Summary
Nylige tekniske fremskridt muliggjorde den skalerede produktion af en in vitro-platform til lægemiddelmetabolisme og toksicitetsapplikationer. Et helt menneskeligt 2D+ leversystem (TV2D+) giver fysiologisk relevante resultater ved hjælp af traditionelle todimensionelle dyrkningsmetoder. Denne protokol understøtter slutbrugere i opsætning, vedligeholdelse og anvendelse af systemet.
Abstract
Det er fortsat en udfordring at finde en langsigtet, humanrelevant kulturmodel for primære humane hepatocytter (PHH'er) til farmakologiske og toksikologiske undersøgelser. Nuværende in vitro-modelplatforme er ofte ubelejlige og komplekse, mangler fænotypisk stabilitet over tid og understøtter ikke flere PH-partier, der mangler eksperimentel reproducerbarhed og fleksibilitet. Her leverer vi en detaljeret protokol til optøning, plettering og vedligeholdelse af et menneskeligt 2D + leversystem (TV2D +), der udnytter standard todimensionelle (2D) kulturteknikker og udstyr, samtidig med at levetiden og fænotypisk stabilitet over tid, der typisk ledsager mere komplekse tredimensionelle (3D) systemer, opretholdes. Resultaterne viser vedhæftning og procent blodpladeevne i TV2D+ som funktion af PHH såtæthed samt stabil funktionalitet i mindst 2 uger i kultur. En række PHH-såtætheder vurderes for at opnå en vellykket langsigtet kultur. Når de er etableret korrekt, organiserer PHH'erne i TV2D + sig i hepatocytkolonier, udtrykker en hepatisk-specifik markør og opretholder levedygtighed, arkitektonisk integritet og fysiologisk relevante niveauer af albumin og urinstof. Denne unikke kombination af egenskaber gør TV2D+-systemet til en velegnet levermodel til en række farmakologiske og toksikologiske anvendelser.
Introduction
Forudsigelse af terapeutisk sikkerhed og effekt er en vigtig del af udviklingen af prækliniske lægemidler. Imidlertid er konventionelle prækliniske in vitro levermodeller begrænsede i deres evne til nøjagtigt at efterligne in vivo levercellulære mikromiljø og opretholde hepatocytfunktionalitet og morfologi over tid. Der er behov for modeller, der giver stabil metabolisk kompetence i mere end 1 uge til at vurdere forbindelser med langsom omsætning eller undersøge resultater forbundet med subakut eller kronisk eksponering. In vivo dyreforsøg kan ofte ikke forudsige lægemidlets effektivitet og risiko på grund af translationelle artsforskelle i humane hepatiske clearancemekanismer1. Nuværende in vitro 2-dimensionelle (2D) levermodeller, såsom traditionel primær human hepatocyt (PHH) monokultur eller sandwichkulturer, mangler fænotypisk stabilitet og levetid i kultur, hvilket fører til tab af nøgle hepatocellulær funktion og arkitektonisk integritet over tid2. En alternativ metode involverer dannelsen af 3-dimensionelle (3D) hepatocytsfæroider, der tilbyder et mere relevant mikromiljø versus 2D-kultur. Denne metode er imidlertid begrænset af tilgængeligheden af råmaterialer, udvælgelse af PHH-donorpartier, reproducerbarhed og tab af levedygtighed med stigende sfærisk størrelse 3,4,5,6. Multicellulære platforme er blevet introduceret, hvorved PHH'er podes med fødeceller på mikromønstrede plader i fast størrelse. Selvom disse modeller kan muliggøre længere dyrkningstider, kan ikke-humane fødeceller, der anvendes i disse platforme, ændre eksperimentelle resultater og begrænse deres anvendelse på grund af medfødt baggrundsbidrag til lægemiddelclearance og metaboliske profiler 1,7. TruVivo all-human 2D + hepatisk system (TV2D +), der for nylig blev beskrevet i Weaver, et al8, blev udviklet til at løse nogle af begrænsningerne ved traditionelle, co-kultur og 3D-kulturmetoder af PHH'er. De ikke-leverføderceller reducerer forskellene mellem arterne i metabolisme og parakrin produktion og giver den nødvendige støtte til primære hepatocytter på en reproducerbar, robust måde, der ikke kan leveres af tilsvarende ikke-parenkymale leverceller fra et enkelt donorparti på grund af begrænsninger i ekspansion, fænotype og ydeevne. De valgte fødeceller kunne udvides konsekvent før brug og manglede behovet for transformation eller differentiering. Som beskrevet af Glicklis et al.4 og Khetani et al.5 har 3D-kulturmodeller som hepatocytsfæroider udfordringer med reproducerbarhed på grund af donorvariabilitet og opretholdelse af konsistens i sfærisk størrelse, hvilket påvirker næringsstofdiffusion i sfæroider større end 200 μm, hvilket fører til nedsat levedygtighed og funktionalitet. Ligesom 3D-sfærisk dannelse er TV2D + -systemet afhængig af selvmontering af PHH'er; imidlertid spredes de dannede PHH-kolonier over brøndens overfladeareal i en enkeltcelledybde snarere end komprimeret til et enkelt aggregat. Denne dyrkningsmetode kan være nyttig til at adressere donorvariabilitet, så PHH'er kan belægges, dyrkes og opretholde grundlæggende funktionalitet ved forskellige såtætheder. TV2D + -systemet kan også øge robustheden af brugerhåndtering på grund af tab under manipulation eller specialudstyr, der kræves for at udføre udvidet kultur i 3D-sfæroider.
TV2D+-systemet kombinerer standard 2D-kultur med den levetid og fænotypiske stabilitet, der typisk ledsager 3D-systemer. Protokollen beskrevet heri giver trinvise anvisninger til brugere med grundlæggende vævskulturfærdigheder i laboratorier udstyret med standardudstyr såsom biosikkerhedsskabe, centrifuger og CO2 -inkubatorer. Hvert trin i processen er beskrevet detaljeret, herunder medieforberedelse, optøning, plettering og vedligeholdelse af det resulterende kultursystem. Protokollen indeholder også en metode til bestemmelse af basiske hepatocytfunktionalitetsudgange, albumin og urinstof samt immunofluorescerende billedanalyse til bestemmelse af PH-vedhæftning til normalisering. Når de er etableret korrekt, organiserer PHH'erne i TV2D + sig i hepatocytkolonier, efterligner den oprindelige levermorfologi og opretholder udvidet levedygtighed, arkitektonisk integritet og fysiologisk relevante niveauer af albumin og urinstof i mindst 2 uger8. Fordi systemet kan tillade en række PHH-såtætheder, kan det være nyttigt at øge tilgængeligheden af mindre pladebare PHH-partier, der har ønskelige donoregenskaber. Denne kombination af tilgængelighed og funktionalitet gør TV2D+ til en velegnet levermodel til en række farmakologiske og toksikologiske anvendelser.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne fra Lifenet Healths etiske komité. Manuskriptet indeholder ingen undersøgelser med menneskelige deltagere eller dyreforsøg udført af nogen af forfatterne. Alle celler blev isoleret fra donorvæv, der var fuldt godkendt til forskningsformål af Lifenet Health.
1. Medium forberedelse
- Optø en flaske hver fødecelleoptøningsmedium, supplement A, supplement B og supplement C (se materialetabel) i et 37 °C vandbad eller 16-24 timer ved 4 °C.
- Hele flasken (10 ml) fødecelleoptøningsmedium hældes i et konisk rør på 15 ml eller 50 ml.
BEMÆRK: Cellepillens størrelse bliver lettere at se ved hjælp af et 15 ml konisk rør. - Tilsæt 4,5 ml supplement B og 11 ml supplement A til en flaske pletteringsmedium (75 ml) (se materialetabel) for at lave et komplet pletteringsmedium.
BEMÆRK: Komplet belægningsmedium har en koncentration på FBS <5% v / v. - I en separat flaske tilsættes 100 ml dyrkningsmedium (se materialetabel), 1 ml supplement C og 14 ml supplement A for at lave et komplet dyrkningsmedium.
BEMÆRK: Komplet dyrkningsmedium har en koncentration af FBS <1% v / v - Opbevar resterende kosttilskud C og tillæg A ved -20 °C indtil uge 2 medium tilberedning.
BEMÆRK: Gentagne fryse-optøningscyklusser reducerer kosttilskuddets holdbarhed. Det anbefales kun at fryse-optø en gang. - Før brug opvarmes 10 ml fødecelleoptøningsmedium, hepatocytoptøningsmedium, komplet platingmedium og komplet dyrkningsmedium i 20-30 minutter i et 37 °C vandbad.
2. Optøning, tælling og plettering af humane fødeceller (figur 1A)
- Fødecellerne dyrkes ca. 1 time før såning af PHH'er. Optøningscellerne (se materialetabellen) i et 37 °C vandbad i 1-2 min.
BEMÆRK: Undgå langvarig eksponering (f.eks. >2 min) ved at overvåge optøningen og fjerne hætteglasset, når væsken løsner sig i kryovialen, når den vendes på hovedet. - Umiddelbart efter optøning placeres fødecellerne på is.
- Ved hjælp af aseptiske teknikker tilsættes frisk optøede celler i et biosikkerhedsskab (BSC) til 10 ml fødecelleoptøningsmedium.
- Brug en 1000 μL pipette til at vaske hætteglasset én gang med 1 ml celle/optø medium suspension og opsaml det.
- Spin ved 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten kasseres forsigtigt, så cellepillen ikke forstyrres ved pipettering eller vakuumudsugning. Resuspender cellepellet i 1 ml komplet pletteringsmedium og tæl fødercellerne.
BEMÆRK: Feederceller kan tælles ved hjælp af acridinorange og propidiumiodid (AOPI) på en automatiseret celletæller eller trypanblå ved hjælp af et hæmacytometer. Celletal kan variere afhængigt af teknologi og bruger. Du opnår de bedste resultater ved at tælle dublerede prøver og forblive konsistent i den valgte metode. - Fortynd cellesuspensionen til 100.000 celler/ml ved hjælp af det komplette pletteringsmedium.
- Plade 500 μL (50.000 celler) pr. hul i den fortyndede cellesuspension på en kollagenbelagt plade med 24 brønde (se materialetabel).
- Ryst pladen i en nord(N)-syd(S)-øst(E)-vest (W)-bevægelse ved hjælp af en bevægelse frem og tilbage i N-S-retningen 2 gange efterfulgt af den samme bevægelse E-W. Gentag denne rysteprotokol 2 gange mere i i alt 3 runder.
BEMÆRK: Udfør rystelser med moderat kraft for at undgå stænk på pladelåget, mens du stadig hjælper med cellefordeling (se video). - Inkuber ved 37 °C/5% CO2 i 60 min.
- Se fødercellevedhæftning, inden du fortsætter med optøning af hepatocytter.
BEMÆRK: Acceptabel fødecellefastgørelse er visuelt ca. 50% sammenflydende.
3. Optøning, tælling og plettering af primære humane hepatocytter (figur 1B)
- Efter 30 minutters fødecellekultur filtreres forvarmet hepatocytoptøningsmedium gennem en 0,2 μm polyethersulfon (PES) filterenhed.
- Optø PHH'er i et 37 °C vandbad i 1-2 min.
BEMÆRK: Undgå langvarig eksponering (f.eks. >2 min) ved at overvåge optøningen og fjerne hætteglasset, når væsken løsner sig i kryovialen, når den vendes på hovedet. - Umiddelbart efter optøning skal du placere PHH'er på is.
- I en BSC hældes PHH-suspension i hepatocytoptøningsmediet.
BEMÆRK: Undgå pipettering af PHH-cellesuspensioner, når det er muligt. Det er mest afgørende ikke at udføre pipettering under overførslen af optøede PHH'er fra kryovial- til optøningsmediet. - Brug en 1000 μL pipette til at vaske hætteglasset 3-4 gange ved forsigtigt at pipettere 1 ml hepatocyt/optøningsmedium suspension tilbage i hætteglasset og opsamle vasken ved at hælde den tilbage i optøningsmediet.
- Hætte og omvendt forsigtigt optøet PHH-suspension 5 gange.
- Spin ved 100 x g i 8 min ved RT.
- Supernatanten kasseres forsigtigt, så cellepillen ikke forstyrres ved pipettering eller vakuumudsugning. Til væggen i det koniske rør tilsættes 3 ml komplet pletteringsmedium.
- Rock det koniske rør fra side til side for at resuspendere cellepelleten.
- Tilsæt yderligere 5 ml komplet pletteringsmedium til de resuspenderede hepatocytter.
- Tæl PHH'er.
BEMÆRK: PHH'er kan tælles ved hjælp af AOPI på en automatiseret celletæller eller trypanblå ved hjælp af et hæmacytometer. Celletal kan variere afhængigt af teknologi og bruger. Du opnår de bedste resultater ved at tælle dublerede prøver og forblive konsistent i den valgte metode. - Fortynd cellesuspensionen til den ønskede såtæthed (300.000-600.000 PHH'er/ml) ved hjælp af det komplette pletteringsmedium.
BEMÆRK: Optimal hepatocytsåtæthed kan variere fra parti til parti. Den anbefalede såtæthed for et givet parti vil fremgå af analysecertifikatet (COA). Brug nedenstående ligning til at bestemme hepatocytter / ml for en 24-brøndplade.
- Fra de belagte føderceller fjernes mediet ved pipettering eller vakuumaspiration.
BEMÆRK: For at sikre fødercellernes levedygtighed anbefales det at ændre højst 3 brønde ad gangen. - Der plades straks 500 μL (150.000-300.000 celler) pr. hul af den fortyndede hepatocytsuspension på den præcoatede kollagen 24-brøndplade, der indeholder fødeceller.
- Ryst pladen i en N-S-E-W-bevægelse ved hjælp af en frem og tilbage bevægelse i N-S-retningen 2 gange efterfulgt af den samme bevægelse E-W. Gentag denne rysteprotokol 2 gange mere i i alt 3 runder.
BEMÆRK: Udfør rystelser med moderat kraft for at undgå stænk på pladelåget, mens du stadig hjælper med cellefordeling. - Der inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i 2-4 timer. I de første 60 minutters kultur rystes pladen hvert 15. minut i N-S-E-W-bevægelse som i trin 3.15 ovenfor.
- Efter inkubation fjernes pladen fra inkubatoren og placeres i BSC.
- Ryst pladen, og fjern hele belægningsmediet ved pipettering eller vakuumudsugning.
BEMÆRK: For at sikre kulturens levedygtighed anbefales det at skifte ikke mere end 3 brønde ad gangen. - Tilsæt straks 500 μL forvarmet komplet dyrkningsmedium til hvert hul.
4. Vedligeholdelse
- Alikvote og forvarm komplet dyrkningsmedium i et 37 °C vandbad i 20-30 min. Der kræves ca. 13,5 ml medium til en plade med 24 huller.
- Foderkulturer fodres dagligt med 500 μL pr. hul frisk, forvarmet komplet dyrkningsmedium.
BEMÆRK: For at sikre kulturens levedygtighed anbefales det at skifte ikke mere end 3 brønde ad gangen. - Forbered frisk komplet kulturmedium hver 7. dag.
5. Indsamling af kultursupernatantprøver til måling af albumin og urinstof
- På dag 7, 10 og 14 opsamles 500 μL substrat fra de(n) ønskede prøvebrønd(e) i et eller flere mikrocentrifugeglas som vist i figur 1C.
- Centrifuger prøven/prøverne ved 320 x g i 10 minutter ved 4 °C til pelletrester.
- Brug en pipette til at overføre prøvesupernatant(er) til nye mikrocentrifugeglas, så pellets ikke forstyrres.
- Prøverne køres på albumin- og/eller urinstofanalysen (se henholdsvis afsnit 10 og 11).
BEMÆRK: Prøver kan opbevares ved -20 °C til -80 °C i 2 uger.
6. Farvning dag I
FORSIGTIG: Fikseringsbuffer indeholder paraformaldehyd. Paraformaldehyd kan forårsage øjenskader, hudirritation og organtoksicitet. Arbejd i et område med god ventilation og brug passende personlige værnemidler (PPE).
- Efter indsamling af mellemprøver på dag 14 tilsættes 300 μL fikseringsbuffer (se materialetabellen) til hvert hul, der skal farves, som vist i figur 1C. Plet mindst 2 brønde.
- Inkuber ved 4 °C i 20-60 min.
- Forbered 1x permeabiliseringsbuffer (se materialetabel) ved at tilsætte 5 ml 10x stamopløsning til 45 ml 1x PBS (se materialetabel).
BEMÆRK: 1x permeabiliseringsbufferen kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned. - Vask 2 gange med 300 μL 1x permeabiliseringsbuffer på is.
- Tilsæt 300 μL primært antistof cytokeratin 18 (se materialetabel) ved anvendelse af en 1:1000 fortynding i 1x permeabiliseringsbuffer på is.
BEMÆRK: Inkuber minimalt en brønd med 1x permeabiliseringsbuffer kun for en sekundær antistofkontrol. - Der inkuberes 16-24 timer ved 4 °C.
7. Farvning dag II
- Den følgende dag fjernes det primære antistof ved pipettering eller vakuumaspiration.
- Vask 2 gange med 300 μL pr. hul med 1x permeabiliseringsbuffer på is.
- Der tilsættes 300 μL fluorescerende sekundært antistof (se materialetabel) ved hjælp af en 1:500 fortynding i 1x permeabiliseringsbuffer (kun sekundær kontrol).
BEMÆRK: Undgå lys ved brug af fluorescerende antistoffer. - Inkuber i 30-45 minutter ved 4 °C i mørke.
- Det sekundære antistof fjernes ved pipettering eller vakuumaspiration.
- Vask 2 gange med 300 μL pr. hul med 1x permeabiliseringsbuffer på is.
- Vask 1 gang med 300 μL pr. hul på 1x PBS.
- Der tilsættes 150 μL 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) monteringsmedium (se materialetabel) til hvert hul og inkuberes i 15 minutter ved RT i mørke.
BEMÆRK: Pladen kan pakkes ind i parafilm og opbevares ved 4 °C i mørke i 1 uge. - Se under et fluorescerende mikroskop. Tag 5 billeder af hver specifik fluorescerende kanal for hver brønd ved hjælp af 10x objektivobjektivet (sørg for, at et billede har en skalabjælke).
BEMÆRK: DAPI har en excitation/emission på 358 nm/461 nm. Brug et fluorescerende mikroskop udstyret med passende detektionsfiltre til både DAPI og det sekundære antistof fluorofor.
8. ImageJ-analyse (figur 2)
BEMÆRK: Det anbefales at bruge ImageJ version 1.52a eller nyere.
- Åbn et billede, der indeholder en skalalinje, i ImageJ. Klik på ikonet Lige linje , og tegn en streg til skalalinjens nøjagtige længde [Figur 2 (1)]
BEMÆRK: Klik om nødvendigt på ikonet Forstør glas for at zoome ind eller ud. - Klik på fanen Analyser . Fremhæv og klik på Indstil skala.
- Skift kendt afstand til afstanden til skalabjælken. Skift længdeenheder til enhederne på skalabjælken. Anvend indstillingerne globalt ved at markere Global. Klik på OK for at indstille skalaen.
BEMÆRK: Når denne indstilling er anvendt, viser hvert billede, der åbnes, det beregnede område af synsfeltet i enheder, der indtastes af brugeren. - Åbn et billede, der kun indeholder DAPI, i ImageJ. Klik på fanen Proces og fremhæv Træk baggrund fra. Fjern baggrunden 50 pixel ad gangen, indtil de ufarvede områder er sorte.
BEMÆRK: Hvis billedet ikke indeholder baggrund, er dette trin ikke påkrævet. - Klik på fanen Billede , og fremhæv Type. Klik på 8-bit for at gøre billedet gråtoner [Figur 2 (2)].
- Tærskel billedet manuelt eller automatisk for at inkludere alle DAPI-partikler (vær forsigtig med ikke manuelt at overskride tærsklen) [Figur 2 (3)]. Klik på fanen Billede , og fremhæv Juster. Klik på Tærskel. Klik på Anvend , når du er færdig.
- Klik på fanen Proces , og fremhæv Binær. Klik på Vandskel.
- Klik på fanen Analysér, og fremhæv /klik på Analysér partikler [Figur 2 (4)]. Indstil størrelsen til 5-uendelig og cirkularitet til 0,00-1,00. På rullelisten Vis skal du vælge Konturer. Sørg for, at Vis resultater, Opsummer og Inkluder huller er markeret. Klik på OK.
BEMÆRK: Det ønskede partikelområde kan justeres, hvis tærskelværdien giver baggrundspixels. - Registrer optællingsresultatet som TOTAL DAPI.
- Åbn et flettet Cytokeratin 18/DAPI-billede i ImageJ.
- Brug ikonet Multi-Point [Figur 2 (5)] til at tælle alle DAPI-partikler, der ikke er farvet for Cytokeratin 18, manuelt.
- Optag resultatet som FEEDER-CELLER. Brug ligningen nedenfor til at bestemme hepatocyt DAPI.
Hepatocyt DAPI = Total DAPI - Feeder Cell DAPI
9. Kvantificering af samlede bundne hepatocytter og procentvis vedhæftning (blodpladeevne)
- Opret en skalafaktor for kulturområdet med 24 brønde ved hjælp af nedenstående ligning. Målinger af synsfelt findes øverst på hvert billede, der åbnes [Figur 2 (2), grøn boks].
- Beregn de samlede vedhæftede hepatocytter ved hjælp af nedenstående ligning.
Vedhæftede hepatocytter = skalafaktor × hepatocyt DAPI - Beregn den procentvise vedhæftning af hepatocytterne ved hjælp af nedenstående ligning.
10. Albumin assay
- Albuminproduktionen måles ved hjælp af et sandwichenzymbundet immunosorbentassay (ELISA) (se materialetabellen) på prøver fortyndet kl. 1:200.
BEMÆRK: For nøjagtighed bekræfter brugeren, at prøverne falder inden for standardkurvens lineære område. Det specificerede sæt indeholder alle materialer og instruktioner til udførelse af analysen. - Normaliser prøvekoncentrationer til vedhæftede hepatocytter ved hjælp af nedenstående ligning.
11. Urea-analyse
FORSIGTIG: Blod urinstof nitrogen (BUN) syre reagens indeholder svovlsyre. Svovlsyrekoncentrationen i BUN-syrereagenset betragtes som ætsende. Må ikke indtages. Arbejd i et område med god ventilation og brug passende personlige værnemidler.
- Ureasyntese måles ved hjælp af en modificeret diacetylmonoximmetode (se materialetabel).
- Fortynd 53,3 μL 75 mg / dl urinstof til 346,7 μL komplet dyrkningsmedium for at gøre Standard # 1 (100 μg / ml)
- Mærk rør 2-8 og brug en 1: 2 seriel fortynding til at lave urinstofanalysestandarderne (tabel 1).
- Der tilsættes 10 μL prøve eller standard til hullerne i en sortvægget, klarbundet 96-brøndsplade (se materialetabellen).
- Der tilsættes 150 μL BUN-reagens til hvert hul, der indeholder prøven. Forbered BUN-reagens ved at blande 1/3 BUN-farvereagens med 2/3 BUN-syrereagens. Brug ligningen nedenfor til at hjælpe med beregninger.
BUN-farvereagens (ml) = Samlet behov for BUN-reagens × 0,333
BUN-syrereagens (ml) = Samlet behov for BUN-reagens × 0,667 - Inkuber pladen i 90 minutter i en ovn eller inkubator ved 60 °C.
- Pladeabsorbansen aflæses straks ved 540 nm og 650 nm.
- Opret en standardkurve ved at trække blindprøve- og baggrundsabsorbans (650 nm) fra alle prøver og standarder. Generer en bedst tilpasset linje ved lineær regressionsanalyse.
- Bestem ukendt prøvekoncentration ud fra standardkurven.
- Normaliser prøvekoncentrationerne til vedhæftede hepatocytter ved hjælp af nedenstående ligning.
Representative Results
Den overordnede metode til plettering, dyrkning og grundlæggende funktionalitetstest af leverkultursystemet involverer almindelige primære cellekulturteknikker og analyse, som illustreret i figur 1. Hepatocytbinding og procent blodpladeevne blev beregnet på dag 14 ved hjælp af ImageJ-analyse af mindst fem billeder af cytokeratin 18 og DAPI-farvning pr. brønd (figur 2). Repræsentative billeder af PHH'er dyrket med føderceller er vist i figur 3. De forskellige hepatiske såtætheder viste visuelle forskelle i sammenløb baseret på såtæthed og opretholdt typisk lever, kuboid morfologi i 14 dages kultur. Billeder af hepatocytdonorpartier A og B blev taget for hver testet såtæthed (figur 4A). Den gennemsnitlige procent blodpladeevne for donor B (89,04% ± 3,99%, 198,552 ± 49,885 PHH'er) var højere end donor A (66,08% ± 6,67%, 146,128 ± 33,063 PHH'er) på tværs af alle anvendte såtætheder (figur 4B). Donor A havde signifikant højere procent blodpladeevne ved hjælp af 150.000 PHH'er / brønd (76.07% ± 12.87%) sammenlignet med 250.000-300.000 PHH'er / brønd (62.75% ± 9.64%). Donor B viste ingen signifikante forskelle i hepatocytprocent blodpladeevne. Donor B havde den laveste hepatocytplateabilitet (85,78% ± 13,25%) ved den højeste såtæthed, 300.000 PHH'er / brønd. I lighed med donor A havde sådonor B ved 150.000 PHH'er / brønd den højeste procent blodpladeevne af hepatocytter (94,75% ± 15,07%).
Albuminproduktion og urinstofsyntese blev målt på tre tidspunkter i løbet af den 14-dages dyrkningsperiode og normaliseret til beregnede vedhæftede hepatocytter. Samlet set havde donor A øget albuminproduktionen sammenlignet med donor B (41,32 ± 4,58 μg alb/dag/106 PHH'er vs. 34,66 ± 10,03 μg alb/dag/106 PHHs) (figur 5). Donorer A og B havde den højeste albuminproduktion af hepatocytter ved henholdsvis 150.000 PHH'er / brønd, 45,91 ± 5,96 μg alb / dag / 106 PHH'er og 48,67 ± 20,44 μg alb / dag / 106 PHH'er. Der blev ikke set signifikante forskelle i albuminproduktionen i de anvendte såtætheder. Som anført af Baudy et al.3 er det ønskeligt, at levermikrofysiologiske systemer opretholder konsekvent albuminproduktion og urinstofsyntese med mindre end 50% ændring over 14 dages kultur. Variationskoefficienten (CV) blev beregnet ved at dividere gennemsnittet med standardafvigelsen for dag 7, 10 og 14. Alle prøver blev kørt i to eksemplarer. CV'et for albuminproduktion i løbet af den 14-dages dyrkningsperiode ved 150.000 PHH'er / brønd var 12,24% for donor A og 37,97% for donor B, mindre end det ønskede 50% kriterium. En høj varians i albuminproduktionen blev set hos både donor A og donor B, når de blev sået ved 250.000 og 300.000 PHH'er / brønd. Ved disse såtætheder oplever begge donorer et kraftigt fald i albuminproduktionen mellem dag 7, 10 og 14 i kulturen (CV-donor A, 22,49%, og donor B, 45,07%).
Donorurinstofsyntese B (95,09 ± 18,91 μg urinstof/dag/106) blev øget sammenlignet med donor A (64,92 ± 4,66 μg urinstof/dag/106 PHH'er) ved gennemsnit af dag 7, 10 og 14 PHH partispecifikke data (figur 6). Donor B (113,49 ± 37,34 μg urinstof / dag / 106 PHH'er) og donor A (69,12 ± 17,06 μg urinstof / dag / 106 PHH'er) havde den største urinstofsyntese over en 14-dages dyrkningsperiode såning ved en densitet på henholdsvis 150,000 PHH'er / brønd og 200,000 PHH'er / brønd. Begge donorpartier havde den laveste urinstofproduktion og højeste CV på 300.000 PHH'er / brønd. Der blev ikke set signifikante forskelle i urinstofsyntese i de anvendte såtætheder. Det laveste CV for urinstofsyntese for donor A blev set, når det blev dyrket ved 250.000 PPH'er / brønd (23.11%) og 200.000 PHH'er / brønd for donor B (28.26%). Som fremhævet af disse resultater afhænger optimal såtæthed for et givet parti PHH af det ønskede sammenløbsniveau på tidspunktet for analysen og arten af de resultater, der måles; Højere såtæthed korrelerer muligvis ikke altid med højere signal eller dynamisk område.
Figur 1: Rutediagram over plettering, dyrkning og funktionel test af hepatocytter med føderceller. (A) Fødeceller optøes i et specifikt optøningsmedium (se materialetabel), resuspenderes i et komplet pletteringsmedium (se materialetabel), og cellerne tælles. Cellerne fortyndes, belægges og inkuberes i 60 minutter ved 37 °C/5% CO2. (B) Hepatocytter optøes i et specifikt optøningsmedium (se materialetabellen), resuspenderes i et komplet pletteringsmedium, og cellerne tælles. Hepatocytterne fortyndes og belægges med føderceller. Cellerne inkuberes i 2-4 timer ved 37 °C/5% CO2 og rystes i en N-S-E-W bevægelse hvert 15. minut i de første 60 minutters dyrkning. Pletteringsmediet erstattes med et forvarmet komplet dyrkningsmedium til vedligeholdelse af kulturen (se materialetabel). Kulturerne fodres dagligt. (C) På dag 7, 10 og 14 udtages mellemprøver til albumin- og urinstoftestning. Efter indsamling af prøver på dag 14 fikseres cellerne og farves med Cytokeratin 18 (se materialetabel) antistof 16-24 timer ved 4 °C. Endvidere inkuberes de i et passende sekundært antistof, vaskes og monteres med DAPI (se materialetabel) til optagelse og billedanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billedanalyse ved hjælp af ImageJ-software. ImageJ behandling af optagne billeder. Trin 1: En skala anvendes på alle billeder baseret på den mikroskopspecifikke skalalinje. Trin 2: Billedtypen ændres. Trin 3: Der anvendes en tærskelgrænse for at vælge DAPI-partikler. Trin 4: En partikelanalyse udføres, og tællingen registreres. Trin 5: For at bestemme antallet af vedhæftede føderceller tælles et fusioneret billede ved hjælp af flerpunktsværktøjet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Morfologi af forskellige hepatiske såtætheder dyrket med fødeceller. Repræsentative billeder på dag 7 og 14 af PHH'er dyrket med fødeceller (50.000 celler / brønd) ved leversåtætheder på 150.000, 200.000, 250.000 og 300.000 PHH'er / brønde. Billeder blev taget ved hjælp af en 10x objektiv linse på et omvendt fasekontrastmikroskop. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Fluorescerende immuncytokemi af forskellige hepatiske såtætheder dyrket med føderceller. (A) Repræsentative billeder af Cytokeratin 18 (rød) farvning på dag 14 ved hepatiske såtætheder på 150.000, 200.000, 250.000 og 300.000 PHH'er / brønde. To brønde for hver såtæthed blev fastsat i 30 minutter ved 4 °C. Brønde blev inkuberet 16-24 timer ved 4 ° C med primært antistof ved 1:1000. Et sekundært antistof blev anvendt kl. 1:500 i 30 minutter ved 4 °C i mørke. DAPI (blå) nuklear plet blev tilsat til brønde i 15 minutter ved stuetemperatur. Billeder blev taget ved hjælp af en 10X objektiv linse på et omvendt fluorescerende mikroskop. Skalabjælke = 100 μm. (B) Beregnede vedhæftede hepatocytter og procent blodpladeevne af forskellige hepatiske såtætheder beregnet ved hjælp af ImageJ. *p ≤ 0,05, til procent blodpladeevne for 200.000, 250.000 og 300.000 PHH'er / brønd. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse (n ≥ 5 billeder pr. tilstand). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Albuminproduktion af hepatocytter dyrket med fødeceller. Albuminproduktion fra hepatiske såtætheder ved 150.000, 200.000, 250.000 og 300.000 PHH'er / brønd. Kolonner repræsenterer det 14-dages gennemsnit af mikrogram albumin / dag normaliseret til samlede vedhæftede hepatocytter. En linje repræsenterer CV mellem dag 7, 10 og 14. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse (n ≥ 2 huller pr. tilstand med replikater). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Ureasyntese af hepatocytter dyrket med fødeceller. Ureasyntese fra hepatiske såtætheder ved 150.000, 200.000, 250.000 og 300.000 PHH'er / brønd. Kolonner repræsenterer 14-dages gennemsnit af μg urinstof / dag normaliseret til samlede vedhæftede hepatocytter. En linje repræsenterer %CV mellem dag 7, 10 og 14. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse (n ≥ 2 huller pr. tilstand med replikater). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Standard (er) # | Koncentration (μg/ml) | Ureaopløsning (μL) | Komplet kultur (μL) |
| 1 | 100 | 53.3 75 mg/dl lager |
346.7 |
| 2 | 50 | 100 (S1-opløsning) |
100 |
| 3 | 25 | 100 (S2-opløsning) |
100 |
| 4 | 12.5 | 100 (S3-opløsning) |
100 |
| 5 | 6.26 | 100 (S4-opløsning) |
100 |
| 6 | 3.125 | 100 (S5-opløsning) |
100 |
| 7 | 1.5625 | 100 (S6-opløsning) |
100 |
| Hvid | 0 | 0 | 100 |
Tabel 1: Forberedelse af urinstofstandardprøve. Brug 75 mg / dl stamurinstof til at fremstille en 100 μg / ml urinstofopløsning. Aliquot de foreslåede volumener for at nå den endelige koncentration for standardkurven.
Discussion
Det beskrevne leverkultursystem kan etableres i laboratorier, der er udstyret med standard vævskulturinstrumentering. Systemet består af PHH'er dyrket med føderceller og giver brugeren mulighed for at dyrke PHH'er i mindst to uger med stabil albuminproduktion og urinstofsyntese. På grund af PHH-donorpartiets variabilitet anbefales kun forhåndsscreenede og kvalificerede PHH'er til brug i systemet. Selv om antallet af vedhæftede PHH'er varierer afhængigt af donorparti og såtæthed, forbliver den relative blodpladedannelse den samme inden for hvert donorparti. Mens anbefalede såtætheder anbefales, antyder ovenstående data, at hepatocytsåtætheden kan justeres til forskellige eksperimentelle behov; Det skal dog bemærkes, at såning af et større antal PHH'er muligvis ikke giver højere eller mere konsistente funktionelle output. Analyse af de evaluerede PHH-partier viste det laveste CV for albuminproduktion og urinstofsyntese ved hjælp af lavere såtætheder på 150.000 PHH'er / brønd og 200.000 PHH'er / brønd; Der blev imidlertid ikke fundet signifikante forskelle mellem albumin og urinstof ved nogen såtæthed. Højere såtætheder på 250.000 PHH'er / brønd og 300.000 PHH'er / brønd viser et større fald i albumin og urinstof i løbet af den 14-dages dyrkningsperiode. Iboende donorvariabilitet i blodpladedannelse kan påvirke konsistensen af albuminproduktion og urinstofsyntese ved 250.000 PHH'er/brønd og 300.000 PHH/brønd for de testede donorpartier. I lighed med store hepatocytsfæroider kan oversåning af PHH'er i TV2D + -systemet have negative virkninger på den langsigtede kultur og funktionalitet af PHH'er.
Alle trin i optøning, plettering og vedligeholdelse er afgørende for vellykket kultur og datagenerering; Der er dog flere almindelige fejl, som uerfarne brugere kan undgå. PHH'er er meget modtagelige for skader sekundært til temperaturudsving, forskydningsspænding og udsættelse for luft 9,10. Der bør træffes forholdsregler ved optøning af PHH'er for at undgå forlængede optøningstidsrammer og overdreven pipettering. Brug af en håndhældningsmetode, en timer og øjeblikkelig overførsel fra vandbad til is vil reducere disse almindelige fejl, der kan påvirke levedygtigheden og blodpladeevnen af PHH'erne. Derudover, med forsyningskædeproblemer, der bliver mere almindelige, kan det være vanskeligt at få kollagenbelagte plader. Manuel belægning af vævskulturbehandlede plader ved hjælp af kommercielle opløsninger af kollagen type I (5-10 μg/cm2) kan anvendes til at løse dette problem; For optimal ydeevne og konsistens anbefales det dog at bruge forbelagte kollagenplader. I overgangsprocessen fra feedercellekultur til introduktion af PHH'er er det afgørende at forhindre, at fødecellelaget tørrer. Tillad aldrig lufteksponering for fødercellerne. Enhver lufteksponeringstid kan føre til dårlig fødecellelagskvalitet, hvilket vil påvirke den langsigtede kultur af PHH'er negativt. Det er bedste praksis at lade en lille mængde restmedium forblive mellem medieændringer. Lejlighedsvis kan PHH'er indeholde overskydende affald fra isolering, hvilket kan gøre det vanskeligt at se morfologi. For at hjælpe med dette problem skal du ryste pladen før et medium skift og bruge vakuumaspiration. Endelig, når du udfører en mediumændring, skal du forsigtigt aspirere det brugte medium og passe på ikke at forstyrre de dyrkede celler. Pipetter frisk medium volumen ned ad siden af brønden for at undgå pipettering direkte på cellelaget. Brugeren bør også undgå lufteksponering ved hvert medieskift ved hjælp af det anbefalede 3-brøndsskift (punkt 3 og 4). Det skal også bemærkes, at en daglig medieændring er ideel, men ikke påkrævet.
Selvom fluorescerende mikroskoper er blevet almindelige i de fleste laboratorier, kan software, der er nødvendig for at udføre specifik billedanalyse, medføre yderligere udgifter. ImageJ kan downloades gratis, hvilket gør det til et let tilgængeligt billedanalyseværktøj. Trinene i protokollen giver et grundlag, som brugeren muligvis skal optimere, specifikt partikelanalyse af DAPI-farvning; Hvis der imidlertid ikke er mulighed for fluorescerende billeddannelse, angives PHH-vedhæftningsværdier på dag 14 på partispecifikke analysecertifikater. Dårlig tærskelværdi vil resultere i unøjagtig optælling af DAPI-partiklerne. Det anbefales også at kontrollere overfladearealet af individuelle DAPI-partikler, inden der indstilles en størrelsesudelukkelse. Dette kan opnås ved at bruge det ovale ikon [Figur 2 (1), cirkelikon under fanen Rediger ] og tegne en cirkel, der omfatter DAPI-partiklen. Fanen Analysér kan derefter bruges til at måle arealet af den valgte DAPI-partikel. Specifikke målinger kan vælges ved hjælp af Indstil målinger under fanen Analysér [trin 8.9 og figur 2 (4)].
Nuværende metoder til dyrkning af PHH'er involverer anvendelse af belægninger såsom kollagen-I til at øge cellebinding i traditionel 2-dimensionel monokultur11 eller overlejring med en ekstracellulær matrix, som den murinbaserede Matrigel, en teknik, der almindeligvis omtales som "sandwichkultur"12,13,14,15. Mens sandwichkulturteknikken forbedrer PHH-morfologi og polaritet over tid sammenlignet med traditionel monokultur, mangler begge tilgange stadig langsigtet fænotypisk stabilitet i kultur for de fleste pladebare masser af PHH'er. En anden metode, der bruges til at dyrke PHH'er, er at lave 3D-sfæroider; Som tidligere nævnt af Glicklis et al.4 kan der dog være tekniske udfordringer med reproducerbarhed af sfærisk størrelse på grund af donorvariabilitet. I et forsøg på at lave en mere fysiologisk relevant levermodel er der udviklet flercellede modeller. Som beskrevet af Ware et al.7 muliggjorde anvendelse af mikromønstre, murinfibroblaster og primære humane lever-sinusformede endotelceller omgivet af PHH'er længere in vitro-dyrkningstider. Imidlertid kan mikromønster være en kompleks og tidskrævende proces, og de ikke-menneskelige fødeceller kan bidrage til baggrund i metaboliske signaler, hvilket begrænser nytten af denne platform i visse applikationer. Anvendelsen af forskellige ikke-leverceller, herunder humane og rottedermale fibroblaster og bovin aortaendotelceller som fødeceller til samdyrkning af hepatocytter, har vist albuminsekretion og tæt forbindelsesdannelse svarende til cokulturer af fødeceller af leveroprindelse16. Imidlertid skal mekanismen for interaktioner mellem TV2D + ikke-leverføderceller og PHH'erne i kultur undersøges yderligere for bedre at forstå indflydelsen på stabiliteten og funktionaliteten af PHH'erne i dette system. Kultursystemet, der tidligere er beskrevet af Weaver et al.8, kan med succes dyrke PHH'er i leverkolonier i op til 42 dage og danne omfattende galdekanalnetværk. De PHH'er, der blev dyrket i dette system, opretholdt vigtig leverfunktionalitet, herunder cytokrom 1A2-, 2B6- og 3A4-aktivitet og uridin-5′-diphospho-glucuronosyltransferase (UGT)-baseret enzymaktivitet, fase I- og II-metabolitdannelse, albuminproduktion og urinstofsyntese i mindst 22 dage in vitro uden Matrigel. Dette dyrkningssystem producerer stabile, fysiologisk relevante output, der let kan tilpasses ethvert laboratorium til farmakologiske og toksikologiske anvendelser. Selvom vigtige PH-funktioner bevares i TV2D + -systemet, er der ikke foretaget nogen direkte sammenligninger med 3D-sfæroidmodellen; Fremtidigt arbejde med at sammenligne de samme PHH-donorer mellem dyrkningssystemerne vil imidlertid vise sig værdifuldt til at bestemme grænserne og fordelene ved begge metoder.
Potentielle anvendelser af TV2D + omfatter evaluering af metabolisk clearance og lægemiddelinteraktioner mellem stoffer med lav omsætning, lægemiddelinduceret leverskade og risikovurdering af agrokemikalier. Præcis forudsigelse af leverclearance af nye og fremspirende lægemidler afhænger af en stabil og langvarig PH-kultur med tilbageholdelse af vigtig hepatocellulær funktionalitet, hvilket er særligt udfordrende ved evaluering af forbindelser med lav omsætning. Derudover er risikovurdering og kemisk induceret levertoksicitet store sundhedsmæssige bekymringer, og de nuværende modeller giver ikke den langsigtede stabilitet og funktionalitet i kultur til nøjagtigt at evaluere potentiel kronisk kemisk toksicitet, der kan være sekundær til akut eksponering. Sunde og syge PHH'er dyrket i TV2D + viste karakteristiske forskelle i funktion og lipiddisposition, der blev bevaret over tid17. Disse undersøgelser understøtter TV2D+ som et lovende værktøj til en række farmakologiske og toksikologiske anvendelser.
Disclosures
JO, LW, EG, EL, SP og JW er ansatte i LifeNet Health, den non-profit organisation, der producerer TV2D+.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Mellissa Keller og Wendy Hetman for deres hjælp med manuskript og figurgennemgang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
| 15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
| Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
| Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
| AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
| Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
| Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
| Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
| Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
| Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
| Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
| DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
| Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
| Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
| Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
| Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
| Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
| Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
| IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
| ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
| Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
| Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
| Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
| Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
| Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
| Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
| Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
| Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
| Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
| Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
| Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |
References
- Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
- Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity. Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).
- Baudy, A. R., et al. Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry. Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Khetani, S. R., et al. Microengineered liver tissues for drug testing. Journal of Laboratory Automation. 20 (3), 216-250 (2015).
- Monckton, C. P., Brown, G. E., Khetani, S. R. Latest impact of engineered human liver platforms on drug development. APL Bioengineering. 5 (3), 031506 (2021).
- Ware, B. R., Durham, M. J., Monckton, C. P., Khetani, S. R. A cell culture platform to maintain long-term phenotype of primary human hepatocytes and endothelial cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 187-207 (2018).
- Weaver, J. R., et al. The morphology, functionality, and longevity of a novel all human hepatic cell-based tri-culture system. Toxicology In Vitro. 86, 105504 (2023).
- Li, W., et al. Matrix stiffness and shear stresses modulate hepatocyte functions in a fibrotic liver sinusoidal model. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), G272-G282 (2021).
- Thompson, S. M., et al. Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study. Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).
- Mooney, D., et al. Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix. Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).
- Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. L. Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration. The FASEB Journal. 10 (13), 1471-1484 (1996).
- Hamilton, G. A., et al. Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions. Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Sivaraman, A., et al. A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Goulet, F., Normand, C., Morin, O. Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes. Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).
- Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences. Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. 62nd Annual Meeting & ToxExpo, , Nashville, TN. 4283 (2023).
