Summary
De senaste tekniska framstegen har möjliggjort en storskalig produktion av en in vitro-plattform för läkemedelsmetabolism och toxicitetstillämpningar. Ett helt mänskligt 2D+ leversystem (TV2D+) ger fysiologiskt relevanta resultat med traditionella tvådimensionella odlingsmetoder. Detta protokoll kommer att stödja slutanvändare i installation, underhåll och tillämpning av systemet.
Abstract
Att hitta en långsiktig, humanrelevant odlingsmodell för primära humana hepatocyter (PHH) för farmakologiska och toxikologiska studier är fortfarande en utmaning. Nuvarande in vitro-modellplattformar är ofta obekväma och komplexa, saknar fenotypisk stabilitet över tid och stöder inte flera PHH-partier, vilket saknar experimentell reproducerbarhet och flexibilitet. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för upptining, plätering och underhåll av ett helt mänskligt 2D+ leversystem (TV2D+), som drar nytta av standard tvådimensionella (2D) odlingstekniker och utrustning samtidigt som livslängden och fenotypisk stabilitet över tid bibehålls som vanligtvis följer med mer komplexa tredimensionella (3D) system. Resultaten visar vidhäftning och procentuell plattabilitet i TV2D+ som en funktion av PHH-såddtäthet, samt stabil funktionalitet under minst 2 veckor i odling. En rad PHH-såddtätheter bedöms för att uppnå en framgångsrik långsiktig odling. När PHH:erna i TV2D+ etableras på rätt sätt organiserar de sig i hepatocytkolonier, uttrycker en leverspecifik markör och bibehåller livskraft, arkitektonisk integritet och fysiologiskt relevanta nivåer av albumin och urea. Denna unika kombination av egenskaper gör TV2D+-systemet till en lämplig levermodell för en mängd olika farmakologiska och toxikologiska tillämpningar.
Introduction
Att förutsäga terapeutisk säkerhet och effekt är en viktig del av preklinisk läkemedelsutveckling. Konventionella prekliniska in vitro-levermodeller är dock begränsade i sin förmåga att exakt efterlikna leverns cellulära mikromiljö in vivo och bibehålla hepatocytfunktionalitet och morfologi över tid. Det finns ett behov av modeller som ger stabil metabolisk kompetens i mer än 1 vecka för att bedöma föreningar med långsam omsättning eller undersöka resultat i samband med subakut eller kronisk exponering. In vivo-djurförsök misslyckas ofta med att förutsäga läkemedels effekt och risk på grund av translationella artskillnader i humana leverclearancemekanismer1. Nuvarande in vitro 2-dimensionella (2D) levermodeller, såsom traditionella primära humana hepatocyter (PHH) monokulturer eller sandwichkulturer, saknar fenotypisk stabilitet och livslängd i odlingen, vilket leder till förlust av viktiga hepatocellulära funktioner och arkitektonisk integritet över tid2. En alternativ metod involverar bildandet av 3-dimensionella (3D) hepatocytsfäroider, vilket ger en mer relevant mikromiljö jämfört med 2D-odling. Denna metod begränsas dock av tillgången på råvaror, PHH-donatorpartival, reproducerbarhet och förlust av livskraft med ökande sfäroidstorlek 3,4,5,6. Flercelliga plattformar har introducerats där PHH:er sås med matarceller på mikromönstrade plattor med fast storlek. Även om dessa modeller kan möjliggöra längre odlingstider, kan icke-humana feederceller som används i dessa plattformar förändra experimentella resultat och begränsa deras tillämpning på grund av medfött bakgrundsbidrag till läkemedelsclearance och metaboliska profiler 1,7. Det helmänskliga 2D+-hepatiska systemet (TV2D+) som nyligen beskrevs i Weaver, et al8, utvecklades för att ta itu med några av begränsningarna i traditionella, samkultur- och 3D-odlingsmetoder för PHH. De icke-leverätande cellerna minskar skillnaderna mellan arterna i metabolism och parakrin produktion och ger det stöd som krävs för primära hepatocyter på ett reproducerbart, robust sätt som inte kan tillhandahållas av motsvarande icke-parenkymala leverceller från ett enda donatorparti på grund av begränsningar i expansion, fenotyp och prestanda. De valda matarcellerna kunde konsekvent expanderas före användning och saknade behov av omvandling eller differentiering. Som beskrivits av Glicklis et al.4 och Khetani et al.5 har 3D-odlingsmodeller som hepatocytsfäroider utmaningar med reproducerbarhet på grund av donatorvariabilitet och upprätthållande av konsistens i sfäroidstorlek, vilket påverkar näringsdiffusion i sfäroider större än 200 μm, vilket leder till minskad livskraft och funktionalitet. Precis som 3D-sfäroidbildning förlitar sig TV2D+-systemet på självmontering av PHH; De PHH-kolonier som bildas sprids dock över brunnens yta på ett encellsdjup snarare än att komprimeras till ett enda aggregat. Denna odlingsmetod kan vara användbar för att hantera donatorvariabilitet, vilket gör att PHH:er kan plattas, odlas och bibehålla grundläggande funktionalitet vid olika såddtätheter. TV2D+-systemet kan också öka robustheten i användarhanteringen på grund av förlust under manipulation eller specialutrustning som krävs för att utföra utökad odling i 3D-sfäroider.
TV2D+-systemet kombinerar vanlig 2D-kultur med den livslängd och fenotypiska stabilitet som vanligtvis följer med 3D-system. Protokollet som beskrivs här ger steg-för-steg-anvisningar för användare med grundläggande vävnadsodlingskunskaper i laboratorier utrustade med standardutrustning som biosäkerhetsskåp, centrifuger och CO2 - inkubatorer. Varje steg i processen beskrivs i detalj, inklusive medieberedning, upptining, plätering och underhåll av det resulterande odlingssystemet. Protokollet innehåller också en metod för att bestämma grundläggande hepatocytfunktionalitet, albumin och urea, samt immunofluorescensbildanalys för bestämning av PHH-bindning för normalisering. När PHH:erna i TV2D+ etableras på rätt sätt organiserar de sig i hepatocytkolonier, efterliknar den naturliga levermorfologin och bibehåller förlängd livskraft, arkitektonisk integritet och fysiologiskt relevanta nivåer av albumin och urea i minst 2 veckor8. Eftersom systemet kan tillåta en rad PHH-såddtätheter kan det vara användbart för att öka tillgängligheten av mindre platebara PHH-partier som har önskvärda donatoregenskaper. Denna kombination av tillgänglighet och funktionalitet gör TV2D+ till en lämplig levermodell för en mängd olika farmakologiska och toxikologiska tillämpningar.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna från Lifenet Healths etiska kommitté. Manuskriptet innehåller inga studier med mänskliga deltagare eller djurstudier utförda av någon av författarna. Alla celler isolerades från donatorvävnad som Lifenet Health gav sitt fulla samtycke till för forskningsändamål.
1. Medium förberedelse
- Tina en flaska varje matarcell, tillskott A, tillskott B och tillskott C (se materialförteckning) i ett 37 °C vattenbad eller 16-24 timmar vid 4 °C.
- Fördela hela flaskan (10 ml) med upptiningsmediet för matarceller till ett 15 ml eller 50 ml koniskt rör.
OBS: Storleken på cellpelleten blir lättare att view med ett 15 ml koniskt rör. - Tillsätt 4,5 ml tillskott B och 11 ml tillskott A till en flaska pläteringsmedium (75 ml) (se materialförteckning) för att göra ett komplett pläteringsmedium.
OBS: Komplett pläteringsmedium har en koncentration på FBS <5 % v/v. - Tillsätt 100 ml odlingsmedium (se materialförteckning), 1 ml tillskott C och 14 ml tillskott A i en separat flaska för att göra ett komplett odlingsmedium.
OBS: Komplett odlingsmedium har en koncentration av FBS <1 % v/v - Förvara resterande tillskott C och tillskott A vid -20 °C fram till vecka 2 mediumberedning.
OBS: Upprepade frys-upptiningscykler kommer att minska hållbarheten för kosttillskotten. Det rekommenderas att endast frysa-tina en gång. - Före användning, värm 10 ml upptiningsmedium för matarceller, upptiningsmedium för hepatocyter, komplett pläteringsmedium och komplett odlingsmedium i 20-30 minuter i ett 37 °C vattenbad.
2. Upptining, räkning och plätering av mänskliga matarceller (figur 1A)
- Odla matarcellerna ca 1 timme före sådd av PHH. Tina matarcellerna (se materialtabell) i ett 37 °C vattenbad i 1-2 min.
OBS: Undvik långvarig exponering (t.ex. >2 min) genom att övervaka upptining och ta bort injektionsflaskan när vätska lossnar i kryovialen när den vänds upp och ned. - Omedelbart efter upptining, placera matarcellerna på is.
- Använd aseptisk teknik, i ett biosäkerhetsskåp (BSC), tillsätt nytinade celler till 10 ml upptiningsmedium för matarceller.
- Använd en 1000 μL pipett för att tvätta injektionsflaskan en gång med 1 ml cell/tina medium suspension och samla upp.
- Centrifugera i 400 x g i 4 minuter i rumstemperatur (RT).
- Kassera försiktigt supernatanten för att inte störa cellpelleten genom pipettering eller vakuumaspiration. Återsuspendera cellpelleten i 1 ml komplett pläteringsmedium och räkna matarcellerna.
OBS: Matarceller kan räknas med akridinorange och propidiumjodid (AOPI) på en automatiserad cellräknare eller trypanblå med hjälp av en hemacytometer. Cellantalet kan variera beroende på teknik och användare. För bästa resultat bör du räkna dubblettprover och förbli konsekvent i den valda metoden. - Späd cellsuspensionen till 100 000 celler/ml med hjälp av det kompletta pläteringsmediet.
- Platta 500 μL (50 000 celler) per brunn av den utspädda cellsuspensionen på en kollagenbelagd 24-hålsplatta (se materialtabell).
- Skaka plattan i en nordlig (N)-sydlig (S)-östlig (E)-västlig (W) rörelse genom att använda en fram-och-tillbaka-rörelse i N-S-riktningen 2 gånger följt av samma rörelse E-W. Upprepa detta skakningsprotokoll 2 gånger till i totalt 3 omgångar.
OBS: Skaka med måttlig kraft för att undvika stänk på plattans lock samtidigt som du hjälper till med celldistributionen (se video). - Inkubera vid 37 °C/5 % CO2 i 60 min.
- View matarcellens fäste innan du fortsätter med att tina hepatocyter.
OBS: Acceptabel matarcellsanslutning är visuellt cirka 50 % sammanflytande.
3. Upptining, räkning och plätering av primära humana hepatocyter (figur 1B)
- Efter 30 minuters odling av matarceller, filtrera det förvärmda hepatocytupptiningsmediet genom en 0,2 μm polyetersulfonfilterenhet (PES).
- Tina PHH i ett 37 °C vattenbad i 1-2 min.
OBS: Undvik långvarig exponering (t.ex. >2 min) genom att övervaka upptining och ta bort injektionsflaskan när vätska lossnar i kryovialen när den vänds upp och ned. - Omedelbart efter upptining, placera PHH på is.
- Häll PHH-suspensionen i hepatocytupptiningsmediet i en BSC.
OBS: Undvik att pipettera PHH-cellsuspensioner när det är möjligt. Det är mycket viktigt att inte utföra någon pipettering under överföringen av tinade PHH:er från kryovialen till upptiningsmediet. - Använd en 1000 μL pipett för att tvätta injektionsflaskan 3-4 gånger genom att försiktigt pipettera tillbaka 1 ml hepatocyt/upptiningsmediumsuspension i injektionsflaskan och samla upp tvätten genom att hälla tillbaka den i upptiningsmediet.
- Täck och vänd försiktigt upp och ner på den tinade PHH-suspensionen 5 gånger.
- Centrifugera med 100 x g i 8 minuter vid RT.
- Kassera försiktigt supernatanten för att inte störa cellpelleten genom pipettering eller vakuumaspiration. Tillsätt 3 ml komplett pläteringsmedium till det koniska rörets vägg.
- Vicka det koniska röret från sida till sida för att återsuspendera cellpelleten.
- Tillsätt ytterligare 5 ml komplett plattmedium till de resuspenderade hepatocyterna.
- Räkna PHH.
OBS: PHH kan räknas med AOPI på en automatiserad cellräknare eller trypanblå med hjälp av en hemacytometer. Cellantalet kan variera beroende på teknik och användare. För bästa resultat bör du räkna dubblettprover och förbli konsekvent i den valda metoden. - Späd cellsuspensionen till önskad sådddensitet (300 000-600 000 PHH/ml) med hjälp av det kompletta pläteringsmediet.
OBS: Optimal hepatocytsåddtäthet kan variera från parti till parti. Den rekommenderade såddtätheten för ett visst parti kommer att anges i analyscertifikatet (COA). Använd ekvationen nedan för att bestämma hepatocyter/ml för en 24-hålars platta.
- Från de pläterade matarcellerna avlägsnar du mediet genom pipettering eller vakuumaspiration.
OBS: För att säkerställa matarcellernas livskraft rekommenderas att inte byta mer än 3 brunnar åt gången. - Platta omedelbart 500 μL (150 000-300 000 celler) per brunn av den utspädda hepatocytsuspensionen på den förbelagda kollagen 24-hålsplattan som innehåller matarceller.
- Skaka plattan i en NSE-W-rörelse genom att använda en fram och tillbaka-rörelse i NS-riktningen 2 gånger följt av samma rörelse E-W. Upprepa detta skakningsprotokoll 2 gånger till i totalt 3 omgångar.
OBS: Skaka med måttlig kraft för att undvika stänk på plattans lock samtidigt som du hjälper till med celldistributionen. - Inkubera vid 37 °C/5 % CO2 i 2–4 timmar. Under de första 60 minuterna av odlingen, skaka plattan var 15:e minut i NSE-W-rörelse som i steg 3.15 ovan.
- Efter inkubationen, ta bort plattan från inkubatorn och placera den i BSC.
- Skaka plattan och ta bort hela pläteringsmediet genom pipettering eller vakuumaspiration.
OBS: För att säkerställa kulturens livskraft rekommenderas att inte byta mer än 3 brunnar åt gången. - Tillsätt omedelbart 500 μl förvärmt helodlingsmedium till varje brunn.
4. Underhåll
- Förvärm helodlingsmediet i ett 37 °C vattenbad i 20–30 minuter. Cirka 13,5 ml medium behövs för en platta med 24 brunnar.
- Mata dagligen odlingarna med 500 μl färskt, förvärmt komplett odlingsmedium per brunn.
OBS: För att säkerställa kulturens livskraft rekommenderas att inte byta mer än 3 brunnar åt gången. - Förbered färskt helkulturmedium var 7:e dag.
5. Insamling av supernatantprover för mätning av albumin och urea
- Vid dag 7, 10 och 14 samlas 500 μL medium från den eller de önskade provbrunnarna i ett eller flera mikrocentrifugrör, som visas i figur 1C.
- Centrifugera proverna vid 320 x g i 10 minuter vid 4 °C på pelletsrester.
- Använd en pipett för att överföra provsupernatant till nya mikrocentrifugrör, för att undvika att pelleten störs.
- Kör proverna på albumin- och/eller ureaanalysen (se avsnitt 10 respektive 11).
OBS: Samples kan förvaras vid -20 °C till -80 °C i 2 veckor.
6. Färgning dag I
VARNING: Fixeringsbuffert innehåller paraformaldehyd. Paraformaldehyd kan orsaka ögonskador, hudirritation och organtoxicitet. Arbeta i ett område med god ventilation och använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE).
- Efter provtagningen på dag 14 tillsätts 300 μL fixeringsbuffert (se materialförteckning) till varje brunn som ska färgas, som visas i figur 1C. Betsa minst 2 brunnar.
- Inkubera vid 4 °C i 20-60 min.
- Förbered 1x permeabiliseringsbuffert (se materialtabell) genom att tillsätta 5 ml 10x stamlösning till 45 ml 1x PBS (se materialtabell).
OBS: 1x permeabiliseringsbufferten kan förvaras vid 4°C i 1 månad. - Tvätta 2 gånger med 300 μL 1x permeabiliseringsbuffert på is.
- Tillsätt 300 μl primär antikropp cytokeratin 18 (se materialtabell) med en utspädning på 1:1000 i 1x permeabiliseringsbuffert på is.
OBS: Inkubera minimalt en brunn med 1x permeabiliseringsbuffert endast för en sekundär antikroppskontroll. - Inkubera 16-24 timmar vid 4 °C.
7. Färgning dag II
- Följande dag avlägsnas den primära antikroppen genom pipettering eller vakuumaspiration.
- Tvätta 2 gånger med 300 μL per brunn 1x permeabiliseringsbuffert på is.
- Tillsätt 300 μl fluorescerande sekundär antikropp (se materialförteckning) med en utspädning på 1:500 i 1x permeabiliseringsbuffert (inklusive endast sekundär kontroll).
OBS: Undvik ljus vid användning av fluorescerande antikroppar. - Inkubera i 30-45 minuter vid 4 °C i mörker.
- Avlägsna den sekundära antikroppen genom pipettering eller vakuumaspiration.
- Tvätta 2 gånger med 300 μL per brunn 1x permeabiliseringsbuffert på is.
- Tvätta 1 gång med 300 μL per brunn med 1x PBS.
- Tillsätt 150 μl 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) monteringsmedium (se materialtabell) till varje brunn och inkubera i 15 minuter vid RT i mörker.
OBS: Plattan kan lindas in i parafilm och förvaras vid 4 °C i mörker i 1 vecka. - Se under ett fluorescerande mikroskop. Ta 5 bilder av varje specifik fluorescerande kanal för varje brunn med hjälp av 10x objektivlinsen (se till att en bild har en skalstapel).
OBS: DAPI har en excitation/emission på 358 nm/461 nm. Använd ett fluorescerande mikroskop utrustat med lämpliga detektionsfilter för både DAPI och den sekundära antikroppsfluoroforen.
8. Analys av ImageJ (figur 2)
OBS: Vi rekommenderar att du använder ImageJ version 1.52a eller senare.
- Öppna en bild som innehåller ett skalstreck i ImageJ. Klicka på ikonen Rak linje och rita en linje till den exakta längden på skalstapeln [Figur 2 (1)]
OBS: Om det behövs klickar du på ikonen Förstoringsglas för att zooma in eller ut. - Klicka på fliken Analysera . Markera och klicka på Ställ in skala.
- Ändra Känt avstånd till avståndet för skalstapeln. Ändra Längdenheter till måttstapelns enheter. Tillämpa inställningarna globalt genom att markera Global. Klicka på OK för att ställa in skalan.
OBS: När den här inställningen har tillämpats kommer varje bild som öppnas att visa det beräknade området för synfältet i enheter som matas in av användaren. - Öppna en DAPI-avbildning i ImageJ. Klicka på fliken Process och markera Subtrahera bakgrund. Ta bort bakgrunden 50 pixlar i taget tills de ofärgade områdena är svarta.
OBS: Om bilden inte innehåller bakgrund krävs inte detta steg. - Klicka på fliken Bild och markera Typ. Klicka på 8-bitars för att göra bilden gråskala [Figur 2 (2)].
- Tröskel bilden manuellt eller automatiskt för att inkludera alla DAPI-partiklar (var försiktig så att du inte manuellt överskrider tröskelvärdet) [Figur 2 (3)]. Klicka på fliken Bild och markera Justera. Klicka på Tröskelvärde. Klicka på Använd när du är klar.
- Klicka på fliken Process och markera Binär. Klicka på Vattendelare.
- Klicka på fliken Analysera och markera/klicka på Analysera partiklar [Figur 2 (4)]. Ställ in storleken på 5-oändlighet och cirkularitet på 0,00-1,00. I listrutan Visa väljer du Konturer. Se till att Visa resultat, Sammanfatta och Inkludera hål är markerade. Klicka på OK.
OBS: Det önskade partikelintervallet kan justeras om tröskelvärdet ger bakgrundspixlar. - Registrera räkningsresultatet som TOTAL DAPI.
- Öppna en sammanslagen Cytokeratin 18/DAPI-bild i ImageJ.
- Använd flerpunktsikonen [Figur 2 (5)] för att räkna alla DAPI-partiklar som är ofärgade för Cytokeratin 18 manuellt.
- Registrera resultatet som MATARCELLER. Använd ekvationen nedan för att bestämma hepatocyt-DAPI.
Hepatocyt DAPI = Total DAPI - Feeder Cell DAPI
9. Kvantifiering av totalt antal hepatocyter och procentuell bindning (plattabilitet)
- Skapa en skalfaktor för odlingsområdet med 24 brunnar med hjälp av ekvationen nedan. Synfältsmätningar finns högst upp på varje bild som öppnas [Figur 2 (2), grön ruta].
- Beräkna det totala antalet bifogade hepatocyter med hjälp av ekvationen nedan.
Vidhäftade hepatocyter = Skalfaktor × Hepatocyt DAPI - Beräkna den procentuella bindningen av hepatocyterna med hjälp av ekvationen nedan.
10. Albuminanalys
- Mät albuminproduktionen med hjälp av en sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) (se materialtabell) på prover utspädda vid 1:200.
OBS: För noggrannhetens skull bekräftar användaren att samplesen faller inom standardkurvans linjära intervall. Det specificerade kitet innehåller allt material och instruktioner för att utföra analysen. - Normalisera provkoncentrationerna till fästa hepatocyter med hjälp av ekvationen nedan.
11. Analys av urea
VARNING: Blodureakväve (BUN) syrareagens innehåller svavelsyra. Svavelsyrakoncentrationen i BUN-syrareagenset anses vara frätande. Får ej förtäras. Arbeta i ett område med god ventilation och använd lämplig personlig skyddsutrustning.
- Ureasyntesen mäts med en modifierad diacetylmonoxidmetod (se materialförteckning).
- Späd 53,3 μl 75 mg/dL urea med 346,7 μL komplett odlingsmedium för att göra Standard #1 (100 μg/ml)
- Märk rören 2-8 och använd en seriell spädning på 1:2 för att göra ureaanalysstandarderna (tabell 1).
- Tillsätt 10 μl prov eller standard till brunnar i en svartväggig, klar bottenplatta med 96 brunnar (se materialförteckning).
- Tillsätt 150 μl BUN-reagens till varje brunnsinnehållande prov. Förbered BUN-reagens genom att blanda 1/3 av BUN-färgreagens med 2/3 BUN-syrareagens. Använd ekvationen nedan för att hjälpa till med beräkningarna.
BUN-färgreagens (ml) = Totalt BUN-reagens som behövs × 0,333
BUN-syrareagens (ml) = Totalt BUN-reagens som behövs × 0,667 - Inkubera plattan i 90 min i ugn eller inkubator vid 60 °C.
- Läs av plattans absorbans omedelbart vid 540 nm och 650 nm.
- Skapa en standardkurva genom att subtrahera blank- och bakgrundsabsorbans (650 nm) från alla prover och standarder. Generera en linje som passar bäst genom linjär regressionsanalys.
- Bestäm okänd provkoncentration från standardkurvan.
- Normalisera provkoncentrationerna till bifogade hepatocyter med hjälp av ekvationen nedan.
Representative Results
Den övergripande metoden för plätering, odling och grundläggande funktionstestning av leverodlingssystemet omfattar vanliga primära cellodlingstekniker och analyser, som illustreras i figur 1. Hepatocytbindning och procentuell plattabilitet beräknades på dag 14 med hjälp av ImageJ-analys av minst fem bilder av cytokeratin 18 och DAPI-färgning per brunn (figur 2). Representativa bilder av PHH odlade med matarceller visas i figur 3. De olika leversåddtätheterna visade visuella skillnader i sammanflöde baserat på såddtäthet och bibehöll typisk hepatisk, kuboidal morfologi under 14 dagars odling. Bilder av hepatocytdonatorpartierna A och B togs för varje testad såddtäthet (Figur 4A). Den genomsnittliga procentuella plattabiliteten för givare B (89,04 % ± 3,99 %, 198 552 ± 49 885 PHH) var högre än för givare A (66,08 % ± 6,67 %, 146 128 ± 33 063 PHH) för alla såddtätheter som användes (figur 4B). Donator A hade signifikant högre procentuell plattabilitet med 150 000 PHH/brunn (76,07 % ± 12,87 %) jämfört med 250 000-300 000 PHH/brunn (62,75 % ± 9,64 %). Donator B uppvisade inga signifikanta skillnader i hepatocytprocentuell plattabilitet. Donator B hade den lägsta hepatocytplatåabiliteten (85,78 % ± 13,25 %) vid den högsta såddtätheten, 300 000 PHH/brunn. I likhet med donator A hade sådddonator B med 150 000 PHH/brunn den högsta procentuella platåabiliteten av hepatocyter (94,75 % ± 15,07 %).
Albuminproduktion och ureasyntes mättes vid tre tidpunkter under den 14 dagar långa odlingsperioden och normaliserades till beräknade hepatocyter. Sammantaget hade donator A ökad albuminproduktion jämfört med donator B (41,32 ± 4,58 μg alb/dag/106 PHH jämfört med 34,66 ± 10,03 μg alb/dag/106 PHH) (figur 5). Donatorerna A och B hade den högsta albuminproduktionen med 150 000 PHH/brunn, 45,91 ± 5,96 μg alb/dag/106 PHH respektive 48,67 ± 20,44 μg alb/dag/106 PHH. Inga signifikanta skillnader i albuminproduktion sågs i de såddtätheter som användes. Som anges av Baudy et al.3 är det önskvärt att leverns mikrofysiologiska system upprätthåller en jämn albuminproduktion och ureasyntes med mindre än 50 % förändring under 14 dagars odling. Variationskoefficienten (CV) beräknades genom att dividera medelvärdet med standardavvikelsen för dag 7, 10 och 14. Alla exempel kördes i dubbletter. CV för albuminproduktion under 14-dagarsodlingsperioden vid 150 000 PHH/brunn var 12,24 % för donator A och 37,97 % för donator B, vilket var mindre än det önskade kriteriet på 50 %. En hög varians i albuminproduktionen sågs hos både donator A och donator B när de såddes vid 250 000 och 300 000 PHH/brunn. Vid dessa såddtätheter upplever båda donatorerna en kraftig minskning av albuminproduktionen mellan dag 7, 10 och 14 av odlingen (CV-donator A, 22,49 % och donator B, 45,07 %).
Givarens B-ureasyntes (95,09 ± 18,91 μg urea/dag/106) ökade jämfört med givare A (64,92 ± 4,66 μg urea/dag/106 PHH) vid medelvärdesberäkning av dag 7, 10 och 14 PHH-partispecifika data (figur 6). Donator B (113,49 ± 37,34 μg urea/dag/106 PHH) och donator A (69,12 ± 17,06 μg urea/dag/106 PHH) hade den största ureasyntesen under en 14-dagars odlingsperiod med en densitet på 150 000 PHH/brunn respektive 200 000 PHH/brunn. Båda donatorpartierna hade den lägsta ureaproduktionen och den högsta CV på 300 000 PHH/brunn. Inga signifikanta skillnader i ureasyntesen sågs i de såddtätheter som användes. Den lägsta CV för ureasyntes för donator A sågs vid odling vid 250 000 PPH/brunn (23,11 %) och 200 000 PHH/brunn för donator B (28,26 %). Som framgår av dessa resultat beror optimal såddtäthet för ett givet parti PHH på den önskade sammanflödesnivån vid tidpunkten för analysen och arten av de resultat som mäts; Högre såddtäthet kanske inte alltid korrelerar med högre signal eller dynamiskt omfång.
Figur 1: Flödesschema över plätering, odling och funktionstestning av hepatocyter med matarceller. (A) Matarcellerna tinas upp i ett specifikt upptiningsmedium (se materialtabellen), återsuspenderas i ett komplett pläteringsmedium (se materialtabellen) och cellerna räknas. Cellerna späds, pläteras och inkuberas i 60 minuter vid 37 °C/5 % CO2 %. B) Hepatocyterna tinas upp i ett särskilt upptiningsmedium (se materialtabellen), återsuspenderas i ett komplett plattmedium och cellerna räknas. Hepatocyterna späds ut och pläteras med matarceller. Cellerna inkuberas i 2–4 timmar vid 37 °C/5 % CO2 och skakas i en N-S-E-W-rörelse var 15:e minut under de första 60 minuterna av odlingen. Pläteringsmediet ersätts med ett förvärmt komplett odlingsmedium för underhåll av kulturen (se materialtabell). Kulturerna matas dagligen. C) Dag 7, 10 och 14 tas medelstora prover för albumin- och ureatest. Efter provtagning på dag 14 fixeras cellerna och färgas med cytokeratin 18 (se materialtabell) antikropp 16-24 h vid 4 °C. Vidare inkuberas de i en lämplig sekundär antikropp, tvättas och monteras med DAPI (se Materialtabell) för infångning och bildanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bildanalys med hjälp av programvaran ImageJ. ImageJ-bearbetning av tagna bilder. Steg 1: en skala appliceras på alla bilder baserat på den mikroskopspecifika skalstapeln. Steg 2: bildtypen ändras. Steg 3: En tröskelgräns tillämpas för att välja DAPI-partiklar. Steg 4: en partikelanalys utförs och räkningen registreras. Steg 5: för att bestämma antalet anslutna matarceller räknas en sammanslagen bild med hjälp av flerpunktsverktyget. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Morfologi för olika leversåddtätheter odlade med matarceller. Representativa bilder på dag 7 och 14 av PHH:er odlade med matarceller (50 000 celler/brunn) vid leversåddtätheter på 150 000, 200 000, 250 000 och 300 000 PHH/brunnar. Bilderna togs med en 10x objektivlins på ett inverterat faskontrastmikroskop. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Fluorescerande immunocytokemi för olika leversåddtätheter odlade med matarceller. (A) Representativa bilder av Cytokeratin 18 (röd) färgning på dag 14 vid leversåddtätheter på 150 000, 200 000, 250 000 och 300 000 PHH/brunnar. Två brunnar för varje såddtäthet fastställdes i 30 minuter vid 4 °C. Brunnarna inkuberades 16-24 timmar vid 4°C med primär antikropp vid 1:1000. En sekundär antikropp användes vid 1:500 i 30 minuter vid 4 °C i mörker. DAPI (blå) kärnfärgning tillsattes i brunnar i 15 minuter vid rumstemperatur. Bilderna togs med en 10X objektivlins på ett inverterat fluorescerande mikroskop. Skalstapel = 100 μm. (B) Beräknad vidhäftande hepatocyter och procentuell plattabilitet för olika leversåddtätheter beräknad med hjälp av ImageJ. *p ≤ 0,05, till procentuell plattabilitet för 200 000, 250 000 och 300 000 PHH/brunn. Felstaplar representerar standardavvikelse (n ≥ 5 bilder per villkor). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Albuminproduktion av hepatocyter odlade med feederceller. Albuminproduktion från leversåddtätheter vid 150 000, 200 000, 250 000 och 300 000 PHH/brunn. Kolumnerna representerar 14-dagarsgenomsnittet av mikrogram albumin/dag normaliserat till totalt antal hepatocyter. En linje representerar CV mellan dag 7, 10 och 14. Felstaplar representerar standardavvikelse (n ≥ 2 brunnar per tillstånd med replikat). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Ureasyntes av hepatocyter odlade med feederceller. Ureasyntes från leversåddstätheter vid 150 000, 200 000, 250 000 och 300 000 PHH/brunn. Kolumnerna representerar 14-dagars medelvärde av μg urea/dag normaliserat till totalt antal hepatocyter. En linje representerar %CV mellan dag 7, 10 och 14. Felstaplar representerar standardavvikelse (n ≥ 2 brunnar per tillstånd med replikat). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Standard (S) # | Koncentration (μg/ml) | Urealösning (μL) | Fullständig kultur (μL) |
| 1 | 100 | 53.3 75 mg/dL lager |
346.7 |
| 2 | 50 | 100 (S1-lösning) |
100 |
| 3 | 25 | 100 (S2-lösning) |
100 |
| 4 | 12.5 | 100 (S3-lösning) |
100 |
| 5 | 6.26 | 100 (S4-lösning) |
100 |
| 6 | 3.125 | 100 (S5-lösning) |
100 |
| 7 | 1.5625 | 100 (S6-lösning) |
100 |
| Blank | 0 | 0 | 100 |
Tabell 1: Beredning av standardprov för urea. Bered en 100 μg/ml urealösning med 75 mg/dl buljongurea. Alikvot de föreslagna volymerna för att uppnå den slutliga koncentrationen för standardkurvan.
Discussion
Det beskrivna leverodlingssystemet kan etableras i laboratorier som är utrustade med standardinstrument för vävnadsodling. Systemet består av PHH:er odlade med matarceller och gör det möjligt för användaren att odla PHH:er i minst två veckor med stabil albuminproduktion och ureasyntes. På grund av variationer i PHH-donatorpartier rekommenderas endast förscreenade och kvalificerade PHH:er för användning i systemet. Även om antalet bifogade PHH:er varierar beroende på donatorparti och såddtäthet, förblir den relativa plattbarheten likartad inom varje donatorparti. Även om rekommenderade såddtätheter rekommenderas, tyder ovanstående data på att hepatocytsåddstätheten kan justeras för olika experimentella behov; Det bör dock noteras att sådd av ett större antal PHH:er kanske inte ger högre eller mer konsekventa funktionella resultat. Analys av de utvärderade PHH-partierna visade den lägsta CV för albuminproduktion och ureasyntes med lägre sådddensiteter på 150 000 PHH/brunn och 200 000 PHH/brunn; Däremot hittades inga signifikanta skillnader mellan albumin och urea vid någon såddtäthet. Högre såddtätheter på 250 000 PHH/brunn och 300 000 PHH/brunn visar en större minskning av albumin och urea under den 14 dagar långa odlingsperioden. Donatorns inneboende variation i plateability kan påverka konsistensen i albuminproduktionen och ureasyntesen vid 250 000 PHH/brunn och 300 000 PHH/brunn för de testade donatorpartierna. I likhet med stora hepatocytsfäroider kan översådd av PHH:er i TV2D+-systemet ha negativa effekter på PHH:s långsiktiga odling och funktionalitet.
Alla steg i upptining, plätering och underhåll är avgörande för framgångsrik odling och datagenerering. Det finns dock flera vanliga misstag som oerfarna användare kan undvika. PHH är mycket känsliga för skador sekundärt till temperaturfluktuationer, skjuvspänning och exponering för luft 9,10. Försiktighetsåtgärder bör vidtas vid upptining av PHH för att undvika förlängda upptiningstider och överdriven pipettering. Användningen av en handhällningsmetod, en timer och omedelbar överföring från vattenbad till is kommer att minska dessa vanliga fel som kan påverka PHH:ernas livskraft och plattbarhet. Dessutom, med problem med leveranskedjan som blir vanligare, kan det vara svårt att få tag på kollagenbelagda plattor. Manuell beläggning av vävnadskulturbehandlade plattor med kommersiella lösningar av kollagen typ I (5-10 μg/cm2) kan användas för att lösa detta problem; För optimal prestanda och konsistens rekommenderas dock att använda förbelagda kollagenplattor. I processen för övergång från odling av enbart matarceller till införandet av PHH är det viktigt att förhindra att matarcellskiktet torkar. Låt aldrig matarcellerna utsättas för luft. All luftexponeringstid kan leda till dålig kvalitet på matarcellskiktet, vilket kommer att påverka den långsiktiga odlingen av PHH negativt. Det är bästa praxis att låta en liten mängd kvarvarande medium finnas kvar mellan mediebytena. Ibland kan PHH:er innehålla överflödigt skräp från isolering, vilket kan göra det svårt att se morfologin. För att hjälpa till med detta problem, skaka plattan före ett mediumbyte och använd vakuumaspiration. Slutligen, när du utför ett mediebyte, aspirera försiktigt det förbrukade mediet och var noga med att inte störa de odlade cellerna. Pipettera färsk medelvolym ner på sidan av brunnen för att undvika pipettering direkt på celskiktet. Användaren bör också undvika luftexponering vid varje mediebyte med hjälp av det rekommenderade bytet av 3 brunnar (avsnitt 3 och 4). Det bör också noteras att en daglig förändring av mediet är idealisk men inte nödvändig.
Även om fluorescerande mikroskop har blivit vanliga i de flesta laboratorier, kan programvara som behövs för att utföra specifik bildanalys medföra extra kostnader. ImageJ kan laddas ner gratis, vilket gör det till ett lättillgängligt bildanalysverktyg. Stegen i protokollet ger en grund som användaren kan behöva optimera, särskilt partikelanalys av DAPI-färgning; I avsaknad av fluorescerande avbildningsförmåga anges dock PHH-bindningsvärden på dag 14 på partispecifika analysintyg. Dålig tröskelvärde kommer att resultera i felaktig räkning av DAPI-partiklarna. Det rekommenderas också att kontrollera ytan på enskilda DAPI-partiklar innan du ställer in en storleksuteslutning. Detta kan uppnås genom att använda den ovala ikonen [Figur 2 (1), cirkelikonen under fliken Redigera ] och rita en cirkel som omfattar DAPI-partikeln. Fliken Analysera kan sedan användas för att mäta arean av den valda DAPI-partikeln. Specifika mätningar kan väljas med hjälp av Ställ in mått under fliken Analysera [steg 8.9 och figur 2 (4)].
Nuvarande metoder för att odla PHH involverar användning av beläggningar som kollagen-I för att öka cellbindningen i traditionell 2-dimensionell monokultur11 eller överlagring med en extracellulär matris, som den murinbaserade Matrigel, en teknik som vanligtvis kallas "sandwichkultur"12,13,14,15 . Även om sandwichodlingstekniken förbättrar PHH-morfologin och polariteten över tid jämfört med traditionell monokultur, saknar båda metoderna fortfarande långsiktig fenotypisk stabilitet i odlingen för de flesta plateable lots av PHH. En annan metod som används för att odla PHH är att göra 3D-sfäroider; Som tidigare konstaterats av Glicklis et al.4 kan det dock finnas tekniska utmaningar med reproducerbarheten av sfäroidstorlek på grund av donatorvariabilitet. I ett försök att göra en mer fysiologiskt relevant levermodell har flercelliga modeller utvecklats. Som beskrivits av Ware et al.7, med hjälp av mikromönstring, murina fibroblaster och primära humana sinusoida endotelceller omgivna av PHH möjliggjorde längre in vitro-odlingstider. Mikromönstring kan dock vara en komplex och tidskrävande process, och de icke-mänskliga matarcellerna kan bidra till bakgrund i metaboliska signaler, vilket begränsar användbarheten av denna plattform i vissa applikationer. Användningen av olika icke-leverceller, inklusive dermala fibroblaster från människa och råtta och endotelceller från bovina aorta som matningsceller för samodling av hepatocyter, har visat albuminutsöndring och bildandet av täta korsningar som liknar samodlingar av matarceller med leverursprung16. Mekanismen för interaktioner mellan TV2D+ icke-levermatarceller och PHH:erna i odling behöver dock undersökas ytterligare för att bättre förstå påverkan på stabiliteten och funktionaliteten hos PHH:erna i detta system. Odlingssystemet som tidigare beskrivits av Weaver et al.8 kan framgångsrikt odla PHH i leverkolonier i upp till 42 dagar och bilda omfattande gallkanalikulära nätverk. PHH:erna som odlades i detta system bibehöll viktiga leverfunktioner, inklusive cytokrom 1A2, 2B6 och 3A4-aktivitet och uridin 5′-difosfo-glukuronosyltransferas (UGT)-baserad enzymaktivitet, fas I- och II-metabolitbildning, albuminproduktion och ureasyntes i minst 22 dagar in vitro utan Matrigel. Detta odlingssystem producerar stabila, fysiologiskt relevanta resultat som lätt kan anpassas till alla laboratorier för farmakologiska och toxikologiska tillämpningar. Även om viktiga PHH-funktioner bibehålls i TV2D+-systemet har inga direkta jämförelser gjorts med 3D-sfäroidmodellen; Framtida arbete som jämför samma PHH-donatorer mellan odlingssystemen kommer dock att visa sig vara värdefullt för att bestämma gränserna och fördelarna med båda metoderna.
Potentiella tillämpningar av TV2D+ inkluderar utvärdering av metabolisk clearance och läkemedelsinteraktioner av substanser med låg omsättning, läkemedelsinducerad leverskada och riskbedömning av jordbrukskemikalier. Att korrekt förutsäga leverclearance av nya och framväxande läkemedel är beroende av en stabil och förlängd PHH-kultur med bibehållande av viktig hepatocellulär funktionalitet, vilket är särskilt utmanande vid utvärdering av substanser med låg omsättning. Dessutom är riskbedömning och kemiskt inducerad levertoxicitet stora hälsoproblem, och nuvarande modeller ger inte den långsiktiga stabilitet och funktionalitet i odling som krävs för att korrekt utvärdera potentiell kronisk kemisk toxicitet som kan vara sekundär till akut exponering. Friska och sjuka PHH:er odlade i TV2D+ uppvisade karakteristiska skillnader i funktion och lipiddisposition som bibehölls över tid17. Dessa studier stödjer TV2D+ som ett lovande verktyg för en rad olika farmakologiska och toxikologiska tillämpningar.
Disclosures
JO, LW, EG, EL, SP och JW är anställda av LifeNet Health, den ideella organisationen som producerar TV2D+.
Acknowledgments
Vi vill tacka Mellissa Keller och Wendy Hetman för deras hjälp med manuskript och figurgranskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
| 15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
| Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
| Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
| AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
| Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
| Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
| Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
| Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
| Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
| Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
| DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
| Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
| Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
| Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
| Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
| Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
| Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
| IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
| ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
| Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
| Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
| Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
| Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
| Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
| Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
| Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
| Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
| Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
| Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
| Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |
References
- Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
- Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity. Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).
- Baudy, A. R., et al. Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry. Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Khetani, S. R., et al. Microengineered liver tissues for drug testing. Journal of Laboratory Automation. 20 (3), 216-250 (2015).
- Monckton, C. P., Brown, G. E., Khetani, S. R. Latest impact of engineered human liver platforms on drug development. APL Bioengineering. 5 (3), 031506 (2021).
- Ware, B. R., Durham, M. J., Monckton, C. P., Khetani, S. R. A cell culture platform to maintain long-term phenotype of primary human hepatocytes and endothelial cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 187-207 (2018).
- Weaver, J. R., et al. The morphology, functionality, and longevity of a novel all human hepatic cell-based tri-culture system. Toxicology In Vitro. 86, 105504 (2023).
- Li, W., et al. Matrix stiffness and shear stresses modulate hepatocyte functions in a fibrotic liver sinusoidal model. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), G272-G282 (2021).
- Thompson, S. M., et al. Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study. Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).
- Mooney, D., et al. Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix. Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).
- Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. L. Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration. The FASEB Journal. 10 (13), 1471-1484 (1996).
- Hamilton, G. A., et al. Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions. Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Sivaraman, A., et al. A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Goulet, F., Normand, C., Morin, O. Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes. Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).
- Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences. Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. 62nd Annual Meeting & ToxExpo, , Nashville, TN. 4283 (2023).
