Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Высокопроизводительный метод скрининга интегрин-ингибирующих препаратов на основе проточной цитометрии

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/64401
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4,5, 3,4, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

Summary

Этот протокол описывает высокопроизводительный скрининговый метод на основе проточной цитометрии для выявления низкомолекулярных препаратов, которые ингибируют активацию β2-интегрина на нейтрофилах человека.

Abstract

Этот протокол направлен на создание метода идентификации низкомолекулярных антагонистов активации β2-интегрина с использованием антител, сообщающих о конформационных изменениях, и высокопроизводительной проточной цитометрии. Этот метод также может служить руководством для других высокопроизводительных методов скрининга на основе антител. β2-интегрины — это лейкоцит-специфические молекулы адгезии, которые имеют решающее значение в иммунных реакциях. Нейтрофилы полагаются на активацию интегрина для выхода из кровотока не только для борьбы с инфекциями, но и для участия во многих воспалительных заболеваниях. Контроль активации β2-интегрина представляет собой жизнеспособный подход к лечению воспалительных заболеваний, ассоциированных с нейтрофилами. В этом протоколе моноклональное антитело mAb24, которое специфически связывается с высокоаффинным головным мозгом β2-интегринов, используется для количественной оценки активации β2-интегрина на изолированных первичных нейтрофилах человека. N-формилметионил-лейцилфенилаланин (fMLP) используется в качестве стимула для активации нейтрофильных β2-интегринов. В данном исследовании был использован высокопроизводительный проточный цитометр, способный автоматически обрабатывать 384-луночные планшетные пробы. Влияние 320 химических веществ на ингибирование β2-интегрина оценивают в течение 3 ч. С помощью этого подхода можно идентифицировать молекулы, которые непосредственно нацелены на β2-интегрины или молекулы-мишени в сигнальном пути активации интегрина, инициируемого рецептором G-белка.

Introduction

Многие воспалительные заболевания характеризуются инфильтрацией нейтрофилов в месте отекаили травмы1. Чтобы проникнуть в эти ткани, нейтрофилы должны завершить каскад рекрутирования нейтрофилов, который включает остановку эндотелия, экстравазацию через стенку сосуда и рекрутирование в ткань2. Циркулирующие нейтрофилы нуждаются в активации β2-интегрина, чтобы завершить этот каскад, особенно для фазы ареста. Таким образом, интегрин-ингибирующие препараты, которые снижают адгезию, экстравазацию и рекрутирование нейтрофилов, могут эффективно лечить воспалительные заболевания 3,4.

β2-интегрины и раньше использовались для лечения воспалительных заболеваний. Для лечения псориаза5 типа было разработано моноклональное антитело Efalizumab, непосредственно нацеленное на интегрин αLβ2. Однако эфализумаб был отменен из-за его летального побочного эффекта - прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии, возникающей в результате реактивации вируса ЮК 6,7. Новые противовоспалительные препараты на основе интегрина должны учитывать сохранение противоинфекционных функций лейкоцитов для минимизации побочных эффектов. Побочные эффекты эфализумаба могут быть связаны с длительной циркуляцией моноклональных антител в кровотоке, которые могут подавлять иммунные функции в долгосрочной перспективе8. Недавнее исследование показывает, что эфализумаб опосредует сшивание αLβ2 и нежелательную интернализацию интегринов α4, обеспечивая альтернативное объяснениепобочных эффектов. Таким образом, короткоживущие низкомолекулярные антагонисты могут избежать этой проблемы.

Представлен высокопроизводительный метод скрининга низкомолекулярных антагонистов β2-интегрина с использованием нейтрофилов человека. Активация β2-интегрина требует конформационных изменений эктодомена интегрина, чтобы получить доступ к лиганду и увеличить его сродство к связыванию. В канонической модели выкидного ножа изогнуто-замкнутый эктодомен интегрина сначала расширяется до расширенно-замкнутой конформации, а затем открывает свой головной состав до полностью активированной расширенно-открытой конформации10,11,12,13. Существует также альтернативный путь, который начинается от согнутого-закрытого к согнутому-открытому и расширенному-открытому, в конечном итоге 14,15,16,17,18,19. Конформационно-специфическое антитело mAb24 связывается с эпитопом в β2-I-подобном домене человека, когда головной убор эктодомена открыт20,21,22,23.

Здесь mAb24-APC используется для определения того, активированы ли интегрины β2. Для активации нейтрофилов и интегрина в качестве стимула в этом протоколе используется N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), короткий хемотаксический пептид бактериального происхождения, который может активировать нейтрофилы β2 интегрины24. Когда fMLP связывается с Fpr1 на нейтрофилах, активируются нисходящие сигнальные каскады, включающие G-белки, фосфолипазу Cβ и фосфоинозитид-3-киназную γ. Эти сигнальные события в конечном итоге приводят к активации интегрина через сигнальный путь18,25. Помимо низкомолекулярных антагонистов, которые непосредственно связываются с β2-интегринами и предотвращают конформационные изменения активации интегрина26, с помощью этого метода также могут быть обнаружены соединения, которые могут ингибировать компоненты сигнального пути активации β2-интегрина изнутри-наружу. Автоматизированные проточные цитометры обеспечивают высокопроизводительный скрининг. Идентификация новых антагонистов может не только углубить наше понимание физиологии интегрина, но и дать трансляционное представление о противовоспалительной терапии на основе интегрина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Гепаринизированные образцы цельной крови были получены от обезличенных здоровых доноров после получения информированного согласия, одобренного Институциональным наблюдательным советом UConn Health в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Информированное согласие было получено от всех доноров. Критерии включения/исключения в данное исследование были тщательно разработаны для обеспечения пригодности участников и минимизации потенциальных рисков. К участию допускались участники в возрасте от 18 до 65 лет, любой этнической принадлежности, свободно владеющие английским языком и способные дать информированное согласие. Среди исключенных участников были те, кто не мог предоставить информированное согласие для себя, например, те, кому требуется законный представитель, лица моложе 18 лет или старше 65 лет, лица, находящиеся в заключении, и беременные женщины. Кроме того, участники должны были быть свободны от использования противовоспалительных препаратов и воспалительных заболеваний. Текущие инфекции или продолжающиеся хронические или острые воспалительные заболевания также были критериями исключения. Наконец, лица с текущим или недавним анамнезом инфекции COVID-19 не соответствовали критериям для участия в исследовании. Эти критерии были разработаны для обеспечения безопасности и пригодности участников, а также для минимизации потенциальных искажающих факторов, которые могут повлиять на результаты исследования.

1. Приготовление реагентов

  1. Нейтрофильная среда: Приготовьте нейтрофильную среду, добавив 2% сывороточного альбумина человека к RPMI-1640 без фенольного красного (см. таблицу материалов).
  2. Раствор fMLP: Приготовьте раствор fMLP, разбавив его в 100 раз из 10 мМ раствора для хранения диметилсульфоксида (DMSO) (см. Таблицу материалов) RPMI 1640 без фенольного красного, в результате чего получится 100 мкМ раствор fMLP.
  3. Раствор антител: Развести 120 мкл аллофикоцианина (APC)-конъюгированного моноклонального антитела mAb24 (mAb24-APC) (см. таблицу материалов), в котором сообщается о высокоаффинной конформации β2-интегрина, в 10 мл нейтрофильной среды, создав раствор mAb24-APC в концентрации 1,2 мкг/мл.
  4. Библиотека соединений: Разбавьте исходную библиотеку соединений концентрацией от 10 мМ до 1 мМ, добавив 5 мкл из библиотеки 10 мМ (см. таблицу материалов) к 45 мкл ДМСО в 384-луночных планшетах с помощью манипулятора жидкостью. Затем переносят 5 мкл на лунку из библиотеки соединений объемом 1 мМ на пустую 384-луночную пластину с помощью манипулятора жидкостью.
  5. Как показано на рисунке 1, четыре столбца (1, 2, 23, 24) содержали только ДМСО, но не содержали соединений, что служило положительным и отрицательным контролем в скрининге. Далее разбавляют каждую лунку, добавляя 45 мкл RPMI-1640 без фенольного красного, в результате чего конечная концентрация составляет 100 мкМ для всех соединений.

2. Выделение нейтрофилов из крови человека

  1. С помощью серологической пипетки осторожно нанесите 4 мл крови на 8 мл имеющейся в продаже среды с градиентом плотности (см. таблицу материалов) в центрифужную пробирку объемом 15 мл (Рисунок 2A).
  2. Центрифугируют кровь при 550 × г в течение 30-50 мин при 20 °С. Постепенно замедляйте ротор (коэффициент замедления 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное отделение нейтрофилов (полоса 2 на рисунке 2B) от эритроцитов может варьироваться у разных доноров. Для большинства доноров достаточно 30-минутного центрифугирования. Однако некоторым донорам может потребоваться дополнительное центрифугирование в течение 10-30 минут, если разделение не увенчалось успехом (рис. 2C).
  3. Осторожно удалите плазму (желтая жидкость сверху) и мононуклеарные клетки (верхняя мутная полоса; PBMC на рисунке 2B) с помощью пипетки объемом 1 мл.
  4. Соберите нейтрофилы из нижней мутной полосы (полоса нейтрофилов на рисунке 2B) и примерно на 3-4 мл ниже прозрачной жидкости в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Аккуратно перемешайте суспензию нейтрофилов, перевернув ее 2-3 раза.
  5. Центрифугу суспензии при 400 × г в течение 10 мин при 20 °С, а затем осторожно удаляют надосадочную жидкость путем сцеживания.
  6. Осторожно ресуспендируйте гранулу с 5 мл PBS и центрифугируйте ее при 300 × г в течение 5 минут при 20 °C.
  7. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и осторожно удалите остатки надосадочной жидкости вокруг устья трубки и на стенках трубки с помощью вакуумного отсасывания. Ресуспендировать гранулу в 1 мл нейтрофильной среды.
  8. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Как правило, от 1 до 4 × 107 нейтрофилов получали из 8 мл крови человека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В суспензии нейтрофилов может быть загрязнение эритроцитами. Эритроциты не оказывают существенного влияния на большинство анализов и могут препятствовать активации/праймингу нейтрофилов27. Эритроциты необходимо лизировать перед подсчетом, чтобы получить точную концентрацию нейтрофилов. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии к 891 мкл деионизированной воды в течение 10-30 с для лизиса эритроцитов, затем добавьте 99 мкл 10× PBS, чтобы сбалансировать осмотическое давление, предотвращая лизис нейтрофилов.
  9. Отрегулируйте плотность клеток до 6,25 × 10,5 клеток/мл, добавив нейтрофильную среду.

3. Подготовка 384-луночной пластины

  1. В центрифужной пробирке объемом 1,5 мл соедините 1 мл раствора антител (1,2 мкг/мл mAb24-APC) с 0,2 мл нейтрофильной среды для получения раствора mAb24-APC объемом 1 мкг/мл. Затем добавьте 25 мкл этой смеси к отрицательным контрольным лункам в 384-луночной планшете (синие лунки на рисунке 1).
  2. В центрифужной пробирке объемом 15 мл смешают 9 мл раствора антител с 21,6 мкл раствора fMLP (100 мкМ) и 1,7784 мл среды нейтрофилов для получения раствора, содержащего 1 мкг/мл mAb24-APC и 200 нМ fMLP. Затем добавьте 25 мкл этой смеси к положительным контрольным и испытательным лункам в 384-луночном планшете (красная и синяя лунки на рисунке 1).
  3. Перенесите 5 мкл 100 мкМ растворов соединений с библиотечной планшета на 384-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки.
  4. Центрифугируют жидкость в течение 1 мин при температуре 500 × г при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для центрифугирования плит требуется ротор с поворотным ковшом и ковши с пластинами.

4. Обработка клеток

  1. Добавьте 20 мкл суспензии нейтрофилов в каждую лунку с помощью 16-канальной пипетки (диапазон 5-50 мкл, для каждой колонки 384-луночного планшета). Аккуратно перемешайте 5–10 раз с помощью пипетки, соблюдая постоянный интервал времени между каждым пипетированием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные концентрации в лунках следующие: нейтрофилы 2,5 × 10,5 кл/мл (все лунки); mAb24-APC 0,5 мкг/мл (все лунки); fMLP 100 нМ (положительные контрольные и испытательные скважины); соединения 10 мкМ (испытательные лунки).
  2. Инкубируйте планшет в шейкере при 300 об/мин, при комнатной температуре (RT), в течение 10 мин.
  3. Зафиксируйте ячейки, добавив 3 мкл 16% параформальдегида (PFA) в каждую лунку с помощью 16-канальной пипетки (конечная концентрация PFA ~0,91%). Затем инкубируйте на льду в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется поддерживать постоянный интервал времени между различными колонками при добавлении нейтрофилов и PFA. Это гарантирует, что нейтрофилы в каждой лунке будут иметь одинаковое время инкубации с fMLP и mAb24-APC.

5. Проточная цитометрия

  1. Включите проточный цитометр (см. Таблицу материалов) и убедитесь, что компьютер, подключенный к прибору, также включен.
  2. Убедитесь, что контейнер для жидкости в оболочке заполнен, а контейнер для отходов пуст и правильно подключен к инструменту.
  3. Загрузите 384-луночный планшет в загрузчик образцов проточного цитометра. Убедитесь, что углубление A1 пластины совмещено с меткой A1 на погрузчике.
  4. Откройте программу и создайте новый эксперимент. Выберите 384 скважины и выберите нужные флуорофоры. Затем нажмите « Настройка пластины», перетащите ее, чтобы выбрать все лунки, а затем нажмите « Образец». Включите переключатель «Высокая пропускная способность» и выберите « Высокая » под панелью «Скорость».
    1. В поле громкости введите 50. Выберите образцы в нечетных столбцах, а затем активируйте переключатель «Перемешивание». Наконец, назовите образцы на правой панели.
  5. Нажмите на Участок и ворота. Затем нажмите кнопку «Применить » (две стрелки на зеленом круге), а затем нажмите кнопку воспроизведения (в форме треугольника). Подождите несколько секунд, чтобы понаблюдать за некоторыми ячейками из первой лунки, а затем нажмите на кнопку паузы .
    1. Отрегулируйте напряжения FSC и SSC, чтобы обеспечить надлежащую визуализацию ячеек на графике. Нажмите « Сбор», а затем нажмите кнопку воспроизведения (треугольная форма), чтобы начать анализ.
  6. Проточный цитометр последовательно отбирает ~50 мкл 1000-3000 нейтрофилов из каждой лунки. Для завершения работы всей 384-луночной плиты потребуется примерно 3 часа.
  7. После завершения всех примеров экспортируйте файлы .fcs для следующего шага.

6. Анализ данных

  1. Откройте программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии (см. Таблицу материалов). Выберите и перетащите папку, содержащую все файлы .fcs, в окно программного обеспечения, затем отпустите, чтобы импортировать данные в программное обеспечение.
  2. Дважды щелкните по одному образцу, затворите одиночные нейтрофилы на основе FSC и SSC28,29,30 во всплывающем окне, как показано на рисунке 3. Выберите строки с защитой и перетащите их в папку, а затем отпустите, чтобы применить стробирование ко всем образцам в этой папке.
  3. Рассчитайте и экспортируйте медианную интенсивность флуоресценции (MFI) нейтрофилов из каждой лунки с помощью функции редактора таблиц программного обеспечения. Нажмите « Добавить столбец » на вкладке «Редактировать ». Выберите Медиана на вкладке Статистика , выберите нейтрофилы закрытой популяции и выберите APC в качестве параметра. Нажмите на кнопку ОК .
  4. Вернитесь на вкладку «Редактор таблицы», выберите «Все выборки » во вкладке «Группа» и нажмите кнопку «Создать таблицу ». Появится новое окно, отображающее созданную таблицу. Сохраните его в виде текста, CSV или файла Excel.
  5. Откройте экспортированную таблицу, рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение МФО АСУ для положительной и отрицательной контрольных выборок (рис. 4).
  6. Рассчитайте Z'-фактор (Z') пластины, используя уравнение:
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
    где σ p и σ n — стандартные отклонения положительного и отрицательного контроля соответственно, а μp и μn — средние значения положительного и отрицательного контроля, соответственно31.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Z'-фактор указывает на разделение положительного и отрицательного распределений управления. Z', равное 0, означает отсутствие разделения, в то время как Z', равное 0,5, указывает на равное разделение. Как упоминалось в предыдущем исследовании31, Z' > 0,5 указывает на отличный анализ для скрининга соединений. Z' в диапазоне от 0,5 до 0 является приемлемым, но он может выявить только сильные попадания в анализ, что потребует дальнейшей проверки во вторичных анализах.
  7. Рассматривайте соединения как «попадания» для скрининга, когда МФО АПК нейтрофилов, обработанных соединением, более чем в три раза превышает стандартное отклонение положительного контрольного МФИ, вычитаемого из положительного контрольного МФИ (P = 0,0013, представлено пунктирной линией на рисунке 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Данные репрезентативного скрининга 384-луночных планшетов (рис. 4) показали, что отрицательный контроль имел MFI mAb24-APC 3236 ± 110, в то время как положительный контроль имел MFI mAb24-APC 7588 ± 858. Z'-фактор для этой пластины составляет приблизительно 0,33, что находится в допустимом диапазоне31. Тем не менее, Z' требует дополнительной валидации во вторичных анализах.

Чтобы нормализовать данные, все значения были масштабированы таким образом, чтобы присвоить максимальное значение 1 положительному среднему и минимальное значение 0 отрицательному среднему. Z'-фактор будет проходить более строгую валидацию во вторичных анализах. Пороговое значение для этой пластины установлено на уровне 0,41, что означает, что образцы с относительным MFI ниже 0,41 будут рассматриваться как удары, ингибирующие fMLP-индуцированную активацию β2-интегрина в нейтрофилах человека. Попаданий с этой пластины не выявлено.

Для подтверждения эффективности протокола использовали Nexinhib20, который ингибирует активацию β2-интегрина антагонизирующей функцией Rac-1, и лифитеграст, который антагонизирует интегрин αLβ2 непосредственно32,33. Тем не менее, время инкубации было скорректировано до одного часа для Nexinhib20 и получаса для лифитеграста. Полученные данные этих экспериментов были нормализованы с помощью того же метода масштабирования, что и выше. Затем эти данные были объединены с результатами, полученными на планшетах, и проанализированы в совокупности (рис. 4).

Figure 1
Иллюстрация 1: Схема расположения пластин для комплексного просеивания. Принципиальная схема, иллюстрирующая расположение просеивающих соединений и элементов управления в 384-луночном планшете. Отрицательные контрольные скважины изображены синим цветом (столбцы 1 и 23), а положительные – красным (столбцы 2 и 24). Испытательные скважины представлены бежевым цветом (графы с 3 по 22). Стрелками указана последовательность считывания таблички. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Разделение нейтрофилов с использованием среды градиента плотности. Репрезентативные фотографии, демонстрирующие успешное и неудачное разделение нейтрофилов с использованием градиентной среды плотности. (А) Первоначально 4 мл крови наносится на 8 мл среды с градиентом плотности. (Б) После центрифугирования должны быть видны две мутные полосы: верхняя полоса, содержащая в основном мононуклеарные клетки периферической крови (МПКМ), и нижняя полоса, содержащая в основном нейтрофилы с некоторым количеством эритроцитов (эритроцитов). Большинство эритроцитов находятся на дне. (C) Неудачное разделение, при котором эритроциты не гранулируются и полоса нейтрофилов не наблюдается. Для отделения нейтрофильной ленты потребуется дополнительное центрифугирование (10-30 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Стробирование нейтрофилов с использованием графиков FSC/SSC. Репрезентативные графики прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC), иллюстрирующие стратегию стробирования для идентификации нейтрофилов. (A) Нейтрофилы стробируются на основе площади прямого рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния (SSC-A), регистрируемого проточным цитометром. (B) Одиночные ячейки дополнительно стробируются на основе ширины (FSC-W) и высоты (FSC-H) прямого рассеяния, и (C) ширины (SSC-W) и высоты (SSC-H) бокового рассеяния. Цветовая шкала представляет плотность клеток, переходя от красного к желтому, зеленому и синему по мере уменьшения плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Результаты скрининга в репрезентативной 384-луночной планшете. Результаты скрининга получены с помощью репрезентативной 384-луночной планшета, демонстрирующей Z'-фактор 0,3. Отрицательный и положительный контроль обозначаются синими и красными точками соответственно. Испытуемые образцы, обработанные различными составами, представлены в виде бежевых точек. Пунктирная линия представляет собой отсечку средней интенсивности флуоресценции (MFI) для идентификации попаданий. Ни одно из исследованных соединений не было идентифицировано как антагонисты β2-интегрина, так как все испытуемые соединения показали значения MFI выше линии отсечения. Результаты независимых экспериментов по тестированию известных антагонистов β2-интегрина с различным временем инкубации (Нексинингиб20 в течение 1 ч, лифитеграст в течение получаса) объединены для представления на этом рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Начало и окончание стимуляции и окрашивания нейтрофилов определяется добавлением нейтрофилов и фиксирующего ПФА. Поэтому очень важно обеспечить одинаковый интервал времени между пипетированием нейтрофилов или PFA в каждую колонку. Это гарантирует, что время стимуляции и окрашивания нейтрофилов из каждой лунки остается постоянным. Из-за короткого срока жизни нейтрофилов весь эксперимент, от забора крови у доноров до завершения проточной цитометрии, должен проводиться в один день. Нейтрофилы очень чувствительны к изменениям температуры и могут активироваться при воздействии быстрого повышения температуры, например, при переходе от 4 °C к комнатной температуре или от комнатной температуры к 37 °C. Кроме того, основываясь на нашем предыдущем опыте, fMLP-индуцированная активация интегрина нейтрофилов β2 не происходит при хранении клеток на льду или при температуре 4 °C (данные не показаны). Поэтому перед фиксацией цельную кровь и нейтрофилы следует держать при комнатной температуре или 20 °С (на этапе выделения центрифугирования). Не кладите цельную кровь и нейтрофилы на лед.

Окрашивание mAb24 в отрицательных контрольных группах должно давать очень низкие результаты. Если в эксперименте наблюдается высокий уровень окрашивания mAb24, проверьте следующее: (1) было ли значительное изменение температуры во время эксперимента перед фиксацией; (2) наличие контаминации fMLP или эндотоксинами в среде нейтрофилов; (3) было ли обращение с образцами слишком агрессивным, например, образование пузырьков во время пипетирования и смешивания.

Текущий протокол использует mAb24 для сообщения об открытии интегрин-головного устройства β2. Теоретически моноклональное антитело KIM127, сообщающее о расширении β2-интегринов 34,35, может быть использовано в сочетании с mAb24 для комплексной оценки конформации β2-интегрина. Однако отношение сигнал/шум при окрашивании KIM127 (от 1,5 до 2 раз) не столь благоприятно, как у mAb24 (от 5 до 10 раз), что, как правило, не обеспечивает удовлетворительного Z'-фактора при анализе на 384-луночном планшете. При анализе на 96-луночных планшетах образцы могут быть промыты перед выполнением проточной цитометрии, что снижает количество растворимых фоновых сигналов, полученных из антител. Таким образом, анализ на основе KIM127 может быть проведен на 96-луночном планшетном анализе, который имеет меньшую пропускную способность по сравнению с 384-луночным планшетным анализом.

Поскольку этот метод использует интенсивность флуоресценции в качестве считывания для оценки интегринового ингибирующего действия лекарств, некоторые флуоресцентные препараты могут влиять на результаты. Кроме того, токсичные препараты, которые вызывают гибель нейтрофилов в течение 10-минутного периода стимуляции, также сообщают об ингибировании интегрина. Препараты, ингибирующие дегрануляцию нейтрофилов, подавляют общую экспрессию β2-интегрина. Эти ингибиторы дегрануляции также будут выявлены в ходе нашего скрининга. Поэтому необходим вторичный скрининг с другими контрольными группами для подтверждения ингибирующих эффектов попаданий. Вторичные экраны используются как средство проверки и определения механизма действия обращений. В дополнение к повторению тестов mAb24 будет оцениваться общая экспрессия CD18 на поверхности клетки с помощью пан-антител к CD18. Уровень активированного β2-интегрина, измеренный по мAb24, будет нормализован по общей экспрессии CD18. Это позволит нам определить, включает ли механизм действия препарата антагонизацию активации интегрина и/или ингибирование экспрессии CD18 на поверхности клетки. Анализ жизнеспособности также должен быть проведен на вторичном скрининге, чтобы исключить любые токсические эффекты ударов.

Этот протокол имеет ограничения. Во-первых, mAb24 способен обнаруживать β2 I-подобный домен только в тех случаях, когда интегрин находится в высокоаффинном состоянии. Таким образом, он не может идентифицировать α/β I-подобных аллостерических антагонистов, таких как лифитеграст, путем снижения связывания mAb24. Лифитеграст индуцирует больше связывания мАт2432 и показывает аномально повышенное значение MFI с мАт24 (рис. 4). Для таких аномальных значений могут потребоваться другие анализы, чтобы проверить, являются ли эти удары α/β I-подобными аллостерическими антагонистами, такими как лифитеграст. Во-вторых, Z'-фактор для этого анализа является неоптимальным и потенциально может быть улучшен за счет использования автоматического пипетирования и перемешивания. К сожалению, в нашей лаборатории отсутствует необходимое оборудование для проверки этой гипотезы. Дублирование или утроение анализов будет полезно для выявления ложноположительных и отрицательных результатов в случае, если Z'-фактор не может быть дополнительно улучшен с помощью описанных выше методов. Кроме того, может быть полезно увеличить инкубационный период для выявления большего количества попаданий, как это наблюдается в случае с известным ингибитором активации интегрина β2 Nexinhib20, которому требуется час инкубации для получения ингибирующего эффекта. Это исследование было сосредоточено на выявлении быстродействующих агентов. Исследователи должны отметить, что они могут изменять время инкубации в соответствии со своими конкретными потребностями.

Насколько нам известно, это первый высокопроизводительный метод скрининга антагонистов β2-интегрина. Этот подход может быть использован для идентификации низкомолекулярных соединений, которые непосредственно связываются с β2-интегринами и предотвращают конформационные изменения, приводящие к промежуточным/высокоаффинным состояниям интегринов, подобно антагонистам без «агонистических» свойств, недавно описанным для интегринов αIIbβ3 и α4β126. Нейтрофилы имеют решающее значение при многих воспалительных заболеваниях, таких как ишемически-реперфузионное повреждение миокарда 36, сепсис37 и аутоиммунные заболевания38,39. Низкомолекулярные препараты могут обеспечить большую гибкость в лечении этих заболеваний по сравнению с препаратами на основе антител. Просмотры с нашего экрана могут обеспечить потенциальное лечение воспалительных заболеваний.

В настоящее время метод представляет собой высокопроизводительный скрининг на основе флуоресцентных антител. Поскольку активационные репортерные антитела также доступны для β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 и αL интегринов47,48,49,50, этот метод может быть расширен до выявления антагонистов для других интегринов. Конформационно-чувствительное антитело, такое как HUTS-21, которое связывается с гибридным доменом β1 51,52,53, было использовано в высокопроизводительном скрининге для идентификации аллостерических антагонистов очень позднего антигена-4 (VLA-4, интегрин α4β1) 54. Существующий метод скрининга также может быть модифицирован и расширен для поиска препаратов, которые ингибируют или стимулируют экспрессию других поверхностных рецепторов, таких как соединения, которые увеличивают поверхностную экспрессию трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR) на клетках муковисцидоза (CF). При муковисцидозе множественные мутации приводят к неправильному сворачиванию CFTR, что приводит к отсутствию экспрессии CFTR на клеточной мембране55. Было показано, что низкомолекулярные препараты восстанавливают экспрессию CFTR56. Для модификации протокола необходимо увеличить время инкубации препаратов до нескольких часов, чтобы дать возможность произойти изменениям экспрессии белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Эвана Джеллисона (Evan Jellison) и г-жу Ли Чжу (Li Zhu) из центра проточной цитометрии в UConn Health за помощь в проведении проточной цитометрии, д-ра Линн Паддингтон (Lynn Puddington) из отделения иммунологии UConn Health за поддержку инструментов, г-жу Славу Гаевскую и д-ра Пола Эпплтона (Paul Appleton) из центра клинических исследований UConn Health за их помощь в получении образцов крови. Выражаем благодарность д-ру Кристоферу «Киту» Бонину и д-ру Женеве Харгис из Медицинской школы Калифорнийского университета в Конне за помощь в написании и редактировании этой рукописи. Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения, Национального института сердца, легких и крови (R01HL145454), Национального института общих медицинских наук (P20GM121176), США, премией за развитие карьеры от Американской кардиологической ассоциации (18CDA34110426) и фондом стартапов от UConn Health. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Иммунология и инфекционные заболевания выпуск 204
Высокопроизводительный метод скрининга интегрин-ингибирующих препаратов на основе проточной цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L.… More

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter