Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/64401
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4,5, 3,4, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

Summary

Ce protocole décrit une méthode de criblage à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour identifier les médicaments à petites molécules qui inhibent l’activation de l’intégrine β2 sur les neutrophiles humains.

Abstract

Ce protocole vise à établir une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2, en utilisant des anticorps rapporteurs de changement conformationnel et une cytométrie en flux à haut débit. La méthode peut également servir de guide pour d’autres méthodes de criblage à haut débit à base d’anticorps. Les intégrines β2 sont des molécules d’adhésion spécifiques aux leucocytes qui sont cruciales dans les réponses immunitaires. Les neutrophiles dépendent de l’activation de l’intégrine pour sortir de la circulation sanguine, non seulement pour combattre les infections, mais aussi pour être impliqués dans de multiples maladies inflammatoires. Le contrôle de l’activation de l’intégrine β2 présente une approche viable pour le traitement des maladies inflammatoires associées aux neutrophiles. Dans ce protocole, un anticorps monoclonal, mAb24, qui se lie spécifiquement à la coiffe de haute affinité des intégrines β2, est utilisé pour quantifier l’activation de l’intégrine β2 sur des neutrophiles humains primaires isolés. La N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP) est utilisée comme stimulus pour activer les intégrines β2 des neutrophiles. Un cytomètre en flux à haut débit capable d’analyser automatiquement des échantillons de plaques à 384 puits a été utilisé dans cette étude. Les effets de 320 produits chimiques sur l’inhibition de l’intégrine β2 sont évalués dans les 3 heures. Les molécules qui ciblent directement les intégrines β2 ou les molécules cibles dans la voie de signalisation d’activation de l’intégrine initiée par le récepteur couplé aux protéines G peuvent être identifiées grâce à cette approche.

Introduction

De nombreuses maladies inflammatoires sont caractérisées par l’infiltration de neutrophiles sur le site d’un gonflement ou d’une blessure1. Pour infiltrer ces tissus, les neutrophiles doivent compléter la cascade de recrutement des neutrophiles, qui implique l’arrêt de l’endothélium, l’extravasation à travers la paroi du vaisseau et le recrutement dans le tissu2. Les neutrophiles circulants ont besoin de l’activation de l’intégrine β2 pour compléter cette cascade, en particulier pour la phase d’arrêt. Ainsi, les médicaments inhibiteurs de l’intégrine qui réduisent l’adhésion, l’extravasation et le recrutement des neutrophiles peuvent traiter efficacement les maladies inflammatoires 3,4.

Les intégrines β2 ont déjà été ciblées pour des maladies inflammatoires. L’efalizumab, un anticorps monoclonal ciblant directement l’intégrine αLβ2, a été développé pour traiter le psoriasis5. Cependant, l’efalizumab a été retiré en raison de son effet secondaire mortel - une leucoencéphalopathie multifocale progressive résultant de la réactivation du virus JC 6,7. Les nouveaux traitements anti-inflammatoires à base d’intégrine devraient envisager de maintenir les fonctions anti-infectieuses des leucocytes afin de minimiser les effets secondaires. Les effets secondaires de l’efalizumab pourraient être dus à la circulation prolongée d’anticorps monoclonaux dans le sang, ce qui pourrait inhiber les fonctions immunitaires à long terme8. Une étude récente montre que l’efalizumab intervient dans la réticulation de l’αLβ2 et l’internalisation indésirable des intégrines α4, fournissant une explication alternative des effets secondaires9. Ainsi, les antagonistes à petites molécules à courte durée de vie pourraient éviter ce problème.

Une méthode à haut débit pour cribler les antagonistes de l’intégrine β2 de petites molécules à l’aide de neutrophiles humains est présentée ici. L’activation de l’intégrine β2 nécessite des changements conformationnels de l’ectodomaine de l’intégrine pour accéder à son ligand et augmenter son affinité de liaison avec celui-ci. Dans le modèle canonique à cran d’arrêt, l’ectodomaine de l’intégrine courbée-fermée s’étend d’abord jusqu’à une conformation étendue-fermée, puis ouvre sa coiffe à une conformation ouverte-étendue entièrement activée10,11,12,13. Il existe également une voie alternative qui part de la fermeture courbée à l’ouverture courbée et à l’ouverture étendue, éventuellement 14,15,16,17,18,19. L’anticorps spécifique de la conformation mAb24 se lie à un épitope dans le domaine humain de type β2-I lorsque la coiffe de l’ectodomaine est ouverte20,21,22,23.

Ici, mAb24-APC est utilisé pour déterminer si les intégrines β2 sont activées. Pour activer les neutrophiles et l’intégrine, la N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP), un peptide chimiotactique court d’origine bactérienne capable d’activer les intégrines β2 des neutrophiles24, est utilisée comme stimulus dans ce protocole. Lorsque fMLP se lie à Fpr1 sur les neutrophiles, des cascades de signalisation en aval impliquant des protéines G, la phospholipase Cβ et la phosphoinositide 3-kinase γ sont activées. Ces événements de signalisation aboutissent finalement à l’activation de l’intégrine via la voie de signalisation de l’intérieur vers l’extérieur18,25. Outre les antagonistes de petites molécules qui se lient directement aux intégrines β2 et empêchent les changements conformationnels de l’activation de l’intégrine26, des composés capables d’inhiber les composants de la voie de signalisation d’activation de l’intégrine β2 de l’intérieur vers l’extérieur seraient également détectés avec cette méthode. Les cytomètres en flux automatisés permettent un criblage à haut débit. L’identification de nouveaux antagonistes peut non seulement approfondir notre compréhension de la physiologie de l’intégrine, mais aussi fournir des informations translationnelles sur le traitement anti-inflammatoire à base d’intégrine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Des échantillons de sang total hépariné ont été obtenus auprès de donneurs humains sains anonymisés après avoir obtenu un consentement éclairé, tel qu’approuvé par l’Institutional Review Board de UConn Health, conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Le consentement éclairé de tous les donneurs a été obtenu. Les critères d’inclusion et d’exclusion de cette étude ont été soigneusement élaborés afin de s’assurer de la pertinence des participants et de minimiser les risques potentiels. Les participants admissibles étaient âgés de 18 à 65 ans, de toute origine ethnique, parlant couramment l’anglais et capables de donner un consentement éclairé. Les participants exclus comprenaient ceux qui n’étaient pas en mesure de donner un consentement éclairé pour eux-mêmes, comme ceux qui avaient besoin d’un représentant légalement autorisé, les personnes de moins de 18 ans ou de plus de 65 ans, les personnes incarcérées et les femmes enceintes. De plus, les participants devaient être exempts d’utilisation de médicaments anti-inflammatoires et de conditions inflammatoires. Les infections actuelles ou les affections inflammatoires chroniques ou aiguës persistantes étaient également des critères d’exclusion. Enfin, les personnes ayant des antécédents actuels ou récents d’infection à la COVID-19 n’étaient pas admissibles à l’étude. Ces critères ont été conçus pour assurer la sécurité et l’adéquation des participants tout en minimisant les facteurs de confusion potentiels qui pourraient avoir une incidence sur les résultats de l’étude.

1. Préparation des réactifs

  1. Milieu neutrophile : Préparer le milieu neutrophile en ajoutant 2 % d’albumine sérique humaine au RPMI-1640 sans rouge de phénol (voir le tableau des matériaux).
  2. Solution de fMLP : Préparer la solution de fMLP en la diluant 100 fois à partir de la solution de stockage de 10 mM de diméthylsulfoxyde de diméthyle (DMSO) de fMLP (voir le tableau des matériaux) avec RPMI 1640 sans rouge de phénol, ce qui donne une solution de 100 μM de fMLP.
  3. Solution d’anticorps : Diluer 120 μL d’anticorps monoclonal conjugué à l’allophycocyanine (APC) mAb24 (mAb24-APC) (voir le tableau des matériaux), qui fait état de la conformation de haute affinité de l’intégrine β2, dans 10 mL de milieu neutrophile, créant ainsi une solution de mAb24-APC à 1,2 μg/mL.
  4. Bibliothèque de composés : Diluer la bibliothèque initiale de composés avec une concentration de 10 mM à 1 mM en ajoutant 5 μL de la bibliothèque de 10 mM (voir le tableau des matériaux) à 45 μL de DMSO dans des plaques de 384 puits à l’aide du manipulateur de liquides. Par la suite, transférez 5 μL par puits de la bibliothèque de composés de 1 mM sur une plaque vide de 384 puits à l’aide du manipulateur de liquides.
  5. Comme l’illustre la figure 1, quatre colonnes (1, 2, 23, 24) ne contenaient que du DMSO, mais aucun composé, servant de témoins positifs et négatifs dans le criblage. Diluer davantage chaque puits en ajoutant 45 μL de RPMI-1640 sans rouge de phénol, ce qui donne une concentration finale de 100 μM pour tous les composés.

2. Isolement des neutrophiles du sang humain

  1. À l’aide d’une pipette sérologique, superposer soigneusement 4 mL de sang sur 8 mL d’un milieu à gradient de densité disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) dans un tube à centrifuger de 15 mL (figure 2A).
  2. Centrifuger le sang à 550 × g pendant 30-50 min à 20 °C. Décélérez progressivement le rotor (facteur de décélération de 1).
    REMARQUE : La séparation réussie des neutrophiles (bande 2 de la figure 2B) des globules rouges peut varier d’un donneur à l’autre. Pour la plupart des donneurs, une centrifugation de 30 minutes suffit. Cependant, pour certains donneurs, une centrifugation supplémentaire de 10 à 30 minutes peut être nécessaire si la séparation n’est pas réussie (Figure 2C).
  3. Retirez délicatement le plasma (le liquide jaune sur le dessus) et les cellules mononucléées (la bande trouble supérieure ; PBMC de la figure 2B) à l’aide d’une pipette de 1 mL.
  4. Recueillir les neutrophiles de la bande trouble inférieure (bande des neutrophiles sur la figure 2B) et à environ 3 à 4 mL sous le liquide clair dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez délicatement la suspension de neutrophiles en l’inversant 2 à 3 fois.
  5. Centrifuger la suspension à 400 × g pendant 10 min à 20 °C, puis retirer délicatement le surnageant par décantation.
  6. Remettre délicatement la pastille en suspension avec 5 mL de PBS et la centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 20 °C.
  7. Retirez le surnageant en le décantant et éliminez soigneusement tout surnageant résiduel autour de l’embouchure du tube et sur la paroi du tube à l’aide d’une aspiration sous vide. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu neutrophile.
  8. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. En règle générale, 1 à 4 × 107 neutrophiles ont été obtenus à partir de 8 mL de sang humain.
    REMARQUE : Il peut y avoir une contamination par les globules rouges dans la suspension de neutrophiles. Les globules rouges n’affectent pas de manière significative la plupart des tests et peuvent empêcher l’activation/l’amorçage des neutrophiles27. Les globules rouges doivent être lysés avant d’être comptés pour obtenir une concentration précise de neutrophiles. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire à 891 μL d’eau déminéralisée pendant 10 à 30 s pour lyser les globules rouges, puis ajouter 99 μL de PBS 10× pour équilibrer la pression osmotique, empêchant ainsi la lyse des neutrophiles.
  9. Ajustez la densité cellulaire à 6,25 × 105 cellules/mL en ajoutant du milieu neutrophile.

3. Préparation de la plaque à 384 puits

  1. Dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, mélanger 1 mL de solution d’anticorps (1,2 μg/mL de mAb24-APC) avec 0,2 mL de milieu neutrophile pour créer une solution de mAb24-APC de 1 μg/mL. Ensuite, ajoutez 25 μL de ce mélange dans les puits témoins négatifs d’une plaque à 384 puits (les puits bleus de la figure 1).
  2. Dans un tube à centrifuger de 15 mL, mélanger 9 mL de la solution d’anticorps avec 21,6 μL de solution fMLP (100 μM) et 1,7784 mL de milieu neutrophile pour créer une solution contenant 1 μg/mL de mAb24-APC et 200 nM de fMLP. Ensuite, ajoutez 25 μL de ce mélange dans les puits témoins positifs et d’essai dans une plaque de 384 puits (les puits rouge et bleu de la figure 1).
  3. Transférez 5 μL des solutions composées de 100 μM de la plaque de la bibliothèque de composés à la plaque de 384 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
  4. Centrifuger le liquide pendant 1 min à 500 × g, à température ambiante.
    REMARQUE : Pour centrifuger les plaques, un rotor à godets oscillants et des godets à plaques sont nécessaires.

4. Traitement des cellules

  1. Ajouter 20 μL de suspension de neutrophiles dans chaque puits à l’aide d’une pipette à 16 canaux (plage de 5 à 50 μL, pour chaque colonne de la plaque à 384 puits). Mélangez délicatement 5 à 10 fois à l’aide de la pipette, en maintenant un intervalle de temps constant entre chaque pipetage.
    NOTA : Les concentrations finales dans les puits sont les suivantes : neutrophiles 2,5 × 105 cellules/mL (tous les puits) ; mAb24-APC 0,5 μg/mL (tous les puits) ; fMLP 100 nM (puits de contrôle positif et d’essai) ; composés 10 μM (puits d’essai).
  2. Incuber la plaque sur un shaker à 300 tr/min, à température ambiante (RT), pendant 10 min.
  3. Fixez les cellules en ajoutant 3 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 16 % dans chaque puits à l’aide d’une pipette à 16 canaux (concentration finale de PFA ~0,91 %). Ensuite, incuber sur glace pendant 10 min.
    REMARQUE : Il est recommandé de maintenir un intervalle de temps constant entre les différentes colonnes lors de l’ajout de neutrophiles et de PFA. Cela garantit que les neutrophiles de chaque puits ont le même temps d’incubation avec fMLP et mAb24-APC.

5. Cytométrie en flux

  1. Mettez le cytomètre en flux sous tension (voir Tableau des matériaux) et assurez-vous que l’ordinateur connecté à l’instrument est également allumé.
  2. Assurez-vous que le réservoir de liquide de la gaine est rempli et que le conteneur à déchets est vide et correctement connecté à l’instrument.
  3. Chargez la plaque à 384 puits sur le chargeur d’échantillons du cytomètre en flux. Assurez-vous que le puits A1 de la plaque est aligné avec le repère A1 sur le chargeur.
  4. Ouvrez le logiciel et créez une nouvelle expérience. Sélectionnez le puits 384 et choisissez les fluorophores souhaités. Ensuite, cliquez sur Configuration de la plaque, faites glisser pour sélectionner tous les puits, puis cliquez sur Échantillon. Activez le commutateur « Débit élevé » et sélectionnez Haut sous le panneau de débit.
    1. Dans la zone de volume, entrez 50. Sélectionnez les échantillons dans des colonnes impaires, puis activez le commutateur « Agitation ». Enfin, nommez les échantillons dans le panneau de droite.
  5. Cliquez sur Tracer et porte. Ensuite, cliquez sur le bouton Appliquer (deux flèches sur un cercle rempli de vert), puis cliquez sur le bouton de lecture (forme triangulaire). Attendez quelques secondes pour observer quelques cellules du premier puits, puis cliquez sur le bouton pause .
    1. Ajustez les tensions FSC et SSC pour assurer une bonne visualisation des cellules sur le tracé. Cliquez sur Acquisition, puis cliquez sur le bouton de lecture (forme triangulaire) pour lancer le test.
  6. Le cytomètre en flux échantillonnera séquentiellement ~50 μL de 1000 à 3000 neutrophiles de chaque puits. Il faudra environ 3 h pour compléter l’ensemble de la plaque de 384 puits.
  7. Une fois tous les exemples terminés, exportez les fichiers .fcs pour passer à l’étape suivante.

6. Analyse des données

  1. Ouvrez le logiciel d’analyse des données de cytométrie en flux (voir Table des matériaux). Sélectionnez et faites glisser le dossier contenant tous les fichiers .fcs dans la fenêtre du logiciel, puis relâchez-le pour importer les données dans le logiciel.
  2. Double-cliquez sur un échantillon, mettez en grille les neutrophiles simples basés sur FSC et SSC28,29,30 dans la fenêtre contextuelle, comme illustré à la figure 3. Sélectionnez les lignes fermées et faites-les glisser vers le dossier, puis relâchez-les pour appliquer la barrière à tous les échantillons de ce dossier.
  3. Calculez et exportez l’intensité de fluorescence médiane (MFI) APC des neutrophiles de chaque puits à l’aide de la fonction d’édition de table du logiciel. Cliquez sur Ajouter une colonne sous l’onglet Modifier . Sélectionnez Médiane dans l’onglet Statistique , choisissez les neutrophiles de population contrôlés, puis sélectionnez APC comme paramètre. Cliquez sur le bouton OK .
  4. Retournez à l’onglet « Editeur de table », sélectionnez Tous les échantillons dans l’onglet « Groupe » et appuyez sur le bouton Créer une table . Une nouvelle fenêtre apparaîtra affichant le tableau créé. Enregistrez-le sous forme de fichier texte, CSV ou Excel.
  5. Ouvrez le tableau exporté, calculez la valeur moyenne et l’écart-type de l’IMF APC pour les échantillons témoins positifs et négatifs (Figure 4).
  6. Calculer le facteur Z' (Z') de la plaque à l’aide de l’équation :
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
    où σ p et σ n sont les écarts-types des témoins positifs et négatifs, respectivement, et μp et μn sont les moyennes des témoins positifs et négatifs, respectivement31.
    NOTE : Le facteur Z' indique la séparation des distributions de contrôle positives et négatives. Un Z' de 0 signifie qu’il n’y a pas de séparation, tandis qu’un Z' de 0,5 indique une séparation égale. Comme mentionné dans une étude précédente31, le > de Z de 0,5 indique un excellent test pour le criblage des composés. Un Z' compris entre 0,5 et 0 est acceptable, mais il se peut qu’il n’identifie que des résultats forts dans le test, ce qui nécessitera une validation supplémentaire dans les tests secondaires.
  7. Considérer les composés comme des « résultats » pour le criblage lorsque l’IMF APC des neutrophiles traités par composé est inférieur à trois fois l’écart-type de l’IMF témoin positif soustrait de l’IMF témoin positif (P = 0,0013, représenté par la ligne pointillée de la figure 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les données d’un criblage représentatif de plaques à 384 puits (Figure 4) ont révélé que les témoins négatifs avaient une MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, tandis que les témoins positifs avaient une MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. Le facteur Z' de cette plaque est d’environ 0,33, ce qui se situe dans une plage acceptablede 31. Cependant, Z' nécessite une validation supplémentaire dans les tests secondaires.

Pour normaliser les données, toutes les valeurs ont été mises à l’échelle pour attribuer une valeur maximale de 1 à la moyenne positive et une valeur minimale de 0 à la moyenne négative. Le facteur Z' fera l’objet d’une validation plus rigoureuse dans les tests secondaires. Le seuil pour cette plaque est fixé à 0,41, ce qui signifie que les échantillons avec une MFI relative inférieure à 0,41 seront considérés comme des hits inhibant l’activation de l’intégrine β2 induite par fMLP dans les neutrophiles humains. Aucune correspondance n’a été identifiée à partir de cette plaque.

Pour confirmer l’efficacité du protocole, Nexinhib20, qui inhibe l’activation de l’intégrine β2 en antagonisant la fonction Rac-1, et lifitegrast, qui antagonise directement l’intégrine αLβ232,33, ont été utilisés. Cependant, les temps d’incubation ont été ajustés à une heure pour Nexinhib20 et à une demi-heure pour lifitegrast. Les données obtenues de ces expériences ont été normalisées à l’aide de la même méthode de mise à l’échelle que celle décrite ci-dessus. Ces points de données ont ensuite été combinés avec les résultats de la plaque et analysés collectivement (figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Disposition des plaques pour le criblage composé. Diagramme schématique illustrant la disposition des composés de criblage et des témoins dans une plaque à 384 puits. Les puits témoins négatifs sont représentés en bleu (colonnes 1 et 23) et les puits témoins positifs sont représentés en rouge (colonnes 2 et 24). Les puits d’essai sont représentés en beige (colonnes 3 à 22). Les flèches indiquent l’ordre de lecture de la plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Séparation des neutrophiles à l’aide d’un milieu à gradient de densité. Photos représentatives démontrant la séparation réussie et infructueuse des neutrophiles à l’aide d’un milieu à gradient de densité. (A) Initialement, 4 mL de sang sont superposés sur 8 mL de milieu à gradient de densité. (B) Après centrifugation, deux bandes troubles doivent être visibles : la bande supérieure contenant principalement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et la bande inférieure contenant principalement des neutrophiles avec quelques globules rouges (GR). La plupart des globules rouges sont granulés au fond. (C) Une séparation infructueuse lorsque les globules rouges ne sont pas granulés et que la bande des neutrophiles n’est pas observée. Une centrifugation supplémentaire (10 à 30 min) serait nécessaire pour séparer la bande des neutrophiles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Déclenchement des neutrophiles à l’aide de diagrammes FSC/SSC. Diagrammes représentatifs de diffusion vers l’avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC) illustrant la stratégie de déclenchement pour l’identification des neutrophiles. (A) Les neutrophiles sont contrôlés en fonction de la zone de diffusion directe (FSC-A) et latérale (SSC-A) enregistrée par le cytomètre en flux. (B) Les cellules individuelles sont en outre fermées en fonction de la largeur (FSC-W) et de la hauteur (FSC-H) de la diffusion vers l’avant, et (C) de la largeur (SSC-W) et de la hauteur (SSC-H) de la diffusion latérale. L’échelle de couleurs représente la densité des cellules, passant du rouge au jaune, au vert et au bleu à mesure que la densité diminue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats du criblage dans une plaque représentative de 384 puits. Les résultats du criblage proviennent d’une plaque représentative de 384 puits, démontrant un facteur Z' de 0,3. Les contrôles négatifs et positifs sont indiqués par des points bleus et rouges, respectivement. Les échantillons d’essai traités avec divers composés sont représentés par des points beiges. La ligne pointillée représente le seuil moyen d’intensité de fluorescence (MFI) pour identifier les correspondances. Aucun des composés testés n’a été identifié comme antagoniste de l’intégrine β2, car tous les composés testés présentaient des valeurs MFI supérieures à la ligne de coupure. Les résultats d’expériences indépendantes testant des antagonistes connus de l’intégrine β2 avec des temps d’incubation variables (Nexinhib20 pendant 1 h, lifitegrast pendant une demi-heure) sont regroupés pour être présentés dans cette figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L’initiation et l’arrêt de la stimulation et de la coloration des neutrophiles sont déterminés par l’ajout de neutrophiles et du PFA fixateur. Par conséquent, il est essentiel d’assurer le même intervalle de temps entre le pipetage des neutrophiles ou de l’APF dans chaque colonne. Cela garantit que le temps de stimulation et de coloration des neutrophiles de chaque puits reste constant. En raison de la courte durée de vie des neutrophiles, l’ensemble de l’expérience, de la collecte de sang des donneurs à la cytométrie en flux, doit être réalisée le même jour. Les neutrophiles sont très sensibles aux changements de température et peuvent s’activer lorsqu’ils sont exposés à des augmentations rapides de température, telles que le passage de 4 °C à la température ambiante ou de la température ambiante à 37 °C. De plus, d’après notre expérience antérieure, l’activation de l’intégrine β2 des neutrophiles induite par le fMLP ne se produit pas lorsque les cellules sont stockées sur de la glace ou à 4 °C (données non présentées). Par conséquent, avant la fixation, le sang total et les neutrophiles doivent être conservés à température ambiante ou à 20 °C (pendant l’étape de centrifugation d’isolement). Ne placez pas de sang total et de neutrophiles sur de la glace.

La coloration de mAb24 chez les témoins négatifs devrait donner des résultats très faibles. Si un niveau élevé de coloration au mAb24 est observé au cours d’une expérience, veuillez vérifier les points suivants : (1) s’il y a eu un changement de température significatif pendant l’expérience avant la fixation ; (2) s’il y avait une contamination par la fMLP ou les endotoxines dans le milieu neutrophile ; (3) si la manipulation des échantillons a été trop agressive, par exemple en générant des bulles pendant le pipetage et le mélange.

Le protocole actuel utilise mAb24 pour signaler l’ouverture de la coiffe d’intégrine β2. Théoriquement, KIM127, un anticorps monoclonal rapportant l’extension des intégrines β2 34,35, peut être utilisé en conjonction avec mAb24 pour évaluer de manière exhaustive la conformation de l’intégrine β2. Cependant, le rapport signal/bruit de la coloration KIM127 (1,5 à 2 fois) n’est pas aussi favorable que celui du mAb24 (5 à 10 fois), qui ne fournit généralement pas un facteur Z' satisfaisant dans le test sur plaque à 384 puits. Dans le test sur plaque à 96 puits, les échantillons peuvent être lavés avant d’effectuer une cytométrie en flux, ce qui réduit les signaux de fond dérivés d’anticorps solubles. Par conséquent, l’analyse basée sur KIM127 peut être effectuée dans l’analyse sur plaque à 96 puits, qui a un débit inférieur à celui de l’analyse sur plaque à 384 puits.

Étant donné que cette méthode utilise l’intensité de fluorescence comme lecture pour évaluer l’effet inhibiteur de l’intégrine des médicaments, certains médicaments fluorescents peuvent interférer avec les résultats. De plus, les médicaments toxiques qui induisent la mort des neutrophiles au cours de la période de stimulation de 10 minutes sembleront également signaler une inhibition de l’intégrine. Les médicaments qui inhibent la dégranulation des neutrophiles supprimeront l’expression globale de l’intégrine β2. Ces inhibiteurs de dégranulation seront également identifiés dans notre criblage. Par conséquent, un dépistage secondaire avec d’autres témoins est nécessaire pour confirmer les effets inhibiteurs des hits. Les écrans secondaires sont référencés comme un moyen à la fois de valider et de déterminer le mécanisme d’action des coups. En plus de répéter les tests mAb24, l’expression totale de CD18 à la surface de la cellule sera évaluée à l’aide d’un anticorps anti-CD18 pan humain. Le niveau d’intégrine β2 activée, tel que mesuré par mAb24, sera normalisé par l’expression totale de CD18. Cela nous permettra de déterminer si le mécanisme d’action de l’agent implique une activation antagoniste de l’intégrine et/ou une inhibition de l’expression de CD18 à la surface de la cellule. Un test de viabilité doit également être effectué dans le crible secondaire afin d’exclure tout effet toxique des résultats.

Ce protocole a des limites. Tout d’abord, mAb24 n’est capable de détecter le domaine β2 I-like que dans les cas où l’intégrine est dans un état de haute affinité. Par conséquent, il ne peut pas identifier les antagonistes allostériques de type I α/β tels que le lifitegrast en diminuant la liaison mAb24. Le lifitegrast induit une plus grande liaison de mAb2432 et montre une valeur MFI anormalement élevée avec mAb24 (Figure 4). Pour de telles valeurs anormales, d’autres tests peuvent être nécessaires pour vérifier si ces résultats sont des antagonistes allostériques de type I α/β comme le lifitegrast. Deuxièmement, le facteur Z' de ce test est sous-optimal et pourrait potentiellement être amélioré par l’utilisation du pipetage et de l’agitation automatiques. Malheureusement, notre laboratoire ne dispose pas de l’équipement nécessaire pour tester cette hypothèse. La duplication ou la triple des analyses sera utile pour identifier les faux positifs et négatifs au cas où le facteur Z' ne pourrait pas être amélioré avec les méthodes ci-dessus. De plus, il peut être bénéfique de prolonger le temps d’incubation pour identifier plus de hits, comme on l’a observé avec l’inhibiteur connu de l’activation de l’intégrine β2 Nexinhib20, qui nécessite une heure d’incubation pour produire des effets inhibiteurs. Cette étude s’est concentrée sur l’identification des agents à action rapide. Les chercheurs doivent noter qu’ils peuvent modifier la durée d’incubation en fonction de leurs besoins spécifiques.

À notre connaissance, il s’agit de la première méthode de criblage à haut débit des antagonistes de l’intégrine β2. Cette approche pourrait être utilisée pour identifier des composés de petites molécules qui se lient directement aux intégrines β2 et empêchent les changements conformationnels conduisant à des états d’intégrine de moyenne / haute affinité, similaires aux antagonistes sans propriétés « agonistes » récemment décrites pour les intégrines αIIbβ3 et α4β126. Les neutrophiles sont essentiels dans de nombreuses maladies inflammatoires, telles que l’ischémie-reperfusion myocardique 36, la septicémie37 et les maladies auto-immunes38,39. Les médicaments à petites molécules peuvent offrir plus de souplesse dans le traitement de ces maladies que les médicaments à base d’anticorps. Les résultats de notre criblage pourraient fournir des traitements potentiels pour les maladies inflammatoires.

La méthode actuelle est un criblage à haut débit à base d’anticorps fluorescents. Étant donné que des anticorps rapporteurs d’activation sont également disponibles pour les intégrines β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 et αL 47,48,49,50, cette méthode peut être étendue à l’identification d’antagonistes pour d’autres intégrines. Un anticorps sensible au conformationnement comme HUTS-21, qui se lie au domaine hybride β1 51,52,53, a été utilisé dans un criblage à haut débit pour identifier les antagonistes allostériques de l’antigène 4 très tardif (VLA-4, intégrine α4β1) 54. La méthode de criblage actuelle peut également être modifiée et étendue pour trouver des médicaments qui inhibent ou favorisent l’expression d’autres récepteurs de surface, tels que des composés qui augmentent l’expression de surface du régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) de la fibrose kystique sur les cellules de fibrose kystique (FK). Dans la mucoviscidose, de multiples mutations entraînent un mauvais repliement de CFTR, ce qui entraîne une absence d’expression de CFTR sur la membrane cellulaire55. Il a été démontré que les médicaments à petites molécules restaurent l’expression de CFTR56. Pour les modifications du protocole, il est nécessaire d’augmenter le temps d’incubation des médicaments à plusieurs heures pour permettre aux changements d’expression des protéines de se produire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Evan Jellison et Mme Li Zhu du centre de cytométrie en flux de UConn Health pour leur aide en matière de cytométrie en flux, le Dr Lynn Puddington du département d’immunologie de UConn Health pour son soutien aux instruments, Mme Slawa Gajewska et le Dr Paul Appleton du noyau de recherche clinique de UConn Health pour leur aide dans l’obtention d’échantillons de sang. Nous remercions le Dr Christopher « Kit » Bonin et la Dre Geneva Hargis de l’École de médecine de l’UConn pour leur aide dans la rédaction scientifique et l’édition de ce manuscrit. Cette recherche a été financée par des subventions des National Institutes of Health, du National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), de l’Institut national des sciences médicales générales (P20GM121176), aux États-Unis, d’un prix de développement de carrière de l’American Heart Association (18CDA34110426) et d’un fonds de démarrage de UConn Health. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Immunologie et infection numéro 204
Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L.… More

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter