Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En flowcytometribasert høykapasitetsteknikk for screening av integrinhemmende legemidler

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/64401
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4,5, 3,4, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

Summary

Denne protokollen beskriver en flowcytometribasert, høy gjennomstrømningsscreeningsmetode for å identifisere småmolekylære legemidler som hemmer β2-integrinaktivering på humane nøytrofiler.

Abstract

Denne protokollen tar sikte på å etablere en metode for å identifisere små molekylære antagonister av β2-integrinaktivering, ved bruk av konformasjonsendringsrapporterende antistoffer og høy gjennomstrømningscytometri. Metoden kan også tjene som en veiledning for andre antistoffbaserte screeningsmetoder med høy gjennomstrømning. β2-integriner er leukocyttspesifikke adhesjonsmolekyler som er avgjørende for immunresponser. Neutrofiler stole på integrinaktivering for å gå ut av blodet, ikke bare for å bekjempe infeksjoner, men også for å være involvert i flere inflammatoriske sykdommer. Kontroll av β2-integrinaktivering gir en levedyktig tilnærming for behandling av nøytrofilassosierte inflammatoriske sykdommer. I denne protokollen brukes et monoklonalt antistoff, mAb24, som spesifikt binder seg til hodestykket med høy affinitet av β2-integriner, for å kvantifisere β2-integrinaktivering på isolerte primære humane nøytrofiler. N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP) brukes som et stimulus for å aktivere nøytrofile β2-integriner. Et cytometer med høy gjennomstrømningsstrøm som er i stand til automatisk å kjøre 384-brønns plateprøver ble brukt i denne studien. Effektene av 320 kjemikalier på β2 integrinhemming vurderes innen 3 timer. Molekyler som direkte retter seg mot β2-integriner eller målmolekyler i G-proteinkoblet reseptorinitiert integrin innvendig ut aktiveringssignalvei, kan identifiseres gjennom denne tilnærmingen.

Introduction

Mange inflammatoriske sykdommer er preget av infiltrering av nøytrofiler på stedet for hevelse eller skade1. For å infiltrere disse vevene, må nøytrofiler fullføre nøytrofil rekrutteringskaskade, som innebærer arrestasjon til endotelet, ekstravasasjon over karveggen og rekruttering til vevet2. Sirkulerende nøytrofiler trenger β2 integrinaktivering for å fullføre denne kaskaden, spesielt for arrestasjonsfasen. Dermed kan integrinhemmende legemidler som reduserer nøytrofil adhesjon, ekstravasasjon og rekruttering effektivt behandle inflammatoriske sykdommer 3,4.

β2 integriner har vært målrettet for inflammatoriske sykdommer før. Efalizumab, et monoklonalt antistoff direkte rettet mot integrin αLβ2, ble utviklet for å behandle psoriasis5. Efalizumab ble imidlertid seponert på grunn av den dødelige bivirkningen - progredierende multifokal leukoencefalopati som følge av reaktivering av JC-virus 6,7. Nye antiinflammatoriske integrinbaserte terapier bør vurdere å opprettholde antiinfeksjonsfunksjonene til leukocytter for å minimere bivirkninger. Bivirkningene av efalizumab kan skyldes langvarig sirkulasjon av monoklonale antistoffer i blodet, noe som kan hemme immunfunksjoner pålang sikt. En nylig studie viser at efalizumab medierer αLβ2-kryssbinding og uønsket internalisering av α4-integriner, noe som gir en alternativ forklaring på bivirkningene9. Dermed kan kortvarige, småmolekylære antagonister unngå dette problemet.

En høy gjennomstrømningsmetode for å skjerme småmolekylære β2-integrinantagonister ved bruk av humane nøytrofiler presenteres her. β2 integrinaktivering krever konformasjonsendringer av integrinektodomenet for å få tilgang til og øke bindingsaffiniteten til liganden. I den kanoniske springbladmodellen strekker det bøyde-lukkede integrinektodomenet seg først til en utvidet-lukket konformasjon og åpner deretter hodestykket for en fullt aktivert utvidet-åpen konformasjon10,11,12,13. Det finnes også en alternativ trasé som starter fra bøyd-lukket til bøyd-åpen og forlenget-åpen, til slutt 14,15,16,17,18,19. Det konformasjonsspesifikke antistoffet mAb24 binder seg til en epitop i det humane β2-I-lignende domenet når hodestykket til ektodomenet er åpent20,21,22,23.

Her brukes mAb24-APC for å bestemme om β2-integrinene er aktivert. For å aktivere nøytrofiler og integrin, brukes N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP), et bakterielt avledet kort kjemotaktisk peptid som kan aktivere nøytrofile β2-integriner24, som et stimulus i denne protokollen. Når fMLP binder seg til Fpr1 på nøytrofiler, aktiveres nedstrøms signalkaskader som involverer G-proteiner, fosfolipase Cβ og fosfoinositid 3-kinase γ. Disse signalhendelsene resulterer til slutt i integrinaktivering via signalveieninnsiden ut 18,25. Foruten små molekylantagonister som direkte binder seg til β2-integriner og forhindrer konformasjonsendringer av integrinaktivering26, vil forbindelser som kan hemme komponenter i β2-integrinet innvendig ut aktiveringssignalvei også bli detektert med denne metoden. Automatiserte flowcytometre muliggjør screening med høy gjennomstrømning. Identifisering av nye antagonister kan ikke bare utdype vår forståelse av integrinfysiologi, men også gi translasjonell innsikt i integrinbasert antiinflammasjonsterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hepariniserte fullblodsprøver ble oppnådd fra avidentifiserte friske menneskelige givere etter å ha innhentet informert samtykke, som godkjent av Institutional Review Board of UConn Health, etter prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Informert samtykke ble innhentet fra alle donorer. Inklusjons-/eksklusjonskriteriene for denne studien ble nøye utviklet for å sikre deltakernes egnethet og for å minimere potensiell risiko. Kvalifiserte deltakere var i alderen mellom 18 og 65 år, uansett etnisitet, flytende i engelsk og i stand til å gi informert samtykke. Ekskluderte deltakere inkluderte de som ikke kunne gi informert samtykke for seg selv, for eksempel de som krever en lovlig autorisert representant, personer under 18 eller over 65 år, fengslede personer og gravide kvinner. I tillegg måtte deltakerne være fri for antiinflammatorisk medisinering og inflammatoriske tilstander. Aktuelle infeksjoner eller pågående kroniske eller akutte inflammatoriske tilstander var også eksklusjonskriterier. Endelig var personer med en nåværende eller nylig historie med COVID-19-infeksjon ikke kvalifisert for studien. Disse kriteriene ble utformet for å sikre deltakernes sikkerhet og egnethet samtidig som potensielle forstyrrende faktorer som kan påvirke studieresultatene, minimeres.

1. Fremstilling av reagenser

  1. Nøytrofilt medium: Klargjør det nøytrofile mediet ved å tilsette 2 % humant serumalbumin til RPMI-1640 uten fenolrødt (se materialfortegnelse).
  2. fMLP-oppløsning: Klargjør fMLP-oppløsningen ved å fortynne den 100 ganger fra 10 mM fMLP dimetylsulfoksid (DMSO) lagringsløsning (se materialfortegnelse) med RPMI 1640 uten fenolrødt, noe som resulterer i en 100 μM fMLP-løsning.
  3. Antistoffløsning: Fortynn 120 μL allophycocyanin (APC)-konjugert monoklonalt antistoff mAb24 (mAb24-APC) (se materialtabell), som rapporterer høy affinitetskonformasjon av β2-integrin, i 10 ml nøytrofilmedium, og skaper en 1,2 μg / ml mAb24-APC-løsning.
  4. Sammensatt bibliotek: Fortynn det opprinnelige sammensatte biblioteket med en konsentrasjon på 10 mM til 1 mM ved å tilsette 5 μL av 10 mM-biblioteket (se materialfortegnelse) til 45 μL DMSO i 384-brønnplater ved hjelp av væskehåndtereren. Deretter overføres 5 μL per brønn i 1 mM sammensatt bibliotek til en tom 384-brønnplate ved hjelp av væskehåndtereren.
  5. Som illustrert i figur 1 inneholdt fire kolonner ( 1, 2, 23, 24) kun DMSO, men ingen forbindelser, noe som fungerte som positive og negative kontroller i screeningen. Ytterligere fortynn hver brønn ved å tilsette 45 μL RPMI-1640 uten fenolrødt, noe som resulterer i en endelig konsentrasjon på 100 μM for alle forbindelser.

2. Nøytrofil isolasjon fra humant blod

  1. Bruk en serologisk pipette til å legge 4 ml blod forsiktig over 8 ml av et kommersielt tilgjengelig tetthetsgradientmedium (se materialtabellen) i et 15 ml sentrifugerør (figur 2A).
  2. Sentrifuger blodet ved 550 × g i 30-50 minutter ved 20 °C. Senk rotoren gradvis (retardasjonsfaktor på 1).
    MERK: Den vellykkede separasjonen av nøytrofiler (bånd 2 i figur 2B) fra røde blodlegemer kan variere mellom givere. For de fleste donorer er en sentrifugering på 30 minutter tilstrekkelig. For noen donorer kan det imidlertid være nødvendig med ytterligere 10-30 min sentrifugering hvis separasjonen ikke lykkes (figur 2C).
  3. Fjern forsiktig plasmaet (den gule væsken på toppen) og mononukleære celler (det øvre overskyede båndet; PBMC-båndet i figur 2B) ved bruk av en 1 ml pipette.
  4. Samle nøytrofiler fra det nedre uklare båndet (nøytrofilbåndet i figur 2B) og ca. 3-4 ml under den klare væsken i et 15 ml sentrifugerør inneholdende 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Bland forsiktig den nøytrofile suspensjonen ved å snu den 2-3 ganger.
  5. Sentrifuger suspensjonen ved 400 × g i 10 minutter ved 20 °C, og fjern deretter supernatanten forsiktig ved å dekantere.
  6. Pelleten blandes forsiktig med 5 ml PBS og sentrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 20 °C.
  7. Fjern supernatanten ved å dekantere, og fjern forsiktig eventuell gjenværende supernatant rundt slangemunnen og på slangeveggen ved hjelp av vakuumsuging. Bryt pelleten i 1 ml nøytrofilt medium.
  8. Telle cellenumrene ved hjelp av et hemocytometer. Vanligvis ble 1 til 4 × 107 nøytrofiler oppnådd fra 8 ml humant blod.
    MERK: Det kan være forurensning av røde blodlegemer i den nøytrofile suspensjonen. Røde blodlegemer påvirker ikke de fleste analyser signifikant og kan forhindre nøytrofil aktivering/klargjøring27. Røde blodlegemer må lyseres før telling for å oppnå en nøyaktig nøytrofil konsentrasjon. Tilsett 10 μL av cellesuspensjonen til 891 μL avionisert vann i 10-30 s for å lyse de røde blodcellene, tilsett deretter 99 μL av 10× PBS for å balansere det osmotiske trykket, og forhindre lysis av nøytrofilene.
  9. Juster celletettheten til 6,25 × 105 celler/ml ved å legge til nøytrofilt medium.

3. Klargjøring av 384-brønnplaten

  1. I et 1,5 ml sentrifugerør kombinerer du 1 ml av antistoffoppløsningen (1,2 μg / ml mAb24-APC) med 0,2 ml nøytrofilmedium for å lage en 1 μg / ml mAb24-APC-løsning. Deretter tilsettes 25 μL av denne blandingen til de negative kontrollbrønnene i en 384-brønnplate (de blå brønnene i figur 1).
  2. I et 15 ml sentrifugerør blandes 9 ml av antistoffoppløsningen med 21,6 μL av fMLP-oppløsningen (100 μM) og 1,7784 ml nøytrofilmedium for å lage en oppløsning som inneholder 1 μg / ml mAb24-APC og 200 nM fMLP. Deretter tilsettes 25 μL av denne blandingen til de positive kontroll- og testbrønnene i en 384-brønnplate (de røde og blå brønnene i figur 1).
  3. Overfør 5 μL av 100 μM-forbindelsesløsningene fra den sammensatte bibliotekplaten til 384-brønnplaten ved hjelp av en flerkanalspipettte.
  4. Sentrifuger væsken i 1 min ved 500 × g, ved romtemperatur.
    MERK: For sentrifugerplater er det nødvendig med en svingbøtterotor og platebøtter.

4. Behandling av celler

  1. Tilsett 20 μL av den nøytrofile suspensjonen til hver brønn ved hjelp av en 16-kanals pipette (5-50 μL-område, for hver kolonne av 384-brønnplaten). Bland forsiktig 5-10 ganger med pipetten, og oppretthold et konsistent tidsintervall mellom hver pipettering.
    MERK: De endelige konsentrasjonene i brønnene er som følger: nøytrofiler 2,5 × 105 celler/ml (alle brønner); mAb24-APC 0,5 μg/ml (alle brønner); fMLP 100 nM (positive kontroll- og testbrønner); forbindelser 10 μM (testbrønner).
  2. Inkuber platen på en shaker ved 300 o / min, ved romtemperatur (RT), i 10 minutter.
  3. Fikser cellene ved å tilsette 3 μL 16% paraformaldehyd (PFA) til hver brønn ved hjelp av en 16-kanals pipette (endelig PFA-konsentrasjon ~0,91%). Deretter ruger du på is i 10 min.
    MERK: Det anbefales å opprettholde et konsistent tidsintervall mellom forskjellige kolonner når du legger til nøytrofiler og PFA. Dette sikrer at nøytrofile i hver brønn har samme inkubasjonstid med fMLP og mAb24-APC.

5. Flowcytometri

  1. Slå på flowcytometeret (se Materialfortegnelse), og kontroller at datamaskinen som er koblet til instrumentet, også er slått på.
  2. Forsikre deg om at kappevæskebeholderen er fylt, og avfallsbeholderen er tom og riktig koblet til instrumentet.
  3. Legg 384-brønnsplaten på prøvelasteren til strømningscytometeret. Forsikre deg om at A1-brønnen på platen er på linje med A1-merket på lasteren.
  4. Åpne programvaren og opprett et nytt eksperiment. Velg 384 godt og velg de ønskede fluoroforene. Klikk deretter på Plateoppsett, dra for å velge alle brønner, og klikk deretter på Prøve. Slå på bryteren "Høy gjennomstrømning", og velg Høy under hastighetspanelet.
    1. I volumboksen skriver du inn 50. Velg prøver i oddetallskolonner, og aktiver deretter "Agitation" -bryteren. Til slutt, navngi prøvene i høyre panel.
  5. Klikk på Plot og gate. Klikk deretter på Bruk-knappen (to piler på en grønn sirkel), og klikk deretter på avspillingsknappen (trekantform). Vent noen sekunder for å observere noen celler fra den første brønnen, og klikk deretter på pauseknappen .
    1. Juster FSC- og SSC-spenningene for å sikre riktig visualisering av celler på plottet. Klikk på Oppkjøp, og klikk deretter på avspillingsknappen (trekantform) for å starte analysen.
  6. Strømningscytometeret vil sekvensielt prøve ~ 50 μL av 1000-3000 nøytrofiler fra hver brønn. Det vil ta omtrent 3 timer å fullføre hele 384-brønnplaten.
  7. Når du har fullført alle eksemplene, eksporterer du .fcs-filene for neste trinn.

6. Dataanalyse

  1. Åpne programvaren for flowcytometri-dataanalyse (se Materialliste). Velg og dra mappen som inneholder alle .fcs-filer inn i programvarevinduet, og slipp deretter for å importere dataene til programvaren.
  2. Dobbeltklikk på en prøve, gate enkelt nøytrofile basert på FSC og SSC28,29,30 i det dukket opp vinduet, som vist i figur 3. Velg de inngjerdede radene og dra dem til mappen, og slipp deretter for å bruke gatingen på alle eksemplene i den mappen.
  3. Beregn og eksporter APC-median fluorescensintensitet (MFI) av nøytrofiler fra hver brønn ved hjelp av programvarens tabellredigeringsfunksjon. Klikk på Legg til kolonne under kategorien Rediger . Velg Median i kategorien Statistikk , velg den inngjerdede populasjonen nøytrofiler, og velg APC som parameter. Klikk på OK-knappen .
  4. Gå tilbake til "Table editor" -fanen, velg Alle prøver i "Group" -fanen, og trykk på Opprett tabell-knappen . Et nytt vindu vises som viser den opprettede tabellen. Lagre den som en tekst-, CSV- eller Excel-fil.
  5. Åpne den eksporterte tabellen, beregne middelverdien og standardavviket til APC MFI for de positive og negative kontrollprøvene (figur 4).
  6. Beregn platens Z'-faktor (Z') ved hjelp av ligningen:
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
    der σ p og σ n er standardavvikene til henholdsvis positive og negative kontroller, og μp og μn er middelet til henholdsvis positive og negative kontroller31.
    MERK: Z-faktoren indikerer separasjonen av de positive og negative kontrollfordelingene. En Z' på 0 betyr ingen separasjon, mens en Z' på 0,5 indikerer lik separasjon. Som nevnt i en tidligere studie31, indikerer Z '> 0,5 en utmerket analyse for sammensatt screening. En Z' i området 0,5 til 0 er akseptabelt, men det kan bare identifisere sterke treff i analysen, noe som vil kreve ytterligere validering i sekundære analyser.
  7. Vurder forbindelser som "treff" for screening når APC MFI av sammensatte behandlede nøytrofiler er lavere enn tre ganger standardavviket til den positive kontroll-MFI trukket fra den positive kontroll-MFI (P = 0,0013, representert ved den stiplede linjen i figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data fra en representativ 384-brønns platescreening (figur 4) viste at negative kontroller hadde en MFI på mAb24-APC på 3236 ± 110, mens positive kontroller hadde en MFI på mAb24-APC på 7588 ± 858. Z-faktoren for denne platen er ca. 0,33, som er innenfor et akseptabelt område31. Z' krever imidlertid ytterligere validering i sekundære analyser.

For å normalisere dataene ble alle verdier skalert for å tilordne en maksimumsverdi på 1 til det positive gjennomsnittet og en minimumsverdi på 0 til det negative gjennomsnittet. Z-faktoren vil gjennomgå strengere validering i sekundære analyser. Grenseverdien for denne platen er satt til 0,41, noe som betyr at prøver med en relativ MFI lavere enn 0,41 vil bli betraktet som treff som hemmer fMLP-indusert β2 integrinaktivering i humane nøytrofiler. Ingen treff ble identifisert fra denne platen.

For å bekrefte protokollens effektivitet ble Nexinhib20, som hemmer β2 integrinaktivering ved å motvirke Rac-1-funksjonen, og lifitegrast, som motvirker integrin αLβ2 direkte32,33, brukt. Inkubasjonstiden ble imidlertid justert til én time for Nexinhib20 og en halv time for lifitegrast. De resulterende dataene fra disse forsøkene ble normalisert ved hjelp av samme skaleringsmetode som beskrevet ovenfor. Disse datapunktene ble deretter kombinert med plateresultatene og analysert samlet (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Plateoppsett for sammensatt screening. Et skjematisk diagram som illustrerer arrangementet av screeningforbindelser og kontroller i en 384-brønnplate. Negative kontrollbrønner er vist i blått (kolonne 1 og 23), og positive kontrollbrønner er vist i rødt (kolonne 2 og 24). Testbrønner er representert i beige (kolonne 3 til 22). Pilene angir sekvensen for å lese platen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Nøytrofil separasjon ved bruk av tetthetsgradientmedium. Representative bilder som demonstrerer vellykket og mislykket separasjon av nøytrofiler ved bruk av tetthetsgradientmedium. (A) I utgangspunktet legges 4 ml blod lagvis på 8 ml tetthetsgradientmedium. (B) Etter sentrifugering skal to uklare bånd være synlige: det øvre båndet som hovedsakelig inneholder mononukleære celler i perifert blod (PBMC) og det nedre båndet som hovedsakelig inneholder nøytrofiler med noen røde blodlegemer (RBC). De fleste RBC er pelletert i bunnen. (C) En mislykket separasjon der RBC ikke blir pelletert, og det nøytrofile båndet ikke observeres. Ytterligere sentrifugering (10-30 min) vil være nødvendig for å skille nøytrofilbåndet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Gating av nøytrofile ved bruk av FSC/SSC-plott. Representative forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) plott som illustrerer gating-strategien for å identifisere nøytrofiler. (A) Nøytrofiler er styrt basert på arealet av fremoverspredning (FSC-A) og sidespredning (SSC-A) registrert av strømningscytometeret. (B) Enkeltceller er videre inngjerdet basert på bredden (FSC-W) og høyden (FSC-H) av fremoverspredningen, og (C) bredden (SSC-W) og høyden (SSC-H) til sidespredningen. Fargeskalaen representerer celletetthet, overgang fra rød til gul, grønn og blå når tettheten minker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Screeningresultater i en representativ 384-brønnsplate. Screeningen kommer fra en representativ 384-brønns plate, som viser en Z'-faktor på 0,3. Negative og positive kontroller er indikert med henholdsvis blå og røde prikker. Testprøver behandlet med forskjellige forbindelser er representert som beige prikker. Den stiplede linjen representerer gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) cut-off for å identifisere treff. Ingen av de testede forbindelsene ble identifisert som β2 integrinantagonister, da alle testede forbindelser viste MFI-verdier over avskjæringslinjen. Resultater fra uavhengige eksperimenter som testet kjente β2-integrinantagonister med varierende inkubasjonstider (Nexinhib20 i 1 time, lifitegrast i en halv time) er samlet for presentasjon i denne figuren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Initiering og avslutning av nøytrofil stimulering og farging bestemmes ved tilsetning av nøytrofiler og fikseringsmiddel PFA. Derfor er det viktig å sikre samme tidsintervall mellom pipettering av nøytrofiler eller PFA i hver kolonne. Dette sikrer at stimulerings- og fargetiden til nøytrofiler fra hver brønn forblir konsistent. På grunn av den korte levetiden til nøytrofiler, må hele forsøket, fra å samle blod fra givere til å fullføre flowcytometri, utføres samme dag. Nøytrofile granulocytter er svært følsomme for temperaturendringer og kan aktiveres når de utsettes for raske temperaturøkninger, for eksempel overgang fra 4 °C til romtemperatur eller fra romtemperatur til 37 °C. I tillegg, basert på vår tidligere erfaring, forekommer ikke fMLP-indusert nøytrofil β2 integrinaktivering når celler lagres på is eller ved 4 °C (data ikke vist). Før fiksering bør derfor fullblod og nøytrofiler oppbevares ved romtemperatur eller 20 °C (under sentrifugeringstrinnet isolering). Ikke legg fullblod og nøytrofiler på is.

Farging av mAb24 i negative kontroller bør gi svært lave resultater. Hvis et høyt mAb24-fargenivå observeres i et eksperiment, vennligst sjekk følgende: (1) om det var en signifikant temperaturendring under forsøket før fiksering; (2) om det var fMLP eller endotoksinforurensning i det nøytrofile mediet; (3) om prøvehåndteringen var for aggressiv, for eksempel generering av bobler under pipettering og blanding.

Den nåværende protokollen bruker mAb24 for å rapportere åpningen av β2 integrin-hodestykket. Teoretisk sett kan KIM127, et monoklonalt antistoff som rapporterer utvidelsen av β2-integriner 34,35, brukes sammen med mAb24 for å vurdere β2 integrinkonformasjon grundig. Imidlertid er signal-støy-forholdet mellom KIM127-farging (1,5 til 2 ganger) ikke like gunstig som for mAb24 (5 til 10 ganger), noe som vanligvis ikke gir en tilfredsstillende Z 'faktor i 384-brønnplateanalysen. I 96-brønns plateanalysen kan prøver vaskes før de utfører flowcytometri, noe som reduserer løselige antistoffavledede bakgrunnssignaler. Derfor kan den KIM127-baserte analysen utføres i 96-brønns plateanalysen, som har lavere gjennomstrømning sammenlignet med 384-brønnplateanalysen.

Siden denne metoden bruker fluorescensintensitet som en avlesning for å vurdere den integrinhemmende effekten av legemidler, kan noen fluorescerende stoffer forstyrre resultatene. I tillegg vil toksiske stoffer som induserer nøytrofil død innen stimuleringsperioden på 10 minutter også synes å rapportere integrinhemming. Legemidler som hemmer nøytrofil degranulering vil undertrykke det generelle β2-integrinuttrykket. Disse degranulasjonshemmerne vil også bli identifisert i vår screening. Derfor er sekundær screening med andre kontroller nødvendig for å bekrefte de hemmende effektene av treffene. Sekundære skjermer refereres til som et middel til både å validere og bestemme virkningsmekanismen til treff. I tillegg til å gjenta mAb24-testene, vil det totale CD18-uttrykket på celleoverflaten bli vurdert ved hjelp av et pan-anti-humant CD18-antistoff. Nivået av aktivert β2-integrin, målt ved mAb24, vil bli normalisert av det totale CD18-uttrykket. Dette vil gjøre oss i stand til å avgjøre om midlets virkningsmekanisme innebærer å motvirke integrinaktivering og/eller hemme ekspresjonen av CD18 på celleoverflaten. En levedyktighetsanalyse bør også utføres i den sekundære skjermen for å utelukke eventuelle toksiske effekter av treffene.

Denne protokollen har begrensninger. For det første er mAb24 i stand til å oppdage det β2 I-lignende domenet bare i tilfeller der integrinet er i en høy affinitetstilstand. Derfor kan den ikke identifisere α/β I-lignende allosteriske antagonister som lifitegrast gjennom redusert mAb24-binding. Lifitegrast induserer mer mAb24 binding32 og viser en unormalt økt MFI-verdi med mAb24 (figur 4). For slike unormale verdier kan det være nødvendig med andre analyser for å verifisere om disse treffene er α/β I-lignende allosteriske antagonister som lifitegrast. For det andre er Z-faktoren for denne analysen suboptimal og kan potensielt forbedres ved bruk av automatisk pipettering og omrøring. Dessverre mangler vårt laboratorium det nødvendige utstyret for å teste denne hypotesen. Duplisering eller triplikering av analyser vil være nyttig for å identifisere falske positive og negative i tilfelle Z-faktoren ikke kan forbedres ytterligere med metodene ovenfor. Videre kan det være fordelaktig å forlenge inkubasjonstiden for å identifisere flere treff, som observert med den kjente β2-integrinaktiveringshemmeren Nexinhib20, som krever en times inkubasjon for å gi hemmende effekter. Denne studien fokuserte på å identifisere hurtigvirkende midler. Forskere bør merke seg at de kan endre inkubasjonstiden for å passe deres spesifikke behov.

Så vidt vi vet, er dette den første screeningmetoden med høy gjennomstrømning for β2-integrinantagonister. Denne tilnærmingen kan brukes til å identifisere små molekylære forbindelser som direkte binder seg til β2-integriner og forhindrer konformasjonsendringer som fører til mellomliggende / høy affinitetsintegrintilstander, lik antagonister uten "agonistiske" egenskaper som nylig er beskrevet for integriner αIIbβ3 og α4β126. Nøytrofiler er kritiske i mange inflammatoriske sykdommer, som myokardiskemi-reperfusjonsskade 36, sepsis37 og autoimmune sykdommer38,39. Småmolekylære legemidler kan gi mer fleksibilitet i behandling av disse sykdommene sammenlignet med antistoffbaserte legemidler. Treff fra skjermen vår kan gi potensielle behandlinger for inflammatoriske sykdommer.

Den nåværende metoden er en fluorescerende antistoffbasert, høy gjennomstrømningsskjerm. Siden aktiveringsreporterantistoffer også er tilgjengelige for β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 og αL-integriner47,48,49,50, kan denne metoden utvides til å identifisere antagonister for andre integriner. Et konformasjonsfølsomt antistoff som HUTS-21, som binder seg til β1-hybriddomenet 51,52,53, har blitt brukt i en skjerm med høy gjennomstrømning for å identifisere svært sent antigen-4 (VLA-4, integrin α4β1) allosteriske antagonister 54. Den nåværende screeningsmetoden kan også modifiseres og utvides for å finne stoffer som hemmer eller fremmer ekspresjonen av andre overflatereseptorer, for eksempel forbindelser som øker cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR) overflateuttrykk på cystisk fibrose (CF) celler. Ved CF fører multiple mutasjoner til CFTR-feilfolding, noe som resulterer i fraværende ekspresjon av CFTR på cellemembranen55. Småmolekylære legemidler har vist seg å gjenopprette CFTR-uttrykket56. For protokollmodifikasjoner er det nødvendig å øke inkubasjonstiden for legemidler til flere timer for å tillate proteinuttrykksendringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Evan Jellison og Li Zhu i flowcytometrikjernen ved UConn Health for deres hjelp med flowcytometri, Dr. Lynn Puddington ved Institutt for immunologi ved UConn Health for hennes støtte til instrumentene, Slawa Gajewska og Dr. Paul Appleton i den kliniske forskningskjernen ved UConn Health for deres hjelp med å skaffe blodprøver. Vi anerkjenner Dr. Christopher "Kit" Bonin og Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for deres hjelp med vitenskapelig skriving og redigering av dette manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, en karriereutviklingspris fra American Heart Association (18CDA34110426), og et oppstartsfond fra UConn Health. Figur 1 ble laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 204
En flowcytometribasert høykapasitetsteknikk for screening av integrinhemmende legemidler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L.… More

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter