Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En flödescytometribaserad high-throughput-teknik för screening av integrinhämmande läkemedel

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/64401
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4,5, 3,4, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Center for Molecular Discovery, University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center, University of New Mexico

Summary

Detta protokoll beskriver en flödescytometribaserad screeningmetod med hög genomströmning för att identifiera småmolekylära läkemedel som hämmar β2-integrinaktivering på humana neutrofiler.

Abstract

Detta protokoll syftar till att etablera en metod för att identifiera små molekylära antagonister av β2-integrinaktivering, med hjälp av antikroppar som rapporterar konformationsförändringar och flödescytometri med hög genomströmning. Metoden kan också fungera som en guide för andra antikroppsbaserade screeningmetoder med hög kapacitet. β2-integriner är leukocytspecifika adhesionsmolekyler som är avgörande för immunsvar. Neutrofiler är beroende av integrinaktivering för att lämna blodomloppet, inte bara för att bekämpa infektioner utan också för att vara involverade i flera inflammatoriska sjukdomar. Att kontrollera aktiveringen av β2-integrin är ett gångbart tillvägagångssätt för behandling av neutrofilassocierade inflammatoriska sjukdomar. I detta protokoll används en monoklonal antikropp, mAb24, som specifikt binder till högaffinitetsstycket i β2-integriner, för att kvantifiera β2-integrinaktivering på isolerade primära humana neutrofiler. N-formylmetionylleucylfenylalanin (fMLP) används som en stimulans för att aktivera neutrofila β2-integriner. En flödescytometer med hög genomströmning som automatiskt kan köra 384-brunnars plattprover användes i denna studie. Effekterna av 320 kemikalier på hämning av β2-integrin bedöms inom 3 timmar. Molekyler som direkt riktar sig mot β2-integriner eller målmolekyler i den G-proteinkopplade receptorinitierade integrin-inifrån och ut-aktiveringssignalvägen kan identifieras genom detta tillvägagångssätt.

Introduction

Många inflammatoriska sjukdomar kännetecknas av infiltration av neutrofiler på platsen för svullnad eller skada1. För att infiltrera dessa vävnader måste neutrofiler slutföra neutrofilrekryteringskaskaden, vilket innebär att endotelet arresteras, extravasering över kärlväggen och rekrytering till vävnad2. Cirkulerande neutrofiler behöver β2-integrinaktivering för att fullborda denna kaskad, särskilt för stoppfasen. Integrinhämmande läkemedel som minskar adhesion, extravasering och rekrytering av neutrofila granulocyter kan således effektivt behandla inflammatoriska sjukdomar 3,4.

β2-integriner har tidigare varit måltavla för inflammatoriska sjukdomar. Efalizumab, en monoklonal antikropp som direkt riktar sig mot integrin αLβ2, utvecklades för att behandla psoriasis5. efalizumab sattes dock ut på grund av dess dödliga biverkning - progressiv multifokal leukoencefalopati till följd av reaktivering av JC-virus 6,7. Nya antiinflammatoriska integrinbaserade terapier bör överväga att upprätthålla leukocyternas infektionshämmande funktioner för att minimera biverkningarna. Biverkningarna av efalizumab kan bero på den förlängda cirkulationen av monoklonala antikroppar i blodomloppet, vilket kan hämma immunfunktioner på lång sikt8. En nyligen genomförd studie visar att efalizumab medierar αLβ2-tvärbindning och oönskad internalisering av α4-integriner, vilket ger en alternativ förklaring till biverkningarna9. Således kan kortlivade, småmolekylära antagonister undvika detta problem.

En storskalig metod för att screena småmolekylära β2-integrinantagonister med hjälp av humana neutrofiler presenteras här. β2-integrinaktivering kräver konformationsförändringar av integrinektodomänen för att få tillgång till och öka dess bindningsaffinitet till dess ligand. I den kanoniska switchblade-modellen sträcker sig den böjda integrinektodomänen först till en utsträckt-sluten konformation och öppnar sedan sitt huvudstycke till en fullt aktiverad utsträckt-öppen konformation10,11,12,13. Det finns också en alternativ väg som börjar från den böjda stängda till böjd-öppen och utsträckt-öppen, så småningom 14,15,16,17,18,19. Den konformationsspecifika antikroppen mAb24 binder till en epitop i den humana β2-I-liknande domänen när ektodomänens huvudstycke är öppet20,21,22,23.

Här används mAb24-APC för att avgöra om β2-integrinerna är aktiverade. För att aktivera neutrofiler och integrin används N-formylmetionyl-leucylfenylalanin (fMLP), en bakteriehärledd kort kemotaktisk peptid som kan aktivera neutrofila β2-integriner24, som en stimulans i detta protokoll. När fMLP binder till Fpr1 på neutrofiler aktiveras nedströms signalkaskader som involverar G-proteiner, fosfolipas Cβ och fosfoinositid-3-kinas γ. Dessa signaleringshändelser resulterar i slutändan i integrinaktivering via inifrån och ut-signalvägen18,25. Förutom småmolekylära antagonister som direkt binder till β2-integriner och förhindrar konformationsförändringar av integrinaktivering26, skulle föreningar som kan hämma komponenter i β2-integrin-inifrån och ut-aktiveringssignalvägen också detekteras med denna metod. Automatiserade flödescytometrar möjliggör screening med hög genomströmning. Att identifiera nya antagonister kan inte bara fördjupa vår förståelse av integrinfysiologi utan också ge translationell insikt i integrinbaserad antiinflammatorisk terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hepariniserade helblodsprover erhölls från avidentifierade friska mänskliga donatorer efter att ha erhållit informerat samtycke, som godkänts av Institutional Review Board of UConn Health, i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen. Informerat samtycke inhämtades från alla donatorer. Inklusions-/exklusionskriterierna för denna studie har noggrant utvecklats för att säkerställa deltagarnas lämplighet och för att minimera potentiella risker. Berättigade deltagare var mellan 18 och 65 år, av alla etniciteter, talade flytande engelska och kunde ge informerat samtycke. Uteslutna deltagare inkluderade de som inte kunde ge informerat samtycke för sig själva, till exempel de som kräver en lagligt auktoriserad representant, personer under 18 år eller över 65 år, fängslade personer och gravida kvinnor. Dessutom var deltagarna tvungna att vara fria från användning av antiinflammatoriska läkemedel och inflammatoriska tillstånd. Pågående infektioner eller pågående kroniska eller akuta inflammatoriska tillstånd var också exklusionskriterier. Slutligen var individer med en aktuell eller nyligen genomförd historia av covid-19-infektion inte kvalificerade för studien. Dessa kriterier utformades för att säkerställa deltagarnas säkerhet och lämplighet samtidigt som potentiella förväxlingsfaktorer som kan påverka studieresultaten minimeras.

1. Beredning av reagenser

  1. Neutrofilmedium: Bered neutrofilmediet genom att tillsätta 2 % humant serumalbumin till RPMI-1640 utan fenolrött (se materialförteckning).
  2. fMLP-lösning: Bered fMLP-lösningen genom att späda den 100 gånger från 10 mM fMLP-dimetylsulfoxid (DMSO) lagringslösning (se Materialtabell) med RPMI 1640 utan fenolrött, vilket ger en 100 μM fMLP-lösning.
  3. Antikroppslösning: Späd 120 μl allophycocyanin (APC)-konjugerad monoklonal antikropp mAb24 (mAb24-APC) (se materialtabell), som rapporterar den höga affinitetskonformationen av β2-integrin, i 10 ml neutrofilmedium, vilket skapar en 1,2 μg/ml mAb24-APC-lösning.
  4. Föreningsbibliotek: Späd det ursprungliga föreningsbiblioteket med en koncentration på 10 mM till 1 mM genom att tillsätta 5 μL av 10 mM-biblioteket (se materialtabell) till 45 μL DMSO i 384-brunnars plattor med hjälp av vätskehanteraren. Överför därefter 5 μL per brunn i 1 mM föreningsbiblioteket till en tom 384-hålsplatta med hjälp av vätskehanteraren.
  5. Som illustreras i figur 1 innehöll fyra kolumner ( 1, 2, 23, 24) endast DMSO men inga föreningar, som fungerade som positiva och negativa kontroller vid screeningen. Späd varje brunn ytterligare genom att tillsätta 45 μL RPMI-1640 utan fenolrött, vilket resulterar i en slutlig koncentration på 100 μM för alla föreningar.

2. Neutrofilisolering från humant blod

  1. Använd en serologisk pipett och lägg försiktigt 4 ml blod över 8 ml av ett kommersiellt tillgängligt densitetsgradientmedium (se materialtabell) i ett 15 ml centrifugrör (figur 2A).
  2. Centrifugera blodet vid 550 × g i 30-50 minuter vid 20 °C. Bromsa rotorn gradvis (retardationsfaktor 1).
    OBS: Den framgångsrika separationen av neutrofiler (grupp 2 i figur 2B) från röda blodkroppar kan variera mellan givare. För de flesta donatorer räcker det med en centrifugering på 30 minuter. För vissa donatorer kan det dock krävas ytterligare 10–30 minuters centrifugering om separeringen inte lyckas (figur 2C).
  3. Ta försiktigt bort plasman (den gula vätskan ovanpå) och mononukleära celler (det övre grumliga bandet; PBMC-bandet i figur 2B) med en 1 ml pipett.
  4. Samla upp neutrofiler från det nedre grumliga bandet (neutrofilbandet i figur 2B) och cirka 3-4 ml under den klara vätskan i ett 15 ml centrifugrör som innehåller 10 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Blanda försiktigt den neutrofila suspensionen genom att vända den 2-3 gånger.
  5. Centrifugera suspensionen vid 400 × g i 10 minuter vid 20 °C och avlägsna sedan försiktigt supernatanten genom dekantering.
  6. Återsuspendera pelleten försiktigt med 5 ml PBS och centrifugera den vid 300 × g i 5 minuter vid 20 °C.
  7. Ta bort supernatanten genom dekantering och eliminera försiktigt eventuella kvarvarande supernatanter runt sondens mynning och på sondens vägg med hjälp av vakuumsugning. Återsuspendera pelleten i 1 ml neutrofilmedium.
  8. Räkna cellantalet med hjälp av en hemocytometer. Vanligtvis erhölls 1 till 4 × 107 neutrofiler från 8 ml humant blod.
    OBS: Det kan förekomma kontaminering av röda blodkroppar i neutrofilsuspensionen. Röda blodkroppar påverkar inte signifikant de flesta analyser och kan förhindra neutrofilaktivering/priming27. Röda blodkroppar måste lyseras före räkning för att få en korrekt koncentration av neutrofila granulocyter. Tillsätt 10 μL av cellsuspensionen till 891 μL avjoniserat vatten i 10-30 s för att lysera de röda blodkropparna, tillsätt sedan 99 μL 10× PBS för att balansera det osmotiska trycket och förhindra lys av neutrofilerna.
  9. Justera celldensiteten till 6,25 × 105 celler/ml genom att tillsätta neutrofilmedium.

3. Förberedelse av plattan med 384 brunnar

  1. I ett 1,5 ml centrifugrör kombineras 1 ml antikroppslösning (1,2 μg/ml mAb24-APC) med 0,2 ml neutrofilmedium för att skapa en 1 μg/ml mAb24-APC-lösning. Tillsätt sedan 25 μl av denna blandning till de negativa kontrollbrunnarna i en 384-hålars platta (de blå brunnarna i figur 1).
  2. Blanda 9 ml antikroppslösning med 21,6 μl fMLP-lösning (100 μM) och 1,7784 ml neutrofilmedium i ett 15 ml centrifugrör för att skapa en lösning som innehåller 1 μg/ml mAb24-APC och 200 nM fMLP. Tillsätt sedan 25 μl av denna blandning till de positiva kontroll- och testbrunnarna i en 384-hålsplatta (de röda och blå brunnarna i figur 1).
  3. Överför 5 μL av 100 μM sammansatta lösningar från den sammansatta biblioteksplattan till 384-hålsplattan med hjälp av en flerkanalspipett.
  4. Centrifugera vätskan i 1 minut vid 500 × g, vid rumstemperatur.
    OBS: För att centrifugera plattor krävs en svängskopa och plattskopor.

4. Behandling av celler

  1. Tillsätt 20 μl neutrofilsuspension till varje brunn med hjälp av en 16-kanals pipett (5-50 μL-intervall för varje kolonn i 384-hålsplattan). Blanda försiktigt 5-10 gånger med pipetten, med ett konsekvent tidsintervall mellan varje pipettering.
    OBS: De slutliga koncentrationerna i brunnarna är följande: neutrofiler 2,5 × 105 celler/ml (alla brunnar); mAb24-APC 0,5 μg/ml (alla brunnar); fMLP 100 nM (positiva kontroll- och testbrunnar). föreningar 10 μM (testbrunnar).
  2. Inkubera plattan på en shaker vid 300 rpm, vid rumstemperatur (RT), i 10 min.
  3. Fixera cellerna genom att tillsätta 3 μL 16 % paraformaldehyd (PFA) till varje brunn med en 16-kanals pipett (slutlig PFA-koncentration ~0,91 %). Inkubera sedan på is i 10 minuter.
    OBS: Det rekommenderas att hålla ett konsekvent tidsintervall mellan olika kolonner vid tillsats av neutrofiler och PFA. Detta säkerställer att neutrofiler i varje brunn har samma inkubationstid med fMLP och mAb24-APC.

5. Flödescytometri

  1. Slå på flödescytometern (se materialtabell) och se till att datorn som är ansluten till instrumentet också är påslagen.
  2. Se till att mantelvätskebehållaren är fylld och att avfallsbehållaren är tom och korrekt ansluten till instrumentet.
  3. Ladda 384-hålsplattan på sample laddare på flödescytometern. Se till att plattans A1-brunn är i linje med A1-märket på lastaren.
  4. Öppna programvaran och skapa ett nytt experiment. Välj 384 brunn och välj önskade fluoroforer. Klicka sedan på Plattinställning, dra för att välja alla brunnar och klicka sedan på Sample. Aktivera växeln "Högt dataflöde" och välj Hög under prispanelen.
    1. I volymrutan anger du 50. Välj samplingar i kolumner med udda nummer och aktivera sedan omkopplaren "Agitation". Namnge slutligen exemplen i den högra panelen.
  5. Klicka på Tomt och grind. Klicka sedan på knappen Verkställ (två pilar på en grönfylld cirkel) och klicka sedan på uppspelningsknappen (triangelform). Vänta några sekunder för att observera några celler från den första brunnen och klicka sedan på pausknappen .
    1. Justera FSC- och SSC-spänningarna för att säkerställa korrekt visualisering av celler på diagrammet. Klicka på Förvärv och klicka sedan på uppspelningsknappen (triangelform) för att starta analysen.
  6. Flödescytometern kommer sekventiellt att ta prov på ~50 μL 1000-3000 neutrofiler från varje brunn. Det tar cirka 3 timmar att färdigställa hela plattan med 384 brunnar.
  7. När du har slutfört alla exempel exporterar du .fcs-filerna för nästa steg.

6. Analys av data

  1. Öppna programvaran för analys av flödescytometridata (se materialförteckning). Markera och dra mappen som innehåller alla .fcs-filer till programvarufönstret och släpp sedan för att importera data till programvaran.
  2. Dubbelklicka på ett sample, gate single neutrophils baserat på FSC och SSC28,29,30 i det poppade fönstret, som visas i figur 3. Markera de grindade raderna och dra dem till mappen och släpp sedan för att tillämpa grinden på alla exempel i mappen.
  3. Beräkna och exportera APC-medianfluorescensintensiteten (MFI) för neutrofiler från varje brunn med hjälp av programvarans tabellredigeringsfunktion. Klicka på Lägg till kolumn under fliken Redigera . Välj Median på fliken Statistik , välj den skyddade populationen neutrofiler och välj APC som parameter. Klicka på OK-knappen .
  4. Gå tillbaka till fliken "Tabellredigerare", välj Alla exempel på fliken "Grupp" och tryck på knappen Skapa tabell . Ett nytt fönster visas som visar den skapade tabellen. Spara den som en text-, CSV- eller Excel-fil.
  5. Öppna den exporterade tabellen, beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för APC MFI för de positiva och negativa kontrollproverna (figur 4).
  6. Beräkna plattans Z'-faktor (Z') med hjälp av ekvationen:
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn),
    där σ p och σ n är standardavvikelserna för de positiva respektive negativa kontrollerna, och μp och μn är medelvärdena för de positiva respektive negativa kontrollerna31.
    OBS: Z'-faktorn indikerar separationen av de positiva och negativa kontrollfördelningarna. En Z' på 0 betyder ingen separation, medan en Z' på 0,5 indikerar lika separation. Som nämnts i en tidigare studie31 indikerar Z' > 0,5 en utmärkt analys för substansscreening. Ett Z' i intervallet 0,5 till 0 är acceptabelt, men det kan bara identifiera starka träffar i analysen, vilket kommer att kräva ytterligare validering i sekundära analyser.
  7. Betrakta föreningar som "träffar" för screening när APC MFI för sammansatta neutrofiler är lägre än tre gånger standardavvikelsen för den positiva kontroll-MFI subtraherad från den positiva kontroll-MFI (P = 0,0013, representerad av den streckade linjen i figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data från en representativ 384-brunnars plattscreening (Figur 4) visade att negativa kontroller hade ett MFI på mAb24-APC på 3236 ± 110, medan positiva kontroller hade ett MFI på mAb24-APC på 7588 ± 858. Z'-faktorn för denna platta är cirka 0,33, vilket ligger inom ett acceptabelt intervall31. Z' kräver dock ytterligare validering i sekundära analyser.

För att normalisera data skalades alla värden för att tilldela ett högsta värde på 1 till det positiva medelvärdet och ett minimivärde på 0 till det negativa medelvärdet. Z'-faktorn kommer att genomgå en mer rigorös validering i sekundära analyser. Gränsvärdet för denna platta är satt till 0,41, vilket innebär att prover med en relativ MFI lägre än 0,41 kommer att betraktas som träffar som hämmar fMLP-inducerad β2-integrinaktivering i humana neutrofiler. Inga träffar identifierades från denna platta.

För att bekräfta protokollets effektivitet användes Nexinhib20, som hämmar aktivering av β2-integrin genom att antagonisera Rac-1-funktionen, och lifitegrast, som motverkar integrin αLβ2 direkt32,33. Inkubationstiderna justerades dock till en timme för Nexinhib20 och en halvtimme för lifitegrast. Resulterande data från dessa experiment normaliserades med samma skalningsmetod som beskrivs ovan. Dessa datapunkter kombinerades sedan med plattresultaten och analyserades tillsammans (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Plattlayout för sammansatt siktning. Ett schematiskt diagram som illustrerar arrangemanget av siktmedel och kontroller i en 384-hålsplatta. Negativa kontrollbrunnar visas i blått (kolumn 1 och 23) och positiva kontrollbrunnar visas i rött (kolumn 2 och 24). Testbrunnar representeras i beige (kolumnerna 3 till 22). Pilar anger sekvensen för avläsning av plattan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Neutrofil separation med hjälp av densitetsgradientmedium. Representativa foton som visar framgångsrik och misslyckad separation av neutrofiler med hjälp av densitetsgradientmedium. (A) Inledningsvis skiktas 4 ml blod på 8 ml densitetsgradientmedium. (B) Efter centrifugeringen bör två grumliga band vara synliga: det övre bandet som huvudsakligen innehåller mononukleära celler i perifert blod (PBMC) och det nedre bandet som huvudsakligen innehåller neutrofiler med några röda blodkroppar (RBC). De flesta röda blodkroppar är pelleterade i botten. (C) En misslyckad separation där röda blodkroppar inte pelleteras och neutrofilbandet inte observeras. Ytterligare centrifugering (10-30 min) skulle krävas för att separera neutrofilbandet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Reglering av neutrofiler med hjälp av FSC/SSC-diagram. Representativa framåtspridningsdiagram (FSC) och sidospridningsdiagram (SSC) som illustrerar regleringsstrategin för identifiering av neutrofiler. (A) Neutrofiler är reglerade baserat på arean av framåtspridning (FSC-A) och sidospridning (SSC-A) som registrerats av flödescytometern. (B) Enskilda celler är ytterligare begränsade baserat på bredden (FSC-W) och höjden (FSC-H) för framåtspridningen, och (C) bredden (SSC-W) och höjden (SSC-H) för sidospridningen. Färgskalan representerar celltätheten och övergår från rött till gult, grönt och blått när densiteten minskar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Screeningresultat i en representativ platta med 384 brunnar. Screeningresultaten från en representativ 384-brunnsplatta, som visar en Z'-faktor på 0,3. Negativa och positiva kontroller indikeras med blå respektive röda prickar. Testprover behandlade med olika föreningar representeras som beige prickar. Den streckade linjen representerar MFI-gränsen (Mean Fluorescence Intensity Cut-Off) för att identifiera träffar. Ingen av de testade föreningarna identifierades som β2-integrinantagonister, eftersom alla testade föreningar uppvisade MFI-värden över cut-off-linjen. Resultat från oberoende experiment som testar kända β2-integrinantagonister med varierande inkubationstider (Nexinhib20 i 1 timme, lifitegrast i en halvtimme) samlas för presentation i denna figur. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Initiering och avslutning av stimulering och färgning av neutrofila granulocyter bestäms genom tillsats av neutrofiler och fixeringsmedlet PFA. Därför är det viktigt att säkerställa samma tidsintervall mellan pipettering av neutrofiler eller PFA i varje kolonn. Detta säkerställer att stimulerings- och färgningstiden för neutrofiler från varje brunn förblir konsekvent. På grund av neutrofilernas korta livslängd måste hela experimentet, från insamling av blod från givare till fullständig flödescytometri, utföras samma dag. Neutrofiler är mycket känsliga för temperaturförändringar och kan aktiveras när de utsätts för snabba temperaturökningar, t.ex. vid övergång från 4 °C till rumstemperatur eller från rumstemperatur till 37 °C. Dessutom, baserat på vår tidigare erfarenhet, sker inte aktivering av fMLP-inducerad neutrofil β2-integrin när celler lagras på is eller vid 4 °C (data visas inte). Därför bör helblod och neutrofiler förvaras i rumstemperatur eller 20 °C före fixering (under isoleringscentrifugeringen). Placera inte helblod och neutrofiler på is.

Färgning av mAb24 i negativa kontroller bör ge mycket låga resultat. Om en hög mAb24-färgningsnivå observeras i ett experiment, kontrollera följande: (1) om det fanns en signifikant temperaturförändring under experimentet före fixering; 2) Huruvida det förekom kontamination av fMLP eller endotoxin i det neutrofila mediet. (3) om provhanteringen var för aggressiv, såsom att generera bubblor under pipettering och blandning.

Det nuvarande protokollet använder mAb24 för att rapportera öppnandet av β2-integrinhuvudet. Teoretiskt sett kan KIM127, en monoklonal antikropp som rapporterar förlängningen av β2-integriner 34,35, användas tillsammans med mAb24 för att göra en omfattande bedömning av β2-integrinkonformationen. Signal-brusförhållandet för KIM127-färgning (1,5 till 2-faldigt) är dock inte lika gynnsamt som för mAb24 (5 till 10-faldigt), vilket vanligtvis inte ger en tillfredsställande Z'-faktor i 384-hålsplattanalysen. I 96-håls plattanalysen kan proverna tvättas innan flödescytometri utförs, vilket minskar lösliga antikroppshärledda bakgrundssignaler. Därför kan den KIM127-baserade analysen utföras i 96-håls plattanalysen, som har lägre genomströmning jämfört med 384-håls plattanalysen.

Eftersom denna metod använder fluorescensintensitet som avläsning för att bedöma den integrinhämmande effekten av läkemedel, kan vissa fluorescerande läkemedel störa resultaten. Dessutom verkar toxiska läkemedel som inducerar neutrofildöd inom 10 minuters stimuleringsperiod också rapportera integrinhämning. Läkemedel som hämmar neutrofil degranulering kommer att undertrycka det totala β2-integrinuttrycket. Dessa degranuleringshämmare kommer också att identifieras i vår screening. Därför behövs sekundär screening med andra kontroller för att bekräfta träffarnas hämmande effekter. Sekundära skärmar refereras till som ett sätt att både validera och fastställa verkningsmekanismen för träffar. Förutom att upprepa mAb24-testerna kommer det totala CD18-uttrycket på cellytan att bedömas med hjälp av en pan-anti-human CD18-antikropp. Nivån av aktiverat β2-integrin, mätt med mAb24, kommer att normaliseras av det totala CD18-uttrycket. Detta kommer att göra det möjligt för oss att avgöra om agentens verkningsmekanism innebär att antagonistisera integrinaktivering och/eller hämma uttrycket av CD18 på cellytan. En viabilitetsanalys bör också utföras i den sekundära screeningen för att utesluta eventuella toxiska effekter av träffarna.

Det här protokollet har begränsningar. För det första kan mAb24 detektera den β2 I-liknande domänen endast i fall där integrinet befinner sig i ett tillstånd med hög affinitet. Därför kan den inte identifiera α/β I-liknande allosteriska antagonister såsom lifitegrast genom att minska mAb24-bindningen. Lifitegrast inducerar mer mAb24-bindning32 och visar ett onormalt förhöjt MFI-värde med mAb24 (Figur 4). För sådana onormala värden kan andra analyser behövas för att verifiera om dessa träffar är α/β I-liknande allosteriska antagonister som lifitegrast. För det andra är Z'-faktorn för denna analys suboptimal och kan potentiellt förbättras genom användning av automatisk pipettering och omrörning. Tyvärr saknar vårt laboratorium den nödvändiga utrustningen för att testa denna hypotes. Duplicering eller tredubbling av analyser kommer att vara till hjälp för att identifiera falska positiva och negativa resultat om Z'-faktorn inte kan förbättras ytterligare med metoderna ovan. Dessutom kan det vara fördelaktigt att förlänga inkubationstiden för att identifiera fler träffar, vilket observerats med den kända β2-integrinaktiveringshämmaren Nexinhib20, som kräver en timmes inkubation för att ge hämmande effekter. Denna studie fokuserade på att identifiera snabbverkande medel. Forskare bör notera att de kan ändra inkubationstiden för att passa deras specifika behov.

Såvitt vi vet är detta den första screeningmetoden med hög genomströmning för β2-integrinantagonister. Detta tillvägagångssätt kan användas för att identifiera småmolekylära föreningar som direkt binder till β2-integriner och förhindra konformationsförändringar som leder till intermediära/högaffinitetsintegrintillstånd, liknande antagonister utan "agonistiska" egenskaper som nyligen beskrivits för integrinerna αIIbβ3 och α4β126. Neutrofiler är kritiska vid många inflammatoriska sjukdomar, såsom myokardiell ischemi-reperfusionsskada 36, sepsis37 och autoimmuna sjukdomar38,39. Småmolekylära läkemedel kan erbjuda mer flexibilitet vid behandling av dessa sjukdomar jämfört med antikroppsbaserade läkemedel. Träffar från vår skärm kan ge potentiella behandlingar för inflammatoriska sjukdomar.

Den nuvarande metoden är en fluorescerande antikroppsbaserad screening med hög genomströmning. Eftersom aktiveringsreporterantikroppar också finns tillgängliga för β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 och αL-integriner47,48,49,50, kan denna metod utvidgas till att identifiera antagonister för andra integriner. En konformationskänslig antikropp som HUTS-21, som binder till β1-hybriddomänen 51,52,53, har använts i en screening med hög genomströmning för att identifiera mycket sena antigen-4 (VLA-4, integrin α4β1) allosteriska antagonister 54. Den nuvarande screeningmetoden kan också modifieras och utvidgas för att hitta läkemedel som hämmar eller främjar uttrycket av andra ytreceptorer, till exempel föreningar som ökar ytuttrycket av cystisk fibros transmembrankonduktansregulator (CFTR) på cystisk fibros (CF) celler. Vid CF leder multipla mutationer till felveckning av CFTR, vilket resulterar i att CFTR inte uttrycks på cellmembranet55. Småmolekylära läkemedel har visat sig återställa CFTR-uttrycket56. För protokolländringar är det nödvändigt att öka inkubationstiden för läkemedel till flera timmar för att tillåta förändringar i proteinuttrycket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna uppger att det inte finns några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Evan Jellison och Ms. Li Zhu i flödescytometrikärnan vid UConn Health för deras hjälp med flödescytometri, Dr. Lynn Puddington i avdelningen för immunologi vid UConn Health för hennes stöd till instrumenten, Ms. Slawa Gajewska och Dr. Paul Appleton i den kliniska forskningskärnan vid UConn Health för deras hjälp med att ta blodprover. Vi tackar Dr. Christopher "Kit" Bonin och Dr. Geneva Hargis från UConn School of Medicine för deras hjälp med vetenskapligt skrivande och redigering av detta manuskript. Denna forskning stöddes av anslag från National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, ett Career Development Award från American Heart Association (18CDA34110426) och en startfond från UConn Health. Figur 1 skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 204
En flödescytometribaserad high-throughput-teknik för screening av integrinhämmande läkemedel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L.… More

Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter