Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En flowcytometribaseret teknik med høj gennemstrømning til screening af integrinhæmmende lægemidler

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/64401
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4,5, 3,4, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

Summary

Denne protokol beskriver en flowcytometribaseret screeningsmetode med høj kapacitet til identifikation af småmolekylelægemidler, der hæmmer β2-integrinaktivering på humane neutrofiler.

Abstract

Denne protokol sigter mod at etablere en metode til identifikation af små molekylære antagonister af β2 integrinaktivering ved hjælp af konformationsændringsrapporterende antistoffer og high-throughput flowcytometri. Metoden kan også tjene som vejledning for andre antistofbaserede screeningsmetoder med høj kapacitet. β2-integriner er leukocytspecifikke adhæsionsmolekyler, der er afgørende for immunresponser. Neutrofiler er afhængige af integrinaktivering for at forlade blodbanen, ikke kun for at bekæmpe infektioner, men også for at være involveret i flere inflammatoriske sygdomme. Kontrol af β2 integrinaktivering præsenterer en levedygtig tilgang til behandling af neutrofilassocierede inflammatoriske sygdomme. I denne protokol anvendes et monoklonalt antistof, mAb24, som specifikt binder til hovedstykket med høj affinitet af β2-integriner, til at kvantificere β2-integrinaktivering på isolerede primære humane neutrofiler. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP) anvendes som stimulus til aktivering af neutrofile β2-integriner. Et flowcytometer med høj kapacitet, der automatisk kunne køre 384-brønds pladeprøver, blev anvendt i denne undersøgelse. Virkningerne af 320 kemikalier på β2 integrinhæmning vurderes inden for 3 timer. Molekyler, der direkte målretter β2-integriner eller målmolekyler i G-proteinkoblede receptorinitierede integrin indefra og ud-aktiveringssignalveje, kan identificeres gennem denne tilgang.

Introduction

Mange inflammatoriske sygdomme er karakteriseret ved infiltration af neutrofiler på stedet for hævelse eller skade1. For at infiltrere disse væv skal neutrofiler fuldføre neutrofilrekrutteringskaskaden, hvilket indebærer anholdelse til endotelet, ekstravasation over karvæggen og rekruttering i vævet2. Cirkulerende neutrofiler har brug for β2 integrinaktivering for at fuldføre denne kaskade, især til anholdelsesfasen. Således kan integrinhæmmende lægemidler, der reducerer neutrofiladhæsion, ekstravasation og rekruttering, effektivt behandle inflammatoriske sygdomme 3,4.

β2 integriner har været målrettet mod inflammatoriske sygdomme før. Efalizumab, et monoklonalt antistof, der er direkte rettet mod integrin αLβ2, blev udviklet til behandling af psoriasis5. Efalizumab blev imidlertid seponeret på grund af dets dødelige bivirkning - progressiv multifokal leukoencefalopati som følge af JC-virusreaktivering 6,7. Nye antiinflammatoriske integrinbaserede terapier bør overveje at opretholde leukocytternes antiinfektionsfunktioner for at minimere bivirkninger. Bivirkningerne af efalizumab kan skyldes den langvarige cirkulation af monoklonale antistoffer i blodbanen, hvilket kan hæmme immunfunktionerne på lang sigt8. En nylig undersøgelse viser, at efalizumab medierer αLβ2 tværbinding og uønsket internalisering af α4 integriner, hvilket giver en alternativ forklaring på bivirkningerne9. Således kan kortvarige antagonister med små molekyler undgå dette problem.

En high-throughput metode til screening af småmolekylære β2 integrinantagonister ved hjælp af humane neutrofiler præsenteres her. β2 integrinaktivering kræver konformationelle ændringer af integrin-ektodomænet for at få adgang til og øge dets bindingsaffinitet til dets ligand. I den kanoniske switchblade-model strækker det bøjede lukkede integrin-ektodomæne sig først til en udvidet lukket konformation og åbner derefter sit hovedstykke til en fuldt aktiveret udvidet åben konformation10,11,12,13. Der er også en alternativ vej, der starter fra den bøjede-lukkede til bøjet-åben og udvidet-åben, til sidst 14,15,16,17,18,19. Det kropsbygningsspecifikke antistof mAb24 binder sig til en epitop i det humane β2-I-lignende domæne, når ektodomænets hovedstykke er åbent20,21,22,23.

Her bruges mAb24-APC til at bestemme, om β2-integrinerne er aktiveret. For at aktivere neutrofiler og integrin anvendes N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP), et bakterielt afledt kort kemotaktisk peptid, der kan aktivere neutrofile β2-integriner24, som en stimulus i denne protokol. Når fMLP binder til Fpr1 på neutrofiler, aktiveres downstream-signalkaskader, der involverer G-proteiner, phospholipase Cβ og phosphoinositid 3-kinase γ. Disse signalhændelser resulterer i sidste ende i integrinaktivering via indefra-ud-signalvejen18,25. Udover små molekyleantagonister, der direkte binder til β2-integriner og forhindrer konformationelle ændringer af integrinaktivering26, vil forbindelser, der kan hæmme komponenter i β2-integrin-indefra-ud-aktiveringssignalvejen, også blive detekteret med denne metode. Automatiserede flowcytometre muliggør screening med høj kapacitet. Identifikation af nye antagonister kan ikke kun uddybe vores forståelse af integrinfysiologi, men også give translationel indsigt i integrinbaseret antiinflammationsbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hepariniserede fuldblodsprøver blev opnået fra afidentificerede raske humane donorer efter at have opnået informeret samtykke, som godkendt af Institutional Review Board of UConn Health, efter principperne i Helsinki-erklæringen. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle donorer. Inklusions-/eksklusionskriterierne for denne undersøgelse blev omhyggeligt udviklet for at sikre deltagernes egnethed og for at minimere potentielle risici. Berettigede deltagere var mellem 18 og 65 år, af enhver etnicitet, flydende engelsk og i stand til at give informeret samtykke. Ekskluderede deltagere omfattede dem, der ikke var i stand til at give informeret samtykke til sig selv, såsom dem, der kræver en juridisk autoriseret repræsentant, personer under 18 eller over 65 år, fængslede personer og gravide kvinder. Derudover skulle deltagerne være fri for brug af antiinflammatorisk medicin og inflammatoriske tilstande. Nuværende infektioner eller igangværende kroniske eller akutte inflammatoriske tilstande var også eksklusionskriterier. Endelig var personer med en aktuel eller nylig historie med COVID-19-infektion ikke berettiget til undersøgelsen. Disse kriterier blev designet til at sikre deltagernes sikkerhed og egnethed og samtidig minimere potentielle forvirrende faktorer, der kunne påvirke undersøgelsesresultaterne.

1. Fremstilling af reagenser

  1. Neutrofilmedium: Forbered det neutrofile medium ved at tilsætte 2% humant serumalbumin til RPMI-1640 uden phenolrød (se materialetabel).
  2. fMLP-opløsning: Forbered fMLP-opløsningen ved at fortynde den 100 gange fra 10 mM fMLP-dimethylsulfoxid (DMSO) opbevaringsopløsningen (se materialetabel) med RPMI 1640 uden phenolrød, hvilket resulterer i en 100 μM fMLP-opløsning.
  3. Antistofopløsning: Fortynd 120 μL allophycocyanin (APC)-konjugeret monoklonalt antistof mAb24 (mAb24-APC) (se materialetabel), som rapporterer højaffinitetskonformationen af β2-integrin i 10 ml neutrofilmedium, hvilket skaber en 1,2 μg/ml mAb24-APC-opløsning.
  4. Sammensat bibliotek: Fortynd det oprindelige sammensatte bibliotek med en koncentration på 10 mM til 1 mM ved at tilsætte 5 μL af 10 mM biblioteket (se materialetabel) til 45 μL DMSO i 384-brøndplader ved hjælp af væskehåndtereren. Derefter overføres 5 μL pr. hul i det 1 mM sammensatte bibliotek til en tom 384-brøndplade ved hjælp af væskehåndtereren.
  5. Som illustreret i figur 1 indeholdt fire kolonner (1, 2, 23, 24) kun DMSO, men ingen forbindelser, der tjente som positive og negative kontroller i screeningen. Yderligere fortyndes hvert hul ved tilsætning af 45 μL RPMI-1640 uden phenolrød, hvilket resulterer i en slutkoncentration på 100 μM for alle forbindelser.

2. Neutrofil isolering fra humant blod

  1. Brug en serologisk pipette til omhyggeligt at lægge 4 ml blod over 8 ml af et kommercielt tilgængeligt densitetsgradientmedium (se materialetabellen) i et 15 ml centrifugerør (figur 2A).
  2. Blodet centrifugeres ved 550 × g i 30-50 minutter ved 20 °C. Decelerer rotoren gradvist (decelerationsfaktor på 1).
    BEMÆRK: Den vellykkede adskillelse af neutrofiler (bånd 2 i figur 2B) fra røde blodlegemer kan variere blandt donorer. For de fleste donorer er en centrifugering på 30 minutter tilstrækkelig. For nogle donorer kan det dog være nødvendigt med yderligere 10-30 minutters centrifugering, hvis adskillelsen ikke lykkes (figur 2C).
  3. Fjern forsigtigt plasmaet (den gule væske ovenpå) og mononukleære celler (det øvre uklare bånd; PBMC-bånd i figur 2B) ved hjælp af en 1 ml pipette.
  4. Der opsamles neutrofiler fra det nedre uklare bånd (neutrofilbånd i figur 2B) og ca. 3-4 ml under den klare væske i et 15 ml centrifugeglas indeholdende 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS). Bland forsigtigt neutrofilsuspensionen ved at vende den 2-3 gange.
  5. Suspensionen centrifugeres ved 400 × g i 10 minutter ved 20 °C, hvorefter supernatanten forsigtigt fjernes ved dekantering.
  6. Pellet resuspenderes forsigtigt med 5 ml PBS og centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 20 °C.
  7. Supernatanten fjernes ved dekantering, og eventuelle resterende supernatanter fjernes forsigtigt omkring rørmundingen og på rørets væg ved hjælp af vakuumsugning. Resuspender pellet i 1 ml neutrofilmedium.
  8. Tæl cellenumrene ved hjælp af et hæmocytometer. Typisk blev 1 til 4 × 107 neutrofiler opnået fra 8 ml humant blod.
    BEMÆRK: Der kan være forurening af røde blodlegemer i neutrofilsuspensionen. Røde blodlegemer påvirker ikke signifikant de fleste assays og kan forhindre neutrofil aktivering/priming27. Røde blodlegemer skal lyseres før tælling for at opnå en nøjagtig neutrofilkoncentration. Tilsæt 10 μL af cellesuspensionen til 891 μL deioniseret vand i 10-30 s for at lyse de røde blodlegemer, tilsæt derefter 99 μL 10× PBS for at afbalancere det osmotiske tryk, hvilket forhindrer lysering af neutrofilerne.
  9. Celletætheden justeres til 6,25 × 105 celler/ml ved tilsætning af neutrofilmedium.

3. Klargøring af 384-brøndpladen

  1. I et 1,5 ml centrifugerør kombineres 1 ml antistofopløsning (1,2 μg/ml mAb24-APC) med 0,2 ml neutrofilmedium for at skabe en 1 μg/ml mAb24-APC-opløsning. Derefter tilsættes 25 μL af denne blanding til de negative kontrolhuller i en plade med 384 brønde (de blå huller i figur 1).
  2. I et 15 ml centrifugeglas blandes 9 ml af antistofopløsningen med 21,6 μL fMLP-opløsningen (100 μM) og 1,7784 ml neutrofilmedium for at skabe en opløsning indeholdende 1 μg/ml mAb24-APC og 200 nM fMLP. Derefter tilsættes 25 μL af denne blanding til de positive kontrol- og testbrønde i en plade med 384 brønde (de røde og blå huller i figur 1).
  3. 5 μL af de 100 μM sammensatte opløsninger overføres fra den sammensatte biblioteksplade til 384-brøndpladen ved hjælp af en flerkanalpipette.
  4. Centrifuger væsken i 1 min ved 500 × g ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: For at centrifugere plader kræves en svingskovlrotor og pladespande.

4. Behandling af celler

  1. Der tilsættes 20 μL af neutrofilsuspensionen til hvert hul ved hjælp af en 16-kanals pipette (5-50 μL for hver kolonne i 384-brøndpladen). Bland forsigtigt 5-10 gange med pipetten, og hold et ensartet tidsinterval mellem hver pipettering.
    BEMÆRK: De endelige koncentrationer i brøndene er som følger: neutrofiler 2,5 × 105 celler / ml (alle huller); mAb24-APC 0,5 μg/ml (alle brønde); fMLP 100 nM (positive kontrol- og testbrønde) forbindelser 10 μM (testbrønde).
  2. Pladen inkuberes på en ryster ved 300 omdr./min. ved stuetemperatur (RT) i 10 min.
  3. Fastgør cellerne ved at tilsætte 3 μL 16% paraformaldehyd (PFA) til hvert hul ved hjælp af en 16-kanals pipette (endelig PFA-koncentration ~ 0,91%). Derefter inkuberes på is i 10 min.
    BEMÆRK: Det anbefales at opretholde et konsistent tidsinterval mellem forskellige kolonner, når der tilføjes neutrofiler og PFA. Dette sikrer, at neutrofiler i hver brønd har samme inkubationstid med fMLP og mAb24-APC.

5. Flow cytometri

  1. Tænd flowcytometeret (se materialetabellen), og sørg for, at computeren, der er tilsluttet instrumentet, også er tændt.
  2. Sørg for, at kappevæskebeholderen er fyldt, og at affaldsbeholderen er tom og korrekt forbundet til instrumentet.
  3. Læg 384-brøndpladen på flowcytometerets prøvelæsser. Sørg for, at pladens A1-brønd flugter med A1-mærket på læsseren.
  4. Åbn softwaren, og opret et nyt eksperiment. Vælg 384 brønd , og vælg de ønskede fluoroforer. Klik derefter på Pladeopsætning, træk for at vælge alle brønde, og klik derefter på Sample. Tænd for kontakten "Høj gennemstrømning", og vælg Høj under hastighedspanelet.
    1. Indtast 50 i volumenfeltet. Vælg prøver i ulige kolonner, og aktiver derefter kontakten "Omrøring". Til sidst skal du navngive prøverne i højre panel.
  5. Klik på Plot og port. Klik derefter på knappen Anvend (to pile på en grøn fyldt cirkel), og klik derefter på afspilningsknappen (trekantform). Vent et par sekunder for at observere nogle celler fra den første brønd, og klik derefter på pauseknappen .
    1. Juster FSC- og SSC-spændingerne for at sikre korrekt visualisering af celler på plottet. Klik på Erhvervelse, og klik derefter på afspilningsknappen (trekantform) for at starte analysen.
  6. Flowcytometeret vil sekventielt prøve ~ 50 μL af 1000-3000 neutrofiler fra hver brønd. Det tager ca. 3 timer at færdiggøre hele pladen med 384 brønde.
  7. Når du har fuldført alle eksempler, skal du eksportere .fcs-filerne til næste trin.

6. Analyse af data

  1. Åbn flowcytometridataanalysesoftwaren (se materialetabel). Vælg og træk mappen, der indeholder alle .fcs-filer, til softwarevinduet, og slip derefter for at importere dataene til softwaren.
  2. Dobbeltklik på en prøve, gate single neutrofiler baseret på FSC og SSC28,29,30 i pop op-vinduet, som vist i figur 3. Vælg de lukkede rækker, træk dem til mappen, og slip derefter for at anvende gating-indstillingen på alle eksempler i mappen.
  3. Beregn og eksporter APC-medianfluorescensintensiteten (MFI) af neutrofiler fra hver brønd ved hjælp af softwarens tabeleditorfunktion. Klik på Tilføj kolonne under fanen Rediger . Vælg Median på fanen Statistik , vælg de lukkede populationsneutrofiler, og vælg APC som parameter. Klik på OK knap.
  4. Gå tilbage til fanen "Tabeleditor", vælg Alle prøver på fanen "Gruppe", og tryk på knappen Opret tabel . Der vises et nyt vindue, der viser den oprettede tabel. Gem den som en tekst-, CSV- eller Excel-fil.
  5. Åbn den eksporterede tabel, beregn middelværdien og standardafvigelsen for APC MFI for de positive og negative kontrolprøver (figur 4).
  6. Pladens Z'-faktor (Z') beregnes ved hjælp af ligningen:
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
    hvor σ p og σ n er standardafvigelserne for henholdsvis positive og negative kontroller, og μp og μn er middelværdierne for henholdsvis positive og negative kontroller31.
    BEMÆRK: Z'-faktoren angiver adskillelsen af de positive og negative kontrolfordelinger. Et Z' på 0 betyder ingen adskillelse, mens et Z' på 0,5 angiver lige adskillelse. Som nævnt i en tidligere undersøgelse31 indikerer Z' > 0,5 et fremragende assay til sammensat screening. A Z' i området fra 0,5 til 0 er acceptabelt, men det kan kun identificere stærke hits i assayet, hvilket vil kræve yderligere validering i sekundære assays.
  7. Overvej forbindelser som "hits" til screening, når APC MFI for forbindelsesbehandlede neutrofiler er lavere end tre gange standardafvigelsen for den positive kontrol-MFI trukket fra den positive kontrol-MFI (P = 0,0013, repræsenteret ved den stiplede linje i figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data fra en repræsentativ 384-brønds pladescreening (figur 4) afslørede, at negative kontroller havde en MFI på mAb24-APC på 3236 ± 110, mens positive kontroller havde en MFI på mAb24-APC på 7588 ± 858. Z'-faktoren for denne plade er ca. 0,33, hvilket er inden for et acceptabelt interval31. Z' kræver dog yderligere validering i sekundære assays.

For at normalisere dataene blev alle værdier skaleret til at tildele en maksimal værdi på 1 til det positive gennemsnit og en minimumsværdi på 0 til det negative gennemsnit. Z'-faktoren vil gennemgå strengere validering i sekundære assays. Afskæringen for denne plade er sat til 0,41, hvilket betyder, at prøver med en relativ MFI lavere end 0,41 vil blive betragtet som hits, der hæmmer fMLP-induceret β2 integrinaktivering i humane neutrofiler. Ingen hits blev identificeret fra denne plade.

For at bekræfte protokollens effektivitet blev Nexinhib20, som hæmmer β2 integrinaktivering ved at antagonisere Rac-1-funktion, og lifitegrast, som antagoniserer integrin αLβ2 direkte32,33, anvendt. Inkubationstiden blev dog justeret til en time for Nexinhib20 og en halv time for lifitegrast. De resulterende data fra disse eksperimenter blev normaliseret ved anvendelse af den samme skaleringsmetode beskrevet ovenfor. Disse datapunkter blev derefter kombineret med pladeresultaterne og analyseret kollektivt (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Pladelayout til sammensat screening. Et skematisk diagram, der illustrerer arrangementet af screeningsforbindelser og kontroller i en 384-brøndplade. Negative kontrolbrønde er afbildet med blåt (kolonne 1 og 23), og positive kontrolbrønde er vist med rødt (kolonne 2 og 24). Testbrønde er repræsenteret i beige (kolonne 3 til 22). Pile angiver sekvensen for læsning af pladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Neutrofilseparation ved hjælp af densitetsgradientmedium. Repræsentative fotos, der demonstrerer den vellykkede og mislykkede adskillelse af neutrofiler ved hjælp af densitetsgradientmedium. (A) Indledningsvis lægges 4 ml blod på 8 ml densitetsgradientmedium. (B) Efter centrifugering skal to uklare bånd være synlige: det øverste bånd, der primært indeholder mononukleære celler i perifert blod (PBMC), og det nederste bånd, der hovedsagelig indeholder neutrofiler med nogle røde blodlegemer (RBC'er). De fleste RBC'er er pelleteret i bunden. (C) En mislykket adskillelse, hvor RBC'er ikke pelleteres, og neutrofilbåndet ikke overholdes. Yderligere centrifugering (10-30 min) ville være nødvendig for at adskille neutrofilbåndet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Gating af neutrofiler ved hjælp af FSC / SSC-plots. Repræsentative forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) plots, der illustrerer gating-strategien til identifikation af neutrofiler. (A) Neutrofiler er lukket baseret på arealet af fremadrettet spredning (FSC-A) og sidespredning (SSC-A) registreret af flowcytometeret. (B) Enkeltceller er yderligere gated baseret på bredden (FSC-W) og højden (FSC-H) af fremadrettet spredning og (C) bredden (SSC-W) og højden (SSC-H) af sidespredning. Farveskalaen repræsenterer celletæthed, der skifter fra rød til gul, grøn og blå, når densiteten falder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Screeningsresultater i en repræsentativ 384-brøndplade. Screeningen er resultatet af en repræsentativ plade med 384 brønde, der viser en Z'-faktor på 0,3. Negative og positive kontroller er angivet med henholdsvis blå og røde prikker. Testprøver behandlet med forskellige forbindelser er repræsenteret som beige prikker. Den stiplede linje repræsenterer den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) cut-off til identifikation af hits. Ingen af de testede forbindelser blev identificeret som β2 integrinantagonister, da alle testede forbindelser viste MFI-værdier over afskæringslinjen. Resultater fra uafhængige eksperimenter, der tester kendte β2 integrinantagonister med varierende inkubationstider (Nexinhib20 i 1 time, lifitegrast i en halv time) samles til præsentation i denne figur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Initiering og ophør af neutrofil stimulering og farvning bestemmes ved tilsætning af neutrofiler og det fikserende PFA. Derfor er det afgørende at sikre det samme tidsinterval mellem pipettering af neutrofiler eller PFA i hver kolonne. Dette sikrer, at stimulerings- og farvningstiden for neutrofiler fra hver brønd forbliver konsistent. På grund af neutrofilernes korte levetid skal hele eksperimentet, fra indsamling af blod fra donorer til færdiggørelse af flowcytometri, udføres samme dag. Neutrofiler er meget følsomme over for temperaturændringer og kan aktiveres, når de udsættes for hurtige temperaturstigninger, såsom overgang fra 4 ° C til stuetemperatur eller fra stuetemperatur til 37 ° C. Baseret på vores tidligere erfaring forekommer fMLP-induceret neutrofil β2 integrinaktivering ikke, når celler opbevares på is eller ved 4 °C (data ikke vist). Før fiksering skal fuldblod og neutrofiler derfor opbevares ved stuetemperatur eller 20 °C (under isolationscentrifugeringstrinnet). Anbring ikke fuldblod og neutrofiler på is.

Farvning af mAb24 i negative kontroller skulle give meget lave resultater. Hvis der observeres et højt mAb24-farvningsniveau i et eksperiment, skal du kontrollere følgende: (1) om der var en signifikant temperaturændring under eksperimentet før fiksering; 2) om der var fMLP- eller endotoksinforurening i neutrofilsubstratet 3) om håndteringen af prøver var for aggressiv, f.eks. ved at generere bobler under pipettering og blanding.

Den nuværende protokol anvender mAb24 til at rapportere åbningen af β2 integrinhovedstykket. Teoretisk set kan KIM127, et monoklonalt antistof, der rapporterer udvidelsen af β2-integriner 34,35, anvendes sammen med mAb24 til omfattende vurdering af β2 integrinkonformation. Imidlertid er signal-støj-forholdet for KIM127-farvning (1,5 til 2 gange) ikke så gunstigt som mAb24 (5 til 10 gange), hvilket typisk ikke giver en tilfredsstillende Z'-faktor i 384-brønds pladeanalysen. I 96-brønds pladeanalysen kan prøver vaskes, før der udføres flowcytometri, hvilket reducerer opløselige antistofafledte baggrundssignaler. Derfor kan det KIM127-baserede assay udføres i 96-brønds pladeassayet, som har lavere gennemstrømning sammenlignet med 384-brønds pladeassay.

Da denne metode bruger fluorescensintensitet som aflæsning til vurdering af lægemidlers integrinhæmmende virkning, kan nogle fluorescerende lægemidler interferere med resultaterne. Derudover vil giftige lægemidler, der inducerer neutrofildød inden for 10 minutters stimuleringsperiode, også synes at rapportere integrinhæmning. Lægemidler, der hæmmer neutrofil degranulering, vil undertrykke den samlede β2 integrinekspression. Disse degranulationshæmmere vil også blive identificeret i vores screening. Derfor er sekundær screening med andre kontroller nødvendig for at bekræfte de hæmmende virkninger af hits. Sekundære skærmbilleder refereres som et middel til både at validere og bestemme virkningsmekanismen for hits. Ud over at gentage mAb24-testene vil den totale CD18-ekspression på celleoverfladen blive vurderet ved hjælp af et pan-anti-humant CD18-antistof. Niveauet af aktiveret β2-integrin, målt ved mAb24, normaliseres af det totale CD18-udtryk. Dette vil gøre det muligt for os at bestemme, om agentens virkningsmekanisme involverer antagonisering af integrinaktivering og / eller hæmning af ekspressionen af CD18 på celleoverfladen. Der bør også foretages en levedygtighedsanalyse på det sekundære skærmbillede for at udelukke eventuelle toksiske virkninger af hits.

Denne protokol har begrænsninger. For det første er mAb24 kun i stand til at detektere β2 I-lignende domæne i tilfælde, hvor integrinet er i en højaffinitetstilstand. Derfor kan den ikke identificere α/β I-lignende allosteriske antagonister såsom lifitegrast gennem faldende mAb24-binding. Lifitegrast inducerer mere mAb24-binding32 og viser en unormalt øget MFI-værdi med mAb24 (figur 4). For sådanne unormale værdier kan andre assays være nødvendige for at kontrollere, om disse hits er α/β I-lignende allosteriske antagonister som lifitegrast. For det andet er Z'-faktoren for dette assay suboptimal og kan potentielt forbedres ved brug af automatisk pipettering og omrøring. Desværre mangler vores laboratorium det nødvendige udstyr til at teste denne hypotese. Duplikering eller tredobbelt assays vil være nyttige til at identificere falske positive og negative, hvis Z'-faktoren ikke kan forbedres yderligere med ovenstående metoder. Desuden kan det være gavnligt at forlænge inkubationstiden for at identificere flere hits, som observeret med den kendte β2 integrinaktiveringshæmmer Nexinhib20, som kræver en times inkubation for at producere hæmmende virkninger. Denne undersøgelse fokuserede på at identificere hurtigtvirkende midler. Forskere bør bemærke, at de kan ændre inkubationstiden, så den passer til deres specifikke behov.

Så vidt vi ved, er dette den første screeningsmetode med høj kapacitet for β2 integrinantagonister. Denne fremgangsmåde kan bruges til at identificere små molekyleforbindelser, der binder direkte til β2-integriner og forhindre konformationelle ændringer, der fører til integrintilstande med mellemliggende/høj affinitet, svarende til antagonister uden "agonistiske" egenskaber, der for nylig er beskrevet for integrinerne αIIbβ3 og α4β126. Neutrofiler er kritiske i mange inflammatoriske sygdomme, såsom myokardieiskæmi-reperfusionsskade 36, sepsis37 og autoimmune sygdomme38,39. Små molekyler lægemidler kan tilbyde mere fleksibilitet i behandlingen af disse sygdomme sammenlignet med antistofbaserede lægemidler. Hits fra vores skærm kan give potentielle behandlinger for inflammatoriske sygdomme.

Den nuværende metode er en fluorescerende antistofbaseret skærm med høj kapacitet. Da aktiveringsrapporterende antistoffer også er tilgængelige for β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 og αL integriner47,48,49,50, kan denne metode udvides til at identificere antagonister for andre integriner. Et konformationsfølsomt antistof som HUTS-21, der binder til β1-hybriddomænet 51,52,53, er blevet brugt i en skærm med høj kapacitet til at identificere meget sene antigen-4 (VLA-4, integrin α4β1) allosteriske antagonister 54. Den nuværende screeningsmetode kan også modificeres og udvides til at finde lægemidler, der hæmmer eller fremmer ekspressionen af andre overfladereceptorer, såsom forbindelser, der øger cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR) overfladeekspression på cystisk fibrose (CF) celler. I CF fører flere mutationer til CFTR-fejlfoldning, hvilket resulterer i fraværende ekspression af CFTR på cellemembranen55. Småmolekylære lægemidler har vist sig at genoprette CFTR-ekspressionen56. For protokolændringer er det nødvendigt at øge inkubationstiden for lægemidler til flere timer for at tillade proteinekspressionsændringer at forekomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Evan Jellison og Li Zhu i flowcytometrikernen på UConn Health for deres hjælp med flowcytometri, Dr. Lynn Puddington i Institut for Immunologi ved UConn Health for hendes støtte til instrumenterne, Slawa Gajewska og Dr. Paul Appleton i den kliniske forskningskerne ved UConn Health for deres hjælp med at få blodprøver. Vi anerkender Dr. Christopher "Kit" Bonin og Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for deres hjælp med videnskabelig skrivning og redigering af dette manuskript. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, en karriereudviklingspris fra American Heart Association (18CDA34110426) og en opstartsfond fra UConn Health. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Immunologi og infektion udgave 204
En flowcytometribaseret teknik med høj gennemstrømning til screening af integrinhæmmende lægemidler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L.… More

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter