります。
- すべてのサンプルを完了したら、次の手順のために .fcs ファイルをエクスポートします。
6. データ解析
- フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。すべての.fcsファイルを含むフォルダを選択してソフトウェアウィンドウにドラッグし、放してデータをソフトウェアにインポートします。
- 1つのサンプルをダブルクリックし、ポップアップウィンドウでFSCおよびSSC28、29、30 に基づくゲート単一好中球を表示します( 図3を参照)。ゲート付きの行を選択してフォルダーにドラッグし、離すと、そのフォルダー内のすべてのサンプルにゲートが適用されます。
- ソフトウェアのテーブルエディター機能を使用して、各ウェルからの好中球のAPC中央蛍光強度(MFI)を計算してエクスポートします。「編集」タブの「列の追加」をクリックします。統計量タブで中央値を選択し、ゲート母集団好中球を選択し、パラメータとしてAPCを選択します。[OK]ボタンをクリックします。
- 「Table editor」タブに戻り、「Group」タブの All Samples を選択し、 Create tableボタンを押します。新しいウィンドウが開き、作成されたテーブルが表示されます。テキスト、CSV、またはExcelファイルとして保存します。
- エクスポートした表を開き、ポジティブコントロールサンプルとネガティブコントロールサンプルのAPC MFIの平均値と標準偏差を計算します(図4)。
- プレートのZ'係数(Z')は、次の式を使用して計算します。
Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn)、
ここで、σ p と σ n は、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールの標準偏差であり、μp と μn は、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールの平均である31。
注:Z'係数は、正の対照分布と負の対照分布の分離を示します。Z' が 0 の場合は分離がないことを意味し、Z' が 0.5 の場合は分離が等しいことを示します。以前の研究31で述べたように、Z'>0.5は化合物スクリーニングのための優れたアッセイを示しています。0.5 から 0 の範囲の Z' は許容されますが、アッセイで強いヒットを同定するだけであり、二次アッセイでさらに検証する必要があります。 - 化合物処理した好中球のAPC MFIが、ポジティブコントロールMFIからポジティブコントロールMFIを差し引いた標準偏差の3倍より低い場合、化合物をスクリーニングの「ヒット」と見なします(P = 0.0013、 図4の点線で表されます)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
代表的な384ウェルプレートスクリーニングのデータ(図4)では、陰性対照のmAb24-APCのMFIは3236±110であり、陽性対照のmAb24-APCのMFIは7588±858であることが明らかになりました。このプレートのZ'係数は約0.33で、許容範囲内です31。ただし、Z'は二次アッセイでさらに検証する必要があります。
データを正規化するために、すべての値をスケーリングして、正の平均に最大値 1 を割り当て、負の平均に最小値 0 を割り当てました。Z'因子は、二次アッセイでより厳密な検証を受けます。このプレートのカットオフは 0.41 に設定されており、相対 MFI が 0.41 未満のサンプルは、ヒト好中球における fMLP 誘導性 β2 インテグリン活性化を阻害するヒットと見なされます。このプレートからのヒットは確認されませんでした。
プロトコルの有効性を確認するために、Rac-1機能に拮抗してβ2インテグリン活性化を阻害するNexinhib20と、インテグリンαLβ2に直接拮抗するlifitegrast32,33が使用された。ただし、インキュベーション時間は、ネキシンヒブ20で1時間、リフィテグラストで30分に調整されました。.これらの実験から得られたデータは、上記と同じスケーリング方法を使用して正規化されました。次に、これらのデータポイントをプレートの結果と組み合わせ、まとめて分析しました(図4)。
図1:化合物スクリーニングのプレートレイアウト。 384 ウェルプレートにおけるスクリーニング化合物およびコントロールの配置を示す概略図。ネガティブコントロールウェルは青色(1列目と23列目)で、ポジティブコントロールウェルは赤色(2列目と24列目)で示されています。試験井はベージュ色で表されます(列3から22)。矢印は、プレートを読み取るための順序を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:密度勾配培地を用いた好中球分離。 密度勾配培地を用いた好中球の分離の成功と失敗を示す代表的な写真。(A)最初に、4 mLの血液を8 mLの密度勾配培地に層状にします。(B)遠心分離後、主に末梢血単核球(PBMC)を含む上部バンドと、赤血球(RBC)を含む好中球を主に含む下部バンドの2つの濁ったバンドが見えるはずです。ほとんどの赤血球は底部にペレット状にされています。(C)赤血球がペレット化されず、好中球バンドが観察されない分離の失敗。好中球バンドを分離するには、追加の遠心分離(10〜30分)が必要です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:FSC/SSCプロットを用いた好中球のゲーティング。 好中球を同定するためのゲーティング戦略を示す代表的な前方散乱線(FSC)および側方散乱線(SSC)プロット。(A)好中球は、フローサイトメーターによって記録された前方散乱(FSC-A)および側方散乱(SSC-A)の面積に基づいてゲーティングされます。(B)前方散乱の幅(FSC-W)と高さ(FSC-H)、および(C)側方散乱の幅(SSC-W)と高さ(SSC-H)に基づいて、単一セルをさらにゲーティングします。カラー スケールはセル密度を表し、密度が減少するにつれて赤から黄、緑、青に変化します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:代表的な384ウェルプレートでのスクリーニング結果。 スクリーニング結果は代表的な 384 ウェルプレートで、Z' 係数は 0.3 でした。ネガティブコントロールとポジティブコントロールは、それぞれ青と赤の点で示されます。さまざまな化合物で処理されたテストサンプルは、ベージュのドットで表されます。破線は、ヒットを識別するための平均蛍光強度(MFI)カットオフを表します。試験されたすべての化合物がカットオフラインを超えるMFI値を示したため、試験された化合物はいずれもβ2インテグリン拮抗薬として同定されませんでした。既知のβ2インテグリン拮抗薬をさまざまなインキュベーション時間(ネキシンヒブ20を1時間、ライフテグラストを30分)で試験した独立した実験の結果を、この図に示するためにプールしています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
好中球の刺激と染色の開始と終了は、好中球と固定剤PFAの添加によって決定されます。したがって、好中球または PFA を各カラムにピペッティングする間隔を同じにすることが重要です。これにより、各ウェルからの好中球の刺激と染色時間が一定に保たれます。好中球の寿命は短いため、ドナーからの採血からフローサイトメトリーの完了まで、すべての実験を同じ日に実施する必要があります。好中球は温度変化に非常に敏感であり、4°Cから室温または室温から37°Cへの移行などの急激な温度上昇にさらされると活性化する可能性があります。 さらに、これまでの経験から、fMLPによる好中球β2インテグリンの活性化は、細胞を氷上または4°Cで保存した場合には起こりません(データは示していません)。したがって、固定前に、全血および好中球を室温または20°C(単離遠心分離ステップ中)に保管する必要があります。全血や好中球を氷の上に置かないでください。
ネガティブコントロールでmAb24を染色すると、非常に低い結果が得られるはずです。実験で高いmAb24染色レベルが観察された場合は、(1)固定前の実験中に有意な温度変化があったかどうかを確認してください。(2)好中球培地にfMLPまたはエンドトキシン汚染があったかどうか。(3)ピペッティングや混合中に気泡が発生するなど、サンプルの取り扱いが強すぎないか。
現在のプロトコルでは、mAb24を使用してβ2インテグリンヘッドピースの開口を報告します。理論的には、β2インテグリンの伸長を報告するモノクローナル抗体であるKIM127 34,35をmAb24と併用することで、β2インテグリンのコンフォメーションを包括的に評価することができます。しかし、KIM127染色のS/N比(1.5〜2倍)はmAb24のS/N比(5〜10倍)ほど良好ではなく、通常、384ウェルプレートアッセイでは満足のいくZ'因子が得られません。96ウェルプレートアッセイでは、フローサイトメトリーを行う前にサンプルを洗浄できるため、可溶性抗体由来のバックグラウンドシグナルが低減されます。したがって、KIM127ベースのアッセイは、384ウェルプレートアッセイと比較してスループットの低い96ウェルプレートアッセイで実施できます。
この方法では、薬物のインテグリン阻害効果を評価するための読み出しとして蛍光強度を使用するため、一部の蛍光薬物が結果を妨げる可能性があります。さらに、10分間の刺激期間内に好中球死を誘発する有毒薬物も、インテグリン阻害を報告するようです。好中球の脱顆粒を阻害する薬剤は、β2インテグリンの全体的な発現を抑制します。これらの脱顆粒阻害剤もスクリーニングで特定されます。したがって、ヒットの抑制効果を確認するために、他の対照との二次スクリーニングが必要です。セカンダリ画面は、ヒットの作用機序を検証および決定するための手段として参照されます。mAb24 テストを繰り返すことに加えて、細胞表面の総 CD18 発現は、汎抗ヒト CD18 抗体を使用して評価されます。mAb24 によって測定される活性化 β2 インテグリンのレベルは、総 CD18 発現によって正規化されます。これにより、薬剤の作用機序がインテグリンの活性化に拮抗するか、細胞表面でのCD18の発現を阻害するかを決定することができます。生存率アッセイは、ヒットの毒性作用を除外するために、二次スクリーニングでも実行する必要があります。
このプロトコルには制限があります。第1に、mAb24は、インテグリンが高親和性状態にある場合にのみ、β2 I様ドメインを検出することができます。したがって、mAb24結合の減少により、リフィテグラストなどのα/β I様アロステリックアンタゴニストを同定することはできません。リフィテグラストはより多くのmAb24結合を誘導し32 、mAb24でMFI値が異常に増加します(図4)。このような異常な値の場合、これらのヒットがα/β I様アロステリックアンタゴニストであるかどうかを検証するために、他のアッセイが必要になる場合があります。第二に、このアッセイのZ'係数は最適ではなく、自動ピペッティングと撹拌の使用によって改善される可能性があります。残念ながら、私たちの研究室には、この仮説を検証するために必要な機器がありません。アッセイの複製または三重化は、上記の方法でZ'因子をさらに改善できない場合に、偽陽性および偽陰性を特定するのに役立ちます。さらに、既知のβ2インテグリン活性化阻害剤Nexinhib20で観察されるように、阻害効果を生じさせるには1時間のインキュベーションを必要とするように、インキュベーション時間を延長してより多くのヒットを同定することが有益であり得る。この研究は、即効性のある薬剤の同定に焦点を当てました。研究者は、特定のニーズに合わせてインキュベーション時間を変更できることに注意する必要があります。
私たちの知る限り、これはβ2インテグリン拮抗薬に対する最初のハイスループットスクリーニング法です。このアプローチは、β2インテグリンに直接結合し、インテグリンαIIbβ3およびα4β1について最近報告された「アゴニスト」特性を持たないアンタゴニストと同様に、中親和性/高親和性インテグリン状態につながるコンフォメーション変化を阻止する低分子化合物を特定するために使用できる可能性があります26。好中球は、心筋虚血再灌流障害36、敗血症37、自己免疫疾患38,39など、多くの炎症性疾患において重要である。低分子医薬品は、抗体ベースの医薬品と比較して、これらの疾患の治療においてより柔軟性が高い可能性があります。私たちの画面からのヒットは、炎症性疾患の潜在的な治療法を提供する可能性があります。
現在の方法は、蛍光抗体ベースのハイスループットスクリーニングです。β1 40,41,42,43,44、αIIbβ345,46、αLインテグリン47,48,49,50にも活性化レポーター抗体が利用できるため、この方法は他のインテグリンのアンタゴニストの同定にも拡張できます。β1ハイブリッドドメイン51,52,53に結合するHUTS-21のような立体構造感受性抗体は、非常に遅い抗原-4(VLA-4、インテグリンα4β1)アロステリックアンタゴニストを同定するためにハイスループットスクリーニングで用いられている54。本スクリーニング方法は、嚢胞性線維症(CF)細胞における嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節器(CFTR)表面発現を増加させる化合物など、他の表面受容体の発現を阻害または促進する薬物を見出すために、改変および拡張することもできる。CFでは、複数の変異がCFTRのミスフォールディングを引き起こし、その結果、細胞膜上でCFTRの発現が欠如する55。低分子医薬品はCFTR発現を回復させることが示されている56。プロトコールの修飾では、薬物のインキュベーション時間を数時間に増やして、タンパク質の発現変化を発生させる必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する金銭的利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
UConn HealthのフローサイトメトリーコアのEvan Jellison博士とLi Zhu氏にはフローサイトメトリーの支援を、UConn Healthの免疫学部門のLynn Puddington博士には機器のサポートを、UConn Healthの臨床研究コアには血液サンプルの採取に協力していただいたSlawa Gajewska氏とPaul Appleton博士に感謝します。UConn School of MedicineのChristopher "Kit" Bonin博士とGeneva Hargis博士には、この原稿の科学的執筆と編集に協力していただいたことに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所、国立心肺血液研究所(R01HL145454)、米国国立総合医学研究所(P20GM121176)、米国心臓協会からのキャリア開発賞(18CDA34110426)、およびUConn Healthからのスタートアップ資金の支援を受けました。 図 1 は BioRender.com で作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-channel pipettes | Thermo | 4661090N | Instrument |
| 384-well plate | Greiner | 784201 | Materials |
| APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 | BioLegend | 363410 | Reagents |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform | Agilent | 16050-102 | 384 multi-channel liquid handler |
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
| FlowJo | Becton, Dickinson & Company | NA | Software |
| Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
| Lifitegrast | Thermofisher | 50-208-2121 | Reagents |
| Nexinhib20 | Tocris | 6089 | Reagents |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | F3506 | Reagents |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagents |
| Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
| Plate shaker | Fisher | 88-861-023 | Instrument |
| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | Reagents |
| Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) | Prestwick Chemical Libraries | Ver19_384 | 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved) |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11-835-030 | Reagents |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad Laboratories | Model ZE5 | Instrument |
References
- Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
- Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
- Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
- Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
- Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
- Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
- Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
- Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
- Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
- Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
- Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
- Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
- Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
- Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
- Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
- Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
- Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
- Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
- Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
- Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
- Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
- Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
- Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
- Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
- Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
- Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
- Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
- Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
- Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
- Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
- Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
- Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
- Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
- Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
- Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
- Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
- Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
- Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
- Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
- Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
- Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
- Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
- Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
- Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
- Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
- Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
- van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
- Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
- Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
- Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
- Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
- Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).
