Summary
Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde, high-throughput screeningsmethode om geneesmiddelen met kleine moleculen te identificeren die de activering van β2-integrine op menselijke neutrofielen remmen.
Abstract
Dit protocol heeft tot doel een methode vast te stellen voor het identificeren van kleine moleculaire antagonisten van β2-integrine-activering, met behulp van conformationele-verandering-rapporterende antilichamen en high-throughput flowcytometrie. De methode kan ook dienen als leidraad voor andere op antilichamen gebaseerde high-throughput screeningsmethoden. β2-integrinen zijn leukocytenspecifieke adhesiemoleculen die cruciaal zijn in immuunresponsen. Neutrofielen vertrouwen op integrine-activering om de bloedbaan te verlaten, niet alleen om infecties te bestrijden, maar ook om betrokken te zijn bij meerdere ontstekingsziekten. Het beheersen van β2-integrine-activering biedt een haalbare benadering voor de behandeling van neutrofielen-geassocieerde ontstekingsziekten. In dit protocol wordt een monoklonaal antilichaam, mAb24, dat specifiek bindt aan het hoofddeksel met hoge affiniteit van β2-integrinen, gebruikt om de activering van β2-integrine op geïsoleerde primaire menselijke neutrofielen te kwantificeren. N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP) wordt gebruikt als stimulus om neutrofiele β2-integrinen te activeren. In deze studie werd een flowcytometer met hoge doorvoer gebruikt die in staat is om automatisch plaatmonsters met 384 putjes uit te voeren. De effecten van 320 chemicaliën op de remming van β2-integrine worden binnen 3 uur beoordeeld. Moleculen die zich rechtstreeks richten op β2-integrinen of doelmoleculen in de G-proteïne-gekoppelde receptor-geïnitieerde integrine inside-out activeringssignaleringsroute kunnen via deze benadering worden geïdentificeerd.
Introduction
Veel ontstekingsziekten worden gekenmerkt door de infiltratie van neutrofielen op de plaats van zwelling of verwonding1. Om deze weefsels te infiltreren, moeten neutrofielen de rekruteringscascade van neutrofielen voltooien, waarbij het endotheel wordt gestopt, extravasatie over de vaatwand en rekrutering in het weefsel2. Circulerende neutrofielen hebben β2-integrineactivering nodig om deze cascade te voltooien, vooral voor de stopfase. Integrine-remmende geneesmiddelen die de adhesie, extravasatie en rekrutering van neutrofielen verminderen, kunnen dus ontstekingsziekten effectiefbehandelen3,4.
β2-integrinen zijn eerder het doelwit geweest van ontstekingsziekten. Efalizumab, een monoklonaal antilichaam dat zich rechtstreeks richt op integrine αLβ2, werd ontwikkeld voor de behandeling van psoriasis5. Efalizumab werd echter gestaakt vanwege de dodelijke bijwerking - progressieve multifocale leuko-encefalopathie als gevolg van reactivering van het JC-virus 6,7. Nieuwe ontstekingsremmende therapieën op basis van integrine moeten overwegen om de anti-infectiefuncties van leukocyten te handhaven om bijwerkingen te minimaliseren. De bijwerkingen van efalizumab kunnen te wijten zijn aan de langdurige circulatie van monoklonale antilichamen in de bloedbaan, die op de lange termijn immuunfuncties kunnen remmen8. Een recente studie toont aan dat efalizumab αLβ2-crosslinking en de ongewenste internalisatie van α4-integrinen bemiddelt, wat een alternatieve verklaring biedt voor de bijwerkingen9. Kortstondige antagonisten met kleine moleculen kunnen dit probleem dus vermijden.
Een high-throughput methode om kleine moleculen β2 integrine antagonisten te screenen met behulp van menselijke neutrofielen wordt hier gepresenteerd. Β2-integrineactivering vereist conformatieveranderingen van het integrine-ectodomein om toegang te krijgen tot de bindingsaffiniteit met zijn ligand en deze te vergroten. In het canonieke switchblade-model strekt het bent-gesloten integrine-ectodomein zich eerst uit tot een verlengd-gesloten conformatie en opent vervolgens zijn kopstuk tot een volledig geactiveerde extended-open conformatie10,11,12,13. Er is ook een alternatief pad dat begint van de gebogen-gesloten naar gebogen-open en uitgebreid-open, uiteindelijk 14,15,16,17,18,19. Het conformatiespecifieke antilichaam mAb24 bindt zich aan een epitoop in het menselijke β2-I-achtige domein wanneer het zendspoel van het ectodomein open is 20,21,22,23.
Hier wordt mAb24-APC gebruikt om te bepalen of de β2-integrinen geactiveerd zijn. Om neutrofielen en integrine te activeren, wordt N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP), een bacterieel afgeleid kort chemotactisch peptide dat neutrofiele β2-integrinen24 kan activeren, gebruikt als stimulus in dit protocol. Wanneer fMLP bindt aan het Fpr1 op neutrofielen, worden stroomafwaartse signaalcascades met G-eiwitten, fosfolipase Cβ en fosfoinositide-3-kinase γ geactiveerd. Deze signaleringsgebeurtenissen resulteren uiteindelijk in integrine-activering via de inside-out signaleringsroute18,25. Naast kleine molecuulantagonisten die direct binden aan β2-integrinen en conformatieveranderingen van integrine-activatievoorkomen 26, zouden met deze methode ook verbindingen worden gedetecteerd die componenten in de β2-integrine inside-out activeringssignaleringsroute kunnen remmen. Geautomatiseerde flowcytometers maken screening met hoge doorvoer mogelijk. Het identificeren van nieuwe antagonisten kan niet alleen ons begrip van integrinefysiologie verdiepen, maar ook translationeel inzicht verschaffen in op integrine gebaseerde anti-inflammatoire therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gehepariniseerde volbloedmonsters werden verkregen van geanonimiseerde gezonde menselijke donoren na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board van UConn Health, volgens de principes van de Verklaring van Helsinki. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren. De inclusie-/exclusiecriteria voor dit onderzoek zijn zorgvuldig ontwikkeld om de geschiktheid van deelnemers te waarborgen en mogelijke risico's te minimaliseren. In aanmerking komende deelnemers waren tussen de 18 en 65 jaar oud, van elke etniciteit, vloeiend Engels sprekend en in staat om geïnformeerde toestemming te geven. Uitgesloten deelnemers waren onder meer degenen die geen geïnformeerde toestemming voor zichzelf konden geven, zoals degenen die een wettelijk gemachtigde vertegenwoordiger nodig hadden, personen jonger dan 18 jaar of ouder dan 65 jaar, gedetineerde personen en zwangere vrouwen. Bovendien moesten de deelnemers vrij zijn van het gebruik van ontstekingsremmende medicatie en ontstekingsaandoeningen. Huidige infecties of aanhoudende chronische of acute ontstekingsaandoeningen waren ook uitsluitingscriteria. Ten slotte kwamen personen met een huidige of recente voorgeschiedenis van COVID-19-infectie niet in aanmerking voor het onderzoek. Deze criteria zijn ontworpen om de veiligheid en geschiktheid van de deelnemers te waarborgen en tegelijkertijd mogelijke verstorende factoren die van invloed kunnen zijn op de onderzoeksresultaten tot een minimum te beperken.
1. Bereiding van reagentia
- Neutrofiel medium: Bereid het neutrofiele medium voor door 2% humaan serumalbumine toe te voegen aan RPMI-1640 zonder fenolrood (zie Materiaaltabel).
- fMLP-oplossing: Bereid de fMLP-oplossing door deze 100 keer te verdunnen uit de 10 mM fMLP-dimethylsulfoxide (DMSO)-opslagoplossing (zie materiaaltabel) met RPMI 1640 zonder fenolrood, wat resulteert in een 100 μM fMLP-oplossing.
- Antilichaamoplossing: Verdun 120 μL allophycocyanine (APC)-geconjugeerd monoklonaal antilichaam mAb24 (mAb24-APC) (zie Materiaaltabel), dat de conformatie met hoge affiniteit van β2-integrine rapporteert, in 10 ml neutrofiel medium, waardoor een 1,2 μg/ml mAb24-APC-oplossing ontstaat.
- Samengestelde bibliotheek: Verdun de initiële samengestelde bibliotheek met een concentratie van 10 mM tot 1 mM door 5 μL van de 10 mM-bibliotheek (zie Materiaaltabel) toe te voegen aan 45 μL DMSO in platen met 384 putjes met behulp van de vloeistofverwerker. Breng vervolgens 5 μL per putje van de 1 mM compoundbibliotheek over naar een lege plaat met 384 putjes met behulp van de liquid handler.
- Zoals geïllustreerd in figuur 1, bevatten vier kolommen ( 1, 2, 23, 24) alleen DMSO, maar geen verbindingen, die dienden als positieve en negatieve controles bij de screening. Verdun elk putje verder door 45 μL RPMI-1640 zonder fenolrood toe te voegen, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 100 μM voor alle verbindingen.
2. Isolatie van neutrofielen uit menselijk bloed
- Laag met behulp van een serologische pipet voorzichtig 4 ml bloed over 8 ml van een in de handel verkrijgbaar dichtheidsgradiëntmedium (zie Materiaaltabel) in een centrifugebuis van 15 ml (Figuur 2A).
- Centrifugeer het bloed bij 550 × g gedurende 30-50 minuten bij 20 °C. Vertraag de rotor geleidelijk (vertragingsfactor van 1).
OPMERKING: De succesvolle scheiding van neutrofielen (band 2 in figuur 2B) van rode bloedcellen kan per donor verschillen. Voor de meeste donoren is een centrifugatie van 30 minuten voldoende. Voor sommige donoren kan echter een extra centrifugatie van 10-30 minuten nodig zijn als de scheiding niet succesvol is (figuur 2C). - Verwijder voorzichtig het plasma (de gele vloeistof bovenop) en mononucleaire cellen (de bovenste troebele band; PBMC-band in figuur 2B) met behulp van een pipet van 1 ml.
- Verzamel neutrofielen uit de onderste troebele band (neutrofielenband in figuur 2B) en ongeveer 3-4 ml onder de heldere vloeistof in een centrifugebuis van 15 ml met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Meng de neutrofielensuspensie voorzichtig door deze 2-3 keer om te keren.
- Centrifugeer de suspensie bij 400 × g gedurende 10 minuten bij 20 °C en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatans door te decanteren.
- Resuspendeer de pellet voorzichtig met 5 ml PBS en centrifugeer deze bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 20 °C.
- Verwijder het supernatans door te decanteren en verwijder voorzichtig eventueel achtergebleven supernatans rond de buismond en op de buiswand met behulp van vacuümafzuiging. Resuspendeer de pellet in 1 ml neutrofiel medium.
- Tel de celnummers met behulp van een hemocytometer. Meestal werden 1 tot 4 × 107 neutrofielen verkregen uit 8 ml menselijk bloed.
OPMERKING: Er kan sprake zijn van besmetting met rode bloedcellen in de neutrofielensuspensie. Rode bloedcellen hebben geen significante invloed op de meeste tests en kunnen de activering/priming van neutrofielen voorkomen27. Rode bloedcellen moeten worden gelyseerd voordat ze worden geteld om een nauwkeurige neutrofielenconcentratie te verkrijgen. Voeg 10 μL van de celsuspensie toe aan 891 μL gedeïoniseerd water gedurende 10-30 s om de rode bloedcellen te lyseren en voeg vervolgens 99 μL 10× PBS toe om de osmotische druk in evenwicht te brengen, waardoor lysis van de neutrofielen wordt voorkomen. - Pas de celdichtheid aan naar 6,25 × 105 cellen/ml door neutrofiel medium toe te voegen.
3. Voorbereiding van de plaat met 384 putjes
- Meng in een centrifugebuisje van 1,5 ml 1 ml van de antilichaamoplossing (1,2 μg/ml mAb24-APC) met 0,2 ml neutrofiel medium om een 1 μg/ml mAb24-APC-oplossing te maken. Voeg vervolgens 25 μl van dit mengsel toe aan de negatieve controleputjes in een plaat met 384 putjes (de blauwe putjes in figuur 1).
- Meng in een centrifugebuisje van 15 ml 9 ml van de antilichaamoplossing met 21,6 μl van de fMLP-oplossing (100 μM) en 1,7784 ml neutrofiel medium om een oplossing te maken die 1 μg/ml mAb24-APC en 200 nM fMLP bevat. Voeg vervolgens 25 μL van dit mengsel toe aan de positieve controle- en testputjes in een plaat met 384 putjes (de rode en blauwe putjes in figuur 1).
- Breng 5 μl van de 100 μM samengestelde oplossingen over van de samengestelde bibliotheekplaat naar de plaat met 384 putjes met behulp van een meerkanaalspipet.
- Centrifugeer de vloeistof gedurende 1 minuut bij 500 × g, bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Voor het centrifugeren van platen zijn een zwenkbakrotor en plaatemmers vereist.
4. Behandeling van cellen
- Voeg 20 μl neutrofielensuspensie toe aan elk putje met behulp van een 16-kanaals pipet (5-50 μl, voor elke kolom van de plaat met 384 putjes). Meng voorzichtig 5-10 keer met behulp van de pipet en houd een consistent tijdsinterval aan tussen elk pipetteren.
OPMERKING: De uiteindelijke concentraties in de putjes zijn als volgt: neutrofielen 2,5 × 105 cellen/ml (alle putjes); mAb24-APC 0,5 μg/ml (alle putjes); fMLP 100 nM (positieve controle en testputjes); verbindingen 10 μM (testputjes). - Incubeer de plaat op een shaker bij 300 rpm, bij kamertemperatuur (RT), gedurende 10 min.
- Fixeer de cellen door 3 μL 16% paraformaldehyde (PFA) aan elk putje toe te voegen met behulp van een 16-kanaals pipet (uiteindelijke PFA-concentratie ~0,91%). Cubeer vervolgens 10 minuten op ijs.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een consistent tijdsinterval tussen verschillende kolommen aan te houden bij het toevoegen van neutrofielen en PFA. Dit zorgt ervoor dat neutrofielen in elk putje dezelfde incubatietijd hebben met fMLP en mAb24-APC.
5. Flowcytometrie
- Schakel de flowcytometer in (zie Materiaaltabel) en zorg ervoor dat de computer die op het instrument is aangesloten, ook is ingeschakeld.
- Zorg ervoor dat de vloeistofcontainer van de huls gevuld is en dat de afvalcontainer leeg is en goed is aangesloten op het instrument.
- Laad de plaat met 384 putjes op de monsterlader van de flowcytometer. Zorg ervoor dat de A1-put van de plaat is uitgelijnd met de A1-markering op de lader.
- Open de software en maak een nieuw experiment. Selecteer 384 goed en kies de gewenste fluoroforen. Klik vervolgens op Plaatopstelling, sleep om alle putten te selecteren en klik vervolgens op Voorbeeld. Zet de schakelaar "Hoge doorvoer" aan en selecteer Hoog onder het tariefpaneel.
- Voer in het vak Volume 50 in. Selecteer monsters in oneven kolommen en activeer vervolgens de schakelaar "Agitatie". Geef ten slotte de voorbeelden een naam in het rechterpaneel.
- Klik op Plot en poort. Klik vervolgens op de knop Toepassen (twee pijlen op een groen gevulde cirkel) en klik vervolgens op de afspeelknop (driehoekvorm). Wacht een paar seconden om enkele cellen uit de eerste put te observeren en klik vervolgens op de pauzeknop .
- Pas de FSC- en SSC-spanningen aan om een goede visualisatie van de cellen op de plot te garanderen. Klik op Acquisitie en klik vervolgens op de afspeelknop (driehoeksvorm) om de test te starten.
- De flowcytometer zal achtereenvolgens ~50 μL van 1000-3000 neutrofielen uit elk putje bemonsteren. Het duurt ongeveer 3 uur om de volledige plaat met 384 putjes te voltooien.
- Nadat u alle voorbeelden hebt voltooid, exporteert u de FCS-bestanden voor de volgende stap.
6. Data-analyse
- Open de software voor de analyse van flowcytometriegegevens (zie Materiaaltabel). Selecteer en sleep de map met alle FCS-bestanden naar het softwarevenster en laat vervolgens los om de gegevens in de software te importeren.
- Dubbelklik op één monster, poort enkele neutrofielen op basis van FSC en SSC28,29,30 in het pop-upvenster, zoals weergegeven in figuur 3. Selecteer de gated rijen en sleep ze naar de map en laat ze vervolgens los om de gating toe te passen op alle voorbeelden in die map.
- Bereken en exporteer de APC-mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van neutrofielen van elk putje met behulp van de tabeleditorfunctie van de software. Klik op Kolom toevoegen onder het tabblad Bewerken . Selecteer Mediaan op het tabblad Statistiek , kies de neutrofielen van de gated populatie en selecteer APC als parameter. Klik op de knop OK .
- Keer terug naar het tabblad "Tabeleditor", selecteer Alle voorbeelden op het tabblad "Groep" en druk op de knop Tabel maken . Er verschijnt een nieuw venster met de aangemaakte tabel. Sla het op als tekst-, CSV- of Excel-bestand.
- Open de geëxporteerde tabel, bereken de gemiddelde waarde en standaarddeviatie van de APC MFI voor de positieve en negatieve controlemonsters (figuur 4).
- Bereken de Z'-factor (Z') van de plaat met behulp van de vergelijking:
Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
waarbij σ p en σ n de standaarddeviaties van respectievelijk de positieve en negatieve controles zijn en μp en μn respectievelijk de gemiddelden van de positieve en negatieve controleszijn 31.
OPMERKING: De Z'-factor geeft de scheiding aan van de positieve en negatieve controleverdelingen. Een Z' van 0 betekent geen scheiding, terwijl een Z' van 0,5 een gelijke scheiding aangeeft. Zoals vermeld in een eerdere studie31, duidt Z' > 0,5 op een uitstekende test voor screening op verbindingen. Een Z' in het bereik van 0,5 tot 0 is acceptabel, maar het kan alleen sterke treffers in de test identificeren, waarvoor verdere validatie in secundaire tests nodig is. - Beschouw verbindingen als "treffers" voor screening wanneer de APC MFI van met verbindingen behandelde neutrofielen lager is dan driemaal de standaarddeviatie van de positieve controle-MFI afgetrokken van de positieve controle-MFI (P = 0,0013, weergegeven door de stippellijn in figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gegevens van een representatieve plaatscreening met 384 putjes (figuur 4) toonden aan dat negatieve controles een MFI van mAb24-APC van 3236 ± 110 hadden, terwijl positieve controles een MFI van mAb24-APC van 7588 ± 858 hadden. De Z'-factor voor deze plaat is ongeveer 0,33, wat binnen een acceptabel bereik31 ligt. Z' vereist echter verdere validatie in secundaire assays.
Om de gegevens te normaliseren, werden alle waarden geschaald om een maximale waarde van 1 toe te kennen aan het positieve gemiddelde en een minimale waarde van 0 aan het negatieve gemiddelde. De Z'-factor zal een rigoureuzere validatie ondergaan in secundaire tests. De grenswaarde voor deze plaat is vastgesteld op 0,41, wat betekent dat monsters met een relatieve MFI lager dan 0,41 worden beschouwd als treffers die de door fMLP geïnduceerde β2-integrine-activering in menselijke neutrofielen remmen. Er werden geen treffers geïdentificeerd van deze plaat.
Om de effectiviteit van het protocol te bevestigen, werden Nexinhib20 gebruikt, dat de activering van β2-integrine remt door de Rac-1-functie te antagoniseren, en lifitegrast, dat integrine αLβ2 rechtstreeks32,33 antagoniseert. De incubatietijd werd echter aangepast naar één uur voor Nexinhib20 en een half uur voor lifitegrast. De resulterende gegevens van deze experimenten werden genormaliseerd met behulp van dezelfde schaalmethode die hierboven is beschreven. Deze datapunten werden vervolgens gecombineerd met de plaatresultaten en gezamenlijk geanalyseerd (Figuur 4).
Figuur 1: Plaatlay-out voor samengestelde screening. Een schematisch diagram dat de rangschikking van screeningsverbindingen en controles in een plaat met 384 putjes illustreert. Negatieve controleputjes zijn blauw afgebeeld (kolommen 1 en 23) en positieve controleputjes zijn rood weergegeven (kolommen 2 en 24). Testputten worden weergegeven in beige (kolommen 3 tot en met 22). Pijlen geven de volgorde aan voor het aflezen van de plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Scheiding van neutrofielen met behulp van dichtheidsgradiëntmedium. Representatieve foto's die de succesvolle en niet-succesvolle scheiding van neutrofielen aantonen met behulp van dichtheidsgradiëntmedium. (A) In eerste instantie wordt 4 ml bloed gelaagd op 8 ml dichtheidsgradiëntmedium. (B) Na centrifugatie moeten twee troebele banden zichtbaar zijn: de bovenste band met voornamelijk perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) en de onderste band met voornamelijk neutrofielen met enkele rode bloedcellen (RBC's). De meeste rode bloedcellen zijn aan de onderkant gepelleteerd. (C) Een mislukte scheiding waarbij RBC's niet worden gepelleteerd en de neutrofielenband niet in acht wordt genomen. Extra centrifugeren (10-30 min) zou nodig zijn om de neutrofielenband te scheiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gating van neutrofielen met behulp van FSC/SSC-plots. Representatieve forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) plots die de poortstrategie voor het identificeren van neutrofielen illustreren. (A) Neutrofielen zijn gated op basis van het gebied van voorwaartse verstrooiing (FSC-A) en zijverstrooiing (SSC-A) geregistreerd door de flowcytometer. (B) Afzonderlijke cellen zijn verder omheind op basis van de breedte (FSC-W) en hoogte (FSC-H) van voorwaartse verstrooiing, en (C) de breedte (SSC-W) en hoogte (SSC-H) van zijverstrooiing. De kleurenschaal geeft de celdichtheid weer, waarbij de overgang van rood naar geel, groen en blauw overgaat naarmate de dichtheid afneemt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Screening resulteert in een representatieve plaat met 384 putjes. De screening is het resultaat van een representatieve plaat met 384 putjes, die een Z'-factor van 0,3 aantoont. Negatieve en positieve controles worden aangegeven met respectievelijk blauwe en rode stippen. Testmonsters die met verschillende verbindingen zijn behandeld, worden weergegeven als beige stippen. De stippellijn geeft de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) -grens weer voor het identificeren van treffers. Geen van de geteste verbindingen werd geïdentificeerd als β2-integrineantagonisten, aangezien alle geteste verbindingen MFI-waarden boven de afkapgrens vertoonden. Resultaten van onafhankelijke experimenten met het testen van bekende β2-integratagonisten met verschillende incubatietijden (Nexinhib20 gedurende 1 uur, lifitegrast gedurende een half uur) worden gebundeld voor presentatie in deze figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De initiatie en beëindiging van neutrofielenstimulatie en kleuring worden bepaald door de toevoeging van neutrofielen en het fixatief PFA. Daarom is het van cruciaal belang om te zorgen voor hetzelfde tijdsinterval tussen het pipetteren van neutrofielen of PFA in elke kolom. Dit zorgt ervoor dat de stimulatie- en kleuringstijd van neutrofielen uit elk putje consistent blijft. Vanwege de korte levensduur van neutrofielen moet het hele experiment, van het afnemen van bloed bij donoren tot het voltooien van flowcytometrie, op dezelfde dag worden uitgevoerd. Neutrofielen zijn zeer gevoelig voor temperatuurveranderingen en kunnen geactiveerd worden bij blootstelling aan snelle temperatuurstijgingen, zoals de overgang van 4 °C naar kamertemperatuur of van kamertemperatuur naar 37 °C. Bovendien, op basis van onze eerdere ervaring, vindt fMLP-geïnduceerde neutrofiele β2-integrineactivering niet plaats wanneer cellen op ijs of bij 4 °C worden opgeslagen (gegevens niet getoond). Daarom moeten volbloed en neutrofielen vóór fixatie bij kamertemperatuur of 20 °C worden bewaard (tijdens de isolatiecentrifugatiestap). Plaats geen volbloed en neutrofielen op ijs.
De kleuring van mAb24 in negatieve controles zou zeer lage resultaten moeten opleveren. Als in een experiment een hoog mAb24-kleuringsniveau wordt waargenomen, controleer dan het volgende: (1) of er een significante temperatuurverandering was tijdens het experiment vóór fixatie; (2) of er sprake was van fMLP- of endotoxinebesmetting in het neutrofielenmedium; (3) of de behandeling van monsters te agressief was, zoals het genereren van bellen tijdens het pipetteren en mengen.
Het huidige protocol maakt gebruik van mAb24 om de opening van het β2-integrinezendspoel te melden. Theoretisch kan KIM127, een monoklonaal antilichaam dat de uitbreiding van β2-integrinen 34,35 rapporteert, worden gebruikt in combinatie met mAb24 om de conformatie van β2-integrine uitgebreid te beoordelen. De signaal-ruisverhouding van KIM127-kleuring (1,5 tot 2-voudig) is echter niet zo gunstig als die van mAb24 (5 tot 10-voudig), wat doorgaans geen bevredigende Z'-factor oplevert in de 384-well plaattest. In de plaattest met 96 putjes kunnen monsters worden gewassen voordat flowcytometrie wordt uitgevoerd, waardoor oplosbare achtergrondsignalen van antilichamen worden verminderd. Daarom kan de op KIM127 gebaseerde test worden uitgevoerd in de plaattest met 96 putjes, die een lagere doorvoer heeft in vergelijking met de plaattest met 384 putjes.
Aangezien deze methode fluorescentie-intensiteit gebruikt als uitlezing om het integrineremmende effect van geneesmiddelen te beoordelen, kunnen sommige fluorescerende geneesmiddelen de resultaten verstoren. Bovendien zullen toxische geneesmiddelen die neutrofielendood veroorzaken binnen de stimulatieperiode van 10 minuten ook integrineremming lijken te melden. Geneesmiddelen die de degranulatie van neutrofielen remmen, onderdrukken de algehele expressie van β2-integrine. Deze degranulatieremmers zullen ook worden geïdentificeerd in onze screening. Daarom is secundaire screening met andere controles nodig om de remmende effecten van de treffers te bevestigen. Secundaire schermen worden genoemd als een middel om het werkingsmechanisme van treffers zowel te valideren als te bepalen. Naast het herhalen van de mAb24-tests, zal de totale CD18-expressie op het celoppervlak worden beoordeeld met behulp van een pan-antihumaan CD18-antilichaam. Het niveau van geactiveerde β2-integrine, zoals gemeten door mAb24, wordt genormaliseerd door de totale CD18-expressie. Dit zal ons in staat stellen om te bepalen of het werkingsmechanisme van het middel bestaat uit het antagoniseren van integrine-activering en/of het remmen van de expressie van CD18 op het celoppervlak. Er moet ook een levensvatbaarheidstest worden uitgevoerd in het secundaire scherm om eventuele toxische effecten van de treffers uit te sluiten.
Dit protocol heeft beperkingen. Ten eerste is mAb24 alleen in staat om het β2 I-achtige domein te detecteren in gevallen waarin de integrine zich in een toestand met hoge affiniteit bevindt. Daarom kan het geen α/β I-achtige allosterische antagonisten zoals lifitegrast identificeren door de mAb24-binding te verminderen. Lifitegrast induceert meer mAb24-binding32 en vertoont een abnormaal verhoogde MFI-waarde met mAb24 (Figuur 4). Voor dergelijke abnormale waarden kunnen andere tests nodig zijn om te verifiëren of deze treffers α/β I-achtige allosterische antagonisten zoals lifitegrast zijn. Ten tweede is de Z'-factor voor deze test suboptimaal en kan deze mogelijk worden verbeterd door het gebruik van automatisch pipetteren en roeren. Helaas beschikt ons laboratorium niet over de nodige apparatuur om deze hypothese te testen. Het dupliceren of verdrievoudigen van assays zal nuttig zijn bij het identificeren van vals-positieven en -negatieven in het geval dat de Z'-factor niet verder kan worden verbeterd met de bovenstaande methoden. Bovendien kan het nuttig zijn om de incubatietijd te verlengen om meer treffers te identificeren, zoals waargenomen met de bekende β2-integrine-activeringsremmer Nexinhib20, die een uur incubatie vereist om remmende effecten te produceren. Deze studie richtte zich op het identificeren van snelwerkende middelen. Onderzoekers moeten er rekening mee houden dat ze de incubatietijd kunnen aanpassen aan hun specifieke behoeften.
Voor zover wij weten, is dit de eerste high-throughput screeningsmethode voor β2-integrine-antagonisten. Deze benadering kan worden gebruikt om verbindingen met kleine moleculen te identificeren die rechtstreeks binden aan β2-integrinen en conformatieveranderingen te voorkomen die leiden tot integrinetoestanden met een gemiddelde/hoge affiniteit, vergelijkbaar met antagonisten zonder "agonistische" eigenschappen die onlangs zijn beschreven voor integrinen αIIbβ3 en α4β126. Neutrofielen zijn van cruciaal belang bij veel ontstekingsziekten, zoals myocardischemie-reperfusieletsel 36, sepsis37 en auto-immuunziekten38,39. Geneesmiddelen met kleine moleculen kunnen meer flexibiliteit bieden bij de behandeling van deze ziekten in vergelijking met geneesmiddelen op basis van antilichamen. Hits van ons scherm kunnen mogelijke behandelingen voor ontstekingsziekten bieden.
De huidige methode is een fluorescerend antilichaam-gebaseerde, high-throughput scherm. Aangezien er ook antilichamen van activeringsrapporteerders beschikbaar zijn voor β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 en αL-integrinen47,48,49,50, kan deze methode worden uitgebreid tot het identificeren van antagonisten voor andere integrinen. Een conformationeel gevoelig antilichaam zoals HUTS-21, dat bindt aan het β1 hybride domein 51,52,53, is gebruikt in een high-throughput screening om zeer late allosterische antagonisten van antigeen-4 (VLA-4, integrine α4β1) te identificeren54. De huidige screeningsmethode kan ook worden gewijzigd en uitgebreid om geneesmiddelen te vinden die de expressie van andere oppervlaktereceptoren remmen of bevorderen, zoals verbindingen die de oppervlakte-expressie van cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) op cystic fibrosis (CF)-cellen verhogen. Bij CF leiden meerdere mutaties tot misvouwing van CFTR, wat resulteert in afwezige expressie van CFTR op het celmembraan55. Van geneesmiddelen met kleine moleculen is aangetoond dat ze de CFTR-expressie herstellen56. Voor protocolwijzigingen is het noodzakelijk om de incubatietijd van geneesmiddelen te verlengen tot enkele uren om veranderingen in de eiwitexpressie mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.
Acknowledgments
We danken Dr. Evan Jellison en mevrouw Li Zhu in de flowcytometriekern bij UConn Health voor hun hulp bij flowcytometrie, Dr. Lynn Puddington van de afdeling Immunologie van UConn Health voor haar steun aan de instrumenten, mevrouw Slawa Gajewska en Dr. Paul Appleton in de klinische onderzoekskern bij UConn Health voor hun hulp bij het verkrijgen van bloedmonsters. We danken Dr. Christopher "Kit" Bonin en Dr. Geneva Hargis van de UConn School of Medicine voor hun hulp bij het wetenschappelijk schrijven en redigeren van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), VS, een Career Development Award van de American Heart Association (18CDA34110426) en een startfonds van UConn Health. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-channel pipettes | Thermo | 4661090N | Instrument |
| 384-well plate | Greiner | 784201 | Materials |
| APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 | BioLegend | 363410 | Reagents |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform | Agilent | 16050-102 | 384 multi-channel liquid handler |
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
| FlowJo | Becton, Dickinson & Company | NA | Software |
| Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
| Lifitegrast | Thermofisher | 50-208-2121 | Reagents |
| Nexinhib20 | Tocris | 6089 | Reagents |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | F3506 | Reagents |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagents |
| Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
| Plate shaker | Fisher | 88-861-023 | Instrument |
| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | Reagents |
| Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) | Prestwick Chemical Libraries | Ver19_384 | 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved) |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11-835-030 | Reagents |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad Laboratories | Model ZE5 | Instrument |
References
- Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
- Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
- Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
- Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
- Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
- Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
- Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
- Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
- Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
- Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
- Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
- Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
- Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
- Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
- Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
- Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
- Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
- Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
- Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
- Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
- Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
- Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
- Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
- Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
- Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
- Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
- Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
- Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
- Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
- Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
- Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
- Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
- Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
- Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
- Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
- Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
- Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
- Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
- Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
- Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
- Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
- Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
- Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
- Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
- Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
- Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
- van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
- Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
- Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
- Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
- Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
- Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).
