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Biology

दवा विकास अनुप्रयोगों के लिए एक अखिल मानव यकृत संस्कृति प्रणाली

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65992
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 1
1Institute of Regenerative Medicine, LifeNet Health, 2Biologics Division, LifeNet Health, 3LifeSciences Division, LifeNet Health, 4Research and Development, LifeSciences, LifeNet Health

Summary

हाल की तकनीकी प्रगति ने दवा चयापचय और विषाक्तता अनुप्रयोगों के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म के स्केल किए गए उत्पादन को सक्षम किया। एक सर्व-मानव 2 डी + यकृत प्रणाली (टीवी 2 डी +) पारंपरिक दो-आयामी संस्कृति विधियों का उपयोग करके शारीरिक रूप से प्रासंगिक परिणाम प्रदान करती है। यह प्रोटोकॉल सिस्टम के सेटअप, रखरखाव और अनुप्रयोग में अंतिम उपयोगकर्ताओं का समर्थन करेगा।

Abstract

औषधीय और विष विज्ञान संबंधी अध्ययनों के लिए प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स (पीएचएच) के लिए दीर्घकालिक, मानव-प्रासंगिक संस्कृति मॉडल खोजना एक चुनौती बनी हुई है। वर्तमान इन विट्रो मॉडल प्लेटफॉर्म अक्सर असुविधाजनक और जटिल होते हैं, समय के साथ फेनोटाइपिक स्थिरता की कमी होती है, और प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता और लचीलेपन की कमी के कारण कई PHH लॉट का समर्थन नहीं करते हैं। यहां, हम एक सर्व-मानव 2D + यकृत प्रणाली (TV2D +) के विगलन, चढ़ाना और रखरखाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो दीर्घायु और फेनोटाइपिक स्थिरता को बनाए रखते हुए मानक द्वि-आयामी (2D) संस्कृति तकनीकों और उपकरणों का लाभ उठाता है। परिणाम PHH सीडिंग घनत्व के एक समारोह के रूप में TV2D+ में लगाव और प्रतिशत प्लेटबिलिटी दिखाते हैं, साथ ही संस्कृति में कम से कम 2 सप्ताह के लिए स्थिर कार्यक्षमता दिखाते हैं। एक सफल दीर्घकालिक संस्कृति को प्राप्त करने के लिए PHH सीडिंग घनत्व की एक श्रृंखला का आकलन किया जाता है। जब ठीक से स्थापित किया जाता है, तो टीवी 2 डी + में पीएचएच हेपेटोसाइट कॉलोनियों में व्यवस्थित होते हैं, एक यकृत-विशिष्ट मार्कर व्यक्त करते हैं, और व्यवहार्यता, वास्तुशिल्प अखंडता और एल्ब्यूमिन और यूरिया के शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्तर बनाए रखते हैं। विशेषताओं का यह अनूठा संयोजन टीवी 2 डी + सिस्टम को विभिन्न औषधीय और विष विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए एक उपयुक्त यकृत मॉडल बनाता है।

Introduction

चिकित्सीय सुरक्षा और प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करना प्रीक्लिनिकल दवा विकास का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। हालांकि, इन विट्रो यकृत मॉडल में पारंपरिक प्रीक्लिनिकल विवो यकृत सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट में सटीक रूप से नकल करने और समय के साथ हेपेटोसाइट कार्यक्षमता और आकृति विज्ञान को बनाए रखने की उनकी क्षमता में सीमित हैं। ऐसे मॉडलों की आवश्यकता है जो धीमे-टर्नओवर यौगिकों का आकलन करने या उप-तीव्र या पुरानी जोखिम से जुड़े परिणामों की जांच करने के लिए 1 सप्ताह से अधिक समय तक स्थिर चयापचय क्षमता प्रदान करते हैं। विवो में, पशु परीक्षण अक्सर मानव यकृतनिकासी तंत्र में ट्रांसलेशनल प्रजातियों के अंतर के कारण दवा प्रभावकारिता और जोखिम की भविष्यवाणी करने में विफल होते हैं। इन विट्रो 2-आयामी (2 डी) यकृत मॉडल में वर्तमान, जैसे पारंपरिक प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट (पीएचएच) मोनोकल्चर या सैंडविच संस्कृतियों, संस्कृति में फेनोटाइपिक स्थिरता और दीर्घायु की कमी होती है, जिससे समय के साथ प्रमुख हेपेटोसेलुलर फ़ंक्शन और वास्तुशिल्प अखंडता का नुकसान होता है2. एक वैकल्पिक विधि में 3-आयामी (3 डी) हेपेटोसाइट स्फेरॉइड का गठन शामिल है, जो 2 डी संस्कृति बनाम अधिक प्रासंगिक माइक्रोएन्वायरमेंट की पेशकश करता है। हालांकि, यह विधि कच्चे माल की उपलब्धता, पीएचएच दाता-लॉट चयन, प्रजनन क्षमता, और बढ़ती अंडाकार आकृति 3,4,5,6 के साथ व्यवहार्यता के नुकसान से सीमित है। बहुकोशिकीय प्लेटफार्मों को पेश किया गया है जिससे पीएचएच को निश्चित आकार, माइक्रोपैटर्न्ड प्लेटों पर फीडर कोशिकाओं के साथ वरीयता दी जाती है। हालांकि इन मॉडलों लंबे समय तक संस्कृति समय सक्षम कर सकते हैं, इन प्लेटफार्मों में इस्तेमाल गैर मानव फीडर कोशिकाओं प्रयोगात्मक परिणामों को बदलने और दवा निकासी और चयापचय प्रोफाइल 1,7 के लिए जन्मजात पृष्ठभूमि योगदान के कारण उनके आवेदन को सीमित कर सकते हैं. TruVivo ऑल-ह्यूमन 2D+ हेपेटिक सिस्टम (TV2D+) हाल ही में वीवर, एटअल 8 में वर्णित है, जिसे PHHs की पारंपरिक, सह-संस्कृति और 3D संस्कृति विधियों की कुछ सीमाओं को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया था। गैर यकृत फीडर कोशिकाएं चयापचय और पैराक्राइन उत्पादन में अंतर-अंतर को कम करती हैं और प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, मजबूत फैशन में आवश्यक समर्थन प्रदान करती हैं जो विस्तार, फेनोटाइप और प्रदर्शन में सीमाओं के कारण एकल दाता लॉट से संबंधित गैर-पैरेन्काइमल यकृत कोशिकाओं द्वारा प्रदान नहीं की जा सकती हैं। चुने गए फीडर कोशिकाओं को उपयोग से पहले लगातार विस्तारित किया जा सकता था और परिवर्तन या भेदभाव की आवश्यकता का अभाव था। Glicklis एट अल 4 और खेतानी एट अल 5 द्वारा वर्णित के रूप में, हेपेटोसाइट spheroids की तरह 3 डी संस्कृति मॉडल दाता परिवर्तनशीलता के कारण reproducibility के साथ चुनौतियों और अंडाकार आकार है, जो 200 माइक्रोन से अधिक spheroids में पोषक तत्व प्रसार को प्रभावित करता है, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता में कमी के लिए अग्रणी. 3D गोलाकार गठन की तरह, TV2D+ सिस्टम PHHs की स्व-असेंबली पर निर्भर करता है; हालांकि, गठित PHH कालोनियों को एक एकल समुच्चय में संकुचित करने के बजाय एकल-कोशिका गहराई पर कुएं के सतह क्षेत्र में फैलाया जाता है। संस्कृति की यह विधि दाता परिवर्तनशीलता को संबोधित करने के लिए उपयोगी हो सकती है, जिससे पीएचएच को चढ़ाया जा सकता है, सुसंस्कृत किया जा सकता है, और विभिन्न बीजारोपण घनत्व पर बुनियादी कार्यक्षमता बनाए रखी जा सकती है। TV2D+ सिस्टम 3D स्फेरॉइड में विस्तारित संस्कृति करने के लिए आवश्यक हेरफेर या विशेष उपकरणों के दौरान नुकसान के कारण उपयोगकर्ता हैंडलिंग की मजबूती को भी बढ़ा सकता है।

TV2D+ सिस्टम मानक 2D संस्कृति को दीर्घायु और फेनोटाइपिक स्थिरता के साथ जोड़ती है जो आमतौर पर 3D सिस्टम के साथ होती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल जैव सुरक्षा अलमारियाँ, सेंट्रीफ्यूज और सीओ2 इनक्यूबेटरों जैसे मानक उपकरणों से लैस प्रयोगशालाओं में बुनियादी टिशू कल्चर कौशल वाले उपयोगकर्ताओं के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है। प्रक्रिया में प्रत्येक चरण मीडिया तैयारी, विगलन, चढ़ाना, और जिसके परिणामस्वरूप संस्कृति प्रणाली के रखरखाव सहित विस्तार से उल्लिखित है. प्रोटोकॉल में बुनियादी हेपेटोसाइट कार्यक्षमता आउटपुट, एल्ब्यूमिन और यूरिया के साथ-साथ सामान्यीकरण के लिए पीएचएच लगाव का निर्धारण करने के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवि विश्लेषण निर्धारित करने के लिए एक विधि भी शामिल है। जब ठीक से स्थापित किया जाता है, तो टीवी 2 डी + में पीएचएच हेपेटोसाइट कॉलोनियों में व्यवस्थित होते हैं, देशी यकृत आकृति विज्ञान की नकल करते हैं, और कम से कम2 सप्ताह 8 के लिए विस्तारित व्यवहार्यता, वास्तुशिल्प अखंडता और एल्ब्यूमिन और यूरिया के शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्तर बनाए रखते हैं। क्योंकि सिस्टम PHH सीडिंग घनत्व की एक श्रृंखला की अनुमति दे सकता है, यह कम प्लेट योग्य PHH लॉट की उपलब्धता बढ़ाने में उपयोगी हो सकता है जिसमें वांछनीय दाता विशेषताएं हैं। पहुंच और कार्यक्षमता का यह संयोजन टीवी 2 डी + को विभिन्न औषधीय और विषैले अनुप्रयोगों के लिए एक उपयुक्त यकृत मॉडल बनाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल लाइफनेट हेल्थ की एथिक्स कमेटी के दिशानिर्देशों का पालन करता है। पांडुलिपि में मानव प्रतिभागियों या किसी भी लेखक द्वारा किए गए पशु अध्ययन के साथ कोई अध्ययन शामिल नहीं है। सभी कोशिकाओं को दाता ऊतक से अलग किया गया था, जो लाइफनेट हेल्थ द्वारा अनुसंधान उद्देश्यों के लिए पूरी तरह से सहमति दी गई थी।

1. मध्यम तैयारी

  1. एक बोतल प्रत्येक फीडर सेल विगलन माध्यम, पूरक ए, पूरक बी, और पूरक सी ( सामग्री की तालिकादेखें) को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या 4 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे में पिघलाएं।
  2. फीडर सेल विगलन माध्यम की पूरी बोतल (10 एमएल) को 15 एमएल या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में विभाज्य करें।
    नोट: सेल गोली का आकार 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करके देखना आसान होगा।
  3. एक पूर्ण चढ़ाना माध्यम बनाने के लिए पूरक बी के 4.5 एमएल और पूरक ए के 11 एमएल को चढ़ाना माध्यम (75 एमएल) ( सामग्री की तालिकादेखें) की एक बोतल में जोड़ें।
    नोट: पूर्ण चढ़ाना माध्यम में एफबीएस <5% वी /
  4. एक अलग बोतल में, संस्कृति माध्यम के 100 एमएल ( सामग्री की तालिकादेखें), 1 एमएल पूरक सी, और 14 एमएल पूरक एक पूर्ण संस्कृति माध्यम बनाने के लिए जोड़ें।
    नोट: पूर्ण संस्कृति माध्यम में एफबीएस <1% वी / वी की एकाग्रता है
  5. शेष पूरक सी स्टोर करें और सप्ताह 2 मध्यम तैयारी तक -20 डिग्री सेल्सियस पर पूरक ए को पूरक करें।
    नोट: बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्र पूरक के शेल्फ जीवन को कम कर देगा। यह केवल एक बार फ्रीज-पिघलना करने की सिफारिश की जाती है।
  6. उपयोग करने से पहले, फीडर सेल विगलन माध्यम के 10 एमएल, हेपेटोसाइट विगलन माध्यम, पूर्ण चढ़ाना माध्यम, और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 20-30 मिनट के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम गर्म करें।

2. विगलन, गिनती, और चढ़ाना मानव फीडर कोशिकाओं(चित्रा 1 ए)

  1. पीएचएच बोने से लगभग 1 घंटे पहले फीडर कोशिकाओं को संस्कृति करें। फीडर कोशिकाओं को पिघलाएं ( सामग्री की तालिकादेखें) 1-2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
    नोट: लंबे समय तक एक्सपोजर (जैसे, >2 मिनट) से बचें विगलन की निगरानी करके और शीशी को हटाकर जब तरल क्रायोवियल में ढीला हो जाता है जब उलटा।
  2. इसके तत्काल बाद विगलन के बाद, बर्फ पर फीडर कोशिकाओं जगह है.
  3. सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करना, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में, फीडर सेल विगलन माध्यम के 10 एमएल के लिए ताजा पिघलना कोशिकाओं को जोड़ें।
  4. सेल/पिघलना मध्यम निलंबन के 1 एमएल के साथ एक बार शीशी धोने के लिए एक 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करें और इकट्ठा करें।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर स्पिन।
  6. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें pipetting या वैक्यूम आकांक्षा द्वारा सेल गोली परेशान नहीं करने के लिए. पूर्ण चढ़ाना माध्यम के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और फीडर कोशिकाओं की गिनती करें।
    नोट: फीडर कोशिकाओं को एक हेमासाइटोमीटर का उपयोग करके एक स्वचालित सेल काउंटर या ट्रिपैन ब्लू पर एक्रिडिन नारंगी और प्रोपिडियम आयोडाइड (एओपीआई) का उपयोग करके गिना जा सकता है। सेल गणना प्रौद्योगिकी और उपयोगकर्ता के आधार पर भिन्न हो सकती है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, डुप्लिकेट नमूनों की गणना करें और चुनी हुई पद्धति में सुसंगत रहें।
  7. पूर्ण चढ़ाना माध्यम का उपयोग करके सेल निलंबन को 100,000 कोशिकाओं/एमएल तक पतला करें।
  8. प्लेट 500 माइक्रोन (50,000 कोशिकाओं) एक कोलेजन-लेपित 24-अच्छी तरह से प्लेट ( सामग्री की तालिकादेखें) पर पतला सेल निलंबन के प्रति अच्छी तरह से।
  9. प्लेट को उत्तर (N)-दक्षिण (S)-पूर्व (E)-पश्चिम (W) गति में N-S दिशा में 2 बार आगे-पीछे गति का उपयोग करके उसी गति E-W के बाद हिलाएं। 3 राउंड की कुल के लिए 2 बार इस मिलाते हुए प्रोटोकॉल दोहराएँ.
    नोट: प्लेट के ढक्कन पर छींटे से बचने के लिए मध्यम बल का उपयोग करके झटकों को प्रदर्शन करें, जबकि अभी भी सेल वितरण में सहायता कर रहे हैं (कृपया वीडियो देखें)।
  10. 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर सेते हैं.
  11. हेपेटोसाइट्स पिघलने के लिए आगे बढ़ने से पहले फीडर सेल अटैचमेंट देखें।
    नोट: स्वीकार्य फीडर सेल लगाव नेत्रहीन लगभग 50% संगम है।

3. विगलन, गिनती, और चढ़ाना प्राथमिक मानव hepatocytes(चित्रा 1 बी)

  1. फीडर सेल संस्कृति के 30 मिनट के बाद, 0.2 माइक्रोन पॉलीएथरसल्फोन (पीईएस) फिल्टर यूनिट के माध्यम से पूर्व-गर्म हेपेटोसाइट विगलन माध्यम फ़िल्टर करें।
  2. 1-2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पीएचएच पिघलाएं।
    नोट: लंबे समय तक एक्सपोजर (जैसे, >2 मिनट) से बचें विगलन की निगरानी करके और शीशी को हटाकर जब तरल क्रायोवियल में ढीला हो जाता है जब उलटा।
  3. पिघलने के तुरंत बाद, पीएचएच को बर्फ पर रखें।
  4. बीएससी में, पीएचएच निलंबन को हेपेटोसाइट विगलन माध्यम में डालें।
    नोट: जब संभव हो PHH सेल निलंबन पाइपिंग से बचें। क्रायोवियल से विगलन माध्यम तक पिघले हुए PHHs के हस्तांतरण के दौरान कोई पाइपिंग नहीं करना सबसे महत्वपूर्ण है।
  5. शीशी को 3-4 बार धोने के लिए 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करें, धीरे-धीरे हेपेटोसाइट/पिघलना मध्यम निलंबन के 1 एमएल को शीशी में वापस पाइप करके और इसे पिघलना माध्यम में वापस डालकर धोने को इकट्ठा करके।
  6. कैप और धीरे से पिघले हुए PHH निलंबन को 5 बार पलटें।
  7. आरटी पर 8 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर स्पिन करें।
  8. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें pipetting या वैक्यूम आकांक्षा द्वारा सेल गोली परेशान नहीं करने के लिए. शंक्वाकार ट्यूब की दीवार पर, पूर्ण चढ़ाना माध्यम के 3 एमएल जोड़ें।
  9. सेल गोली resuspended करने के लिए पक्ष करने के लिए शंक्वाकार ट्यूब पक्ष रॉक.
  10. पुन: निलंबित हेपेटोसाइट्स के लिए पूर्ण चढ़ाना माध्यम का एक अतिरिक्त 5 एमएल जोड़ें।
  11. PHHs की गणना करें।
    नोट: PHHs एक hemacytometer का उपयोग कर एक स्वचालित सेल काउंटर या trypan नीले रंग पर AOPI का उपयोग कर गिना जा सकता है. सेल गणना प्रौद्योगिकी और उपयोगकर्ता के आधार पर भिन्न हो सकती है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, डुप्लिकेट नमूनों की गणना करें और चुनी हुई पद्धति में सुसंगत रहें।
  12. पूर्ण चढ़ाना माध्यम का उपयोग करके सेल निलंबन को वांछित सीडिंग घनत्व (300,000-600,000 PHHs/mL) तक पतला करें।
    नोट: इष्टतम हेपेटोसाइट सीडिंग घनत्व बहुत से बहुत भिन्न हो सकता है। किसी दिए गए लॉट के लिए अनुशंसित सीडिंग घनत्व विश्लेषण प्रमाण पत्र (सीओए) में प्रदान किया जाएगा। एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए hepatocytes / एमएल निर्धारित करने के लिए नीचे समीकरण का प्रयोग करें.
    Equation 1
  13. मढ़वाया फीडर कोशिकाओं से, pipetting या वैक्यूम आकांक्षा द्वारा माध्यम को हटा दें.
    नोट: फीडर कोशिकाओं की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, एक समय में 3 से अधिक कुओं को बदलने की सिफारिश की जाती है।
  14. तुरंत प्लेट 500 माइक्रोन (150,000-300,000 कोशिकाओं) पूर्व लेपित कोलेजन 24 अच्छी तरह से फीडर कोशिकाओं युक्त प्लेट पर पतला hepatocyte निलंबन के कुएं के अनुसार.
  15. प्लेट को N-S-E-W गति में N-S दिशा में आगे-पीछे गति का उपयोग करके 2 बार और उसके बाद समान गति E-W को हिलाएं। 3 राउंड की कुल के लिए 2 बार इस मिलाते हुए प्रोटोकॉल दोहराएँ.
    नोट: प्लेट ढक्कन पर छींटे से बचने के लिए मध्यम बल का उपयोग कर मिलाते हुए प्रदर्शन करते हुए अभी भी सेल वितरण में सहायता.
  16. 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। संस्कृति के पहले 60 मिनट के लिए, ऊपर चरण 3.15 में के रूप में एन एस ई डब्ल्यू गति में हर 15 मिनट थाली हिला.
  17. इनक्यूबेशन बाद, इनक्यूबेटर से थाली को हटा दें और इसे बीएससी में रखें।
  18. प्लेट को हिलाएं और पाइपिंग या वैक्यूम आकांक्षा द्वारा पूर्ण चढ़ाना माध्यम को हटा दें।
    नोट: संस्कृति की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, एक समय में 3 से अधिक कुओं को बदलने की सिफारिश की जाती है।
  19. तुरंत प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व गर्म पूरा संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें.

4. रखरखाव

  1. विभाज्य और पूर्व गर्म पूर्ण संस्कृति माध्यम 20-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में। एक 24-अच्छी प्लेट के लिए लगभग 13.5 एमएल मध्यम की आवश्यकता होती है।
  2. फ़ीड संस्कृतियों 500 माइक्रोन के साथ दैनिक ताजा, पूर्व गर्म पूरा संस्कृति माध्यम के प्रति अच्छी तरह से.
    नोट: संस्कृति की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, एक समय में 3 से अधिक कुओं को बदलने की सिफारिश की जाती है।
  3. हर 7 दिनों में ताजा पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करें।

5. एल्बुमिन और यूरिया के माप के लिए संस्कृति सतह पर तैरनेवाला नमूनों का संग्रह

  1. 7, 10, और 14 दिनों में, वांछित नमूना अच्छी तरह से (ओं) से एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (ओं) में माध्यम के 500 माइक्रोन इकट्ठा करें, जैसा कि चित्रा 1 सी में दिखाया गया है।
  2. गोली मलबे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 320 x ग्राम पर नमूना (ओं) को स्पिन करें।
  3. गोली के विघटन से बचने के लिए, नए microcentrifuge ट्यूब (ओं) में नमूना सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें.
  4. एल्बुमिन और/या यूरिया परख पर नमूने चलाएं (क्रमशः खंड 10 और 11 देखें)।
    नोट: नमूने 2 सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस से -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. धुंधला दिन I

चेतावनी: फिक्सेशन बफर में पैराफॉर्मलडिहाइड होता है। पैराफॉर्मलडिहाइड आंखों की क्षति, त्वचा में जलन और अंग विषाक्तता का कारण बन सकता है। अच्छे वेंटिलेशन वाले क्षेत्र में काम करें और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।

  1. 14 दिन पर मध्यम नमूनों के संग्रह के बाद, दाग होने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से निर्धारण बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) के 300 माइक्रोन जोड़ें, जैसा कि चित्रा 1 सी में दिखाया गया है। कम से कम 2 कुओं को दाग दें।
  2. 20-60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. 1x पीबीएस के 45 एमएल में 10x स्टॉक समाधान के 5 एमएल जोड़कर 1x पारगम्यता बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: 1x पारगम्यता बफर को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. बर्फ पर 1x पारगम्यता बफर के 300 माइक्रोन के साथ 2 बार धोएं।
  5. बर्फ पर 1x पारगम्यता बफर में 1:1000 कमजोर पड़ने का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी साइटोकैटिन 18 ( सामग्री की तालिकादेखें) के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: कम से कम, केवल एक माध्यमिक एंटीबॉडी-केवल नियंत्रण के लिए 1x पारगम्यता बफर के साथ एक अच्छी तरह से इनक्यूबेट करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे सेते हैं।

7. धुंधला दिन II

  1. अगले दिन, पाइपिंग या वैक्यूम आकांक्षा द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें।
  2. बर्फ पर 1x पारगम्यता बफर के 300 माइक्रोन प्रति कुएं के साथ 2 बार धोएं।
  3. फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) के 300 माइक्रोन जोड़ें 1x पारगम्यता बफर में 1:500 कमजोर पड़ने का उपयोग (माध्यमिक केवल नियंत्रण शामिल करें)।
    नोट: फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करते समय प्रकाश से बचें।
  4. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30-45 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. पाइपिंग या वैक्यूम आकांक्षा द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें।
  6. बर्फ पर 1x पारगम्यता बफर के 300 माइक्रोन प्रति कुएं के साथ 2 बार धोएं।
  7. 1x पीबीएस के कुएं प्रति 300 माइक्रोन के साथ 1 बार धोएं।
  8. प्रत्येक कुएं में 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) बढ़ते माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) के 150 माइक्रोन जोड़ें और अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्लेट को पैराफिल्म में लपेटा जा सकता है और 1 सप्ताह के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  9. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत देखें। 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग करके प्रत्येक विशिष्ट फ्लोरोसेंट चैनल की 5 छवियों को कैप्चर करें (सुनिश्चित करें कि एक छवि में स्केल बार है)।
    नोट: DAPI में 358 nm/461 nm का उत्तेजना/उत्सर्जन होता है। डीएपीआई और माध्यमिक एंटीबॉडी फ्लोरोफोर दोनों के लिए उपयुक्त पहचान फिल्टर से लैस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

8. ImageJ विश्लेषण (चित्रा 2)

नोट: ImageJ संस्करण 1.52a या उच्चतर का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।

  1. ImageJ में स्केल बार वाली छवि खोलें। स्ट्रेट लाइन आइकन पर क्लिक करें और स्केल बार की सटीक लंबाई के लिए एक रेखा खींचें [चित्र 2 (1)]
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो क्लिक करें आवर्धन ग्लास ज़ूम इन या आउट करने के लिए आइकन।
  2. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें। हाइलाइट करें और स्केल सेट करें पर क्लिक करें।
  3. ज्ञात दूरी को स्केल पट्टी की दूरी में बदलें। लंबाई की इकाइयों को स्केल बार की इकाइयों में बदलें। वैश्विक रूप से ग्लोबल चेक करके सेटिंग्स लागू करें। स्केल सेट करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
    नोट: एक बार यह सेटिंग लागू हो जाने के बाद, खोली गई प्रत्येक छवि उपयोगकर्ता द्वारा इनपुट की गई इकाइयों में देखने के क्षेत्र का परिकलित क्षेत्र दिखाएगी।
  4. ImageJ में केवल-DAPI छवि खोलें। प्रक्रिया टैब पर क्लिक करें और पृष्ठभूमि घटाएं हाइलाइट करें। एक बार में पृष्ठभूमि 50 पिक्सेल निकालें जब तक कि दाग वाले क्षेत्र काले न हो जाएं।
    नोट: यदि छवि में पृष्ठभूमि नहीं है, तो इस चरण की आवश्यकता नहीं है।
  5. छवि टैब पर क्लिक करें और प्रकार हाइलाइट करें. छवि ग्रेस्केल [चित्रा 2 (2)] बनाने के लिए 8 बिट पर क्लिक करें.
  6. सभी DAPI कणों को शामिल करने के लिए मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से छवि को थ्रेशोल्ड करें (सावधानी बरतें कि मैन्युअल रूप से थ्रेशोल्ड से अधिक न करें) [चित्र 2 (3)]। छवि टैब पर क्लिक करें और समायोजित करें को हाइलाइट करें। थ्रेशोल्ड पर क्लिक करें. पूरा होने पर लागू करें पर क्लिक करें।
  7. प्रक्रिया टैब पर क्लिक करें और बाइनरी को हाइलाइट करें। वाटरशेड पर क्लिक करें।
  8. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें और प्रकाश डाला / कणों का विश्लेषण करें पर क्लिक करें [चित्रा 2 (4)]. आकार को 5-अनंत और परिपत्रता को 0.00-1.00 पर सेट करें। दिखाएँ ड्रॉप-डाउन टैब में, बाह्यरेखाएँ का चयन करें. सुनिश्चित करें कि प्रदर्शन परिणाम, सारांशित करें, और शामिल करें छेद चेक किए गए हैं। ओके पर क्लिक करें।
    नोट: वांछित कण रेंज को समायोजित किया जा सकता है यदि थ्रेसहोल्डिंग पृष्ठभूमि पिक्सेल पैदा करता है।
  9. गिनती परिणाम को कुल DAPI के रूप में रिकॉर्ड करें।
  10. ImageJ में मर्ज की गई साइटोकैटिन 18/DAPI छवि खोलें।
  11. मल्टी-पॉइंट [चित्र 2 (5)] आइकन का उपयोग साइटोकैटिन 18 के लिए मैन्युअल रूप से दाग रहित सभी DAPI कणों की गणना करने के लिए करें।
  12. फीडर कोशिकाओं के रूप में रिकॉर्ड परिणाम। हेपेटोसाइट डीएपीआई निर्धारित करने के लिए नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें।
    हेपेटोसाइट DAPI = कुल DAPI - फीडर सेल DAPI

9. कुल संलग्न हेपेटोसाइट्स और प्रतिशत लगाव (प्लेटबिलिटी) की मात्रा का परिमाण

  1. नीचे समीकरण का उपयोग कर 24 अच्छी तरह से संस्कृति क्षेत्र के लिए एक पैमाने कारक बनाएँ. दृश्य माप के क्षेत्र [चित्रा 2 (2), हरे रंग का बॉक्स] खोला प्रत्येक छवि के शीर्ष पर पाया जा सकता है.
    Equation 3
  2. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके कुल संलग्न हेपेटोसाइट्स की गणना करें।
    संलग्न हेपेटोसाइट्स = स्केल फैक्टर × हेपेटोसाइट डीएपीआई
  3. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स के प्रतिशत लगाव की गणना करें।
    Equation 5

10. एल्बुमिन परख

  1. 1:200 पर पतला नमूनों पर सैंडविच एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एल्बुमिन उत्पादन को मापें।
    नोट: सटीकता के लिए, उपयोगकर्ता पुष्टि करता है कि नमूने मानक वक्र रैखिक सीमा के भीतर आते हैं। निर्दिष्ट किट परख करने के लिए सभी सामग्री और निर्देश प्रदान करती है।
  2. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके संलग्न हेपेटोसाइट्स के लिए नमूना सांद्रता को सामान्य करें।
    Equation 6

11. यूरिया परख

चेतावनी: रक्त यूरिया नाइट्रोजन (BUN) एसिड अभिकर्मक सल्फ्यूरिक एसिड होता है. BUN एसिड अभिकर्मक में सल्फ्यूरिक एसिड एकाग्रता को संक्षारक माना जाता है। निगलना मत करो। अच्छे वेंटिलेशन वाले क्षेत्र में काम करें और उपयुक्त पीपीई पहनें।

  1. यूरिया संश्लेषण को एक संशोधित डायसिटाइल मोनोक्सिम विधि ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके मापा जाता है।
  2. मानक #1 (100 μg/mL) बनाने के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम के 346.7 μL में 75 mg/dL यूरिया के 53.3 μL को पतला करें
  3. लेबल ट्यूब 2-8 और यूरिया परख मानकों(तालिका 1)बनाने के लिए एक 1:2 धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करें.
  4. एक काली दीवार वाले, स्पष्ट नीचे 96-अच्छी प्लेट के कुओं में नमूना या मानक के 10 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त नमूने के लिए BUN अभिकर्मक के 150 माइक्रोन जोड़ें। 2/3 BUN एसिड अभिकर्मक के साथ BUN रंग अभिकर्मक के 1/3 मिश्रण द्वारा BUN अभिकर्मक तैयार करें। गणना में सहायता के लिए नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें।
    Equation 7
    BUN रंग अभिकर्मक (mL) = कुल BUN अभिकर्मक आवश्यक × 0.333
    BUN एसिड अभिकर्मक (mL) = कुल BUN अभिकर्मक की आवश्यकता × 0.667
  6. 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन या इनक्यूबेटर में 90 मिनट के लिए थाली सेते हैं.
  7. प्लेट अवशोषण को तुरंत 540 एनएम और 650 एनएम पर पढ़ें।
  8. सभी नमूनों और मानकों से रिक्त और पृष्ठभूमि अवशोषण (650 एनएम) घटाकर एक मानक वक्र बनाएं। रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा एक सर्वश्रेष्ठ-फिट रेखा उत्पन्न करें।
  9. मानक वक्र से अज्ञात नमूना एकाग्रता का निर्धारण.
  10. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके संलग्न हेपेटोसाइट्स के लिए नमूना सांद्रता को सामान्य करें।
    Equation 10

Representative Results

चढ़ाना, संवर्धन और यकृत संस्कृति प्रणाली की बुनियादी कार्यक्षमता परीक्षण की समग्र विधि में सामान्य प्राथमिक सेल संस्कृति तकनीक और विश्लेषण शामिल है, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। हेपेटोसाइट लगाव और प्रतिशत प्लेटबिलिटी की गणना साइटोकैटिन 18 की कम से कम पांच छवियों के इमेजजे विश्लेषण और अच्छी तरह से प्रति डीएपीआई धुंधला (चित्रा 2) का उपयोग करके 14 दिन की गणना की गई थी। फीडर कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत पीएचएच के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 3 में दिखाया गया है. विभिन्न यकृत बोने घनत्व ने सीडिंग घनत्व के आधार पर संगम के दृश्य अंतर दिखाए और 14 दिनों की संस्कृति के लिए विशिष्ट यकृत, घनाकार आकृति विज्ञान को बनाए रखा। हेपेटोसाइट दाता लॉट ए और बी की छवियां प्रत्येक परीक्षण बोने घनत्व(चित्रा 4ए)के लिए कब्जा कर लिया गया. दाता बी (89.04% ± 3.99%, 198,552 ± 49,885 पीएचएच) के लिए औसत प्रतिशत प्लेटबिलिटी दाता ए (66.08% ± 6.67%, 146,128 ± 33,063 पीएचएच) की तुलना में अधिक थी। डोनर ए में 150,000-760,000 पीएचएच/वेल (76.07% ± 12.87%) का उपयोग करके 250,000-300,000 पीएचएच/वेल (62.75% ± 9.64%) की तुलना में काफी अधिक प्रतिशत प्लेटबिलिटी थी। दाता बी ने हेपेटोसाइट प्रतिशत प्लेटबिलिटी में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। दाता बी में उच्चतम सीडिंग घनत्व, 300,000 पीएचएच / कुएं पर सबसे कम हेपेटोसाइट प्लेटबिलिटी (85.78% ± 13.25%) थी। दाता ए के समान, 150,000 पीएचएच / कुएं पर सीडिंग डोनर बी में हेपेटोसाइट्स (94.75% ± 15.07%) की उच्चतम प्रतिशत प्लेटबिलिटी थी।

एल्बुमिन उत्पादन और यूरिया संश्लेषण को 14-दिवसीय संस्कृति अवधि के दौरान तीन समय बिंदुओं पर मापा गया और संलग्न हेपेटोसाइट्स की गणना के लिए सामान्यीकृत किया गया। कुल मिलाकर, दाता ए ने दाता बी (41.32 ± 4.58 माइक्रोग्राम अल्ब / दिन / 106 पीएचएच बनाम 34.66 ± 10.03 माइक्रोग्राम एएलबी / दिन / 106 पीएचएच) (चित्रा 5) की तुलना में एल्ब्यूमिन उत्पादन में वृद्धि की थी। डोनर्स ए और बी में क्रमशः 150,000 पीएचएच/कुएं, 45.91 ± 5.96 माइक्रोग्राम अल्ब/दिन/106 पीएचएच और 48.67 ± 20.44 μg alb/day/106 PHHs पर उच्चतम एल्बुमिन उत्पादन सीडिंग हेपेटोसाइट्स था। एल्बुमिन उत्पादन में कोई महत्वपूर्ण अंतर उपयोग किए गए सीडिंग घनत्व में नहीं देखा गया था। जैसा कि बॉडी एट अल 3 द्वारा कहा गया है, यह वांछनीय है कि यकृत माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम 14 दिनों की संस्कृति में 50% से कम परिवर्तन के साथ लगातार एल्ब्यूमिन उत्पादन और यूरिया संश्लेषण बनाए रखें। भिन्नता के गुणांक (सीवी) की गणना 7, 10 और 14 दिनों के लिए मानक विचलन से माध्य को विभाजित करके की गई थी। सभी नमूने डुप्लिकेट में चलाए गए थे। 14-दिवसीय संस्कृति अवधि में 150,000 PHHs/कुएं पर एल्बुमिन आउटपुट के लिए CV दाता A के लिए 12.24% और दाता B के लिए 37.97% था, जो वांछित 50% मानदंड से कम था। एल्ब्यूमिन उत्पादन में एक उच्च भिन्नता दाता ए और दाता बी दोनों में देखी गई थी जब 250,000 और 300,000 पीएचएच / इन सीडिंग घनत्व पर, दोनों दाताओं को संस्कृति के 7, 10 और 14 दिनों (सीवी दाता ए, 22.49%, और दाता बी, 45.07%) के बीच एल्ब्यूमिन उत्पादन में भारी कमी का अनुभव होता है।

दाता बी यूरिया संश्लेषण (95.09 ± 18.91 μg यूरिया / दिन / 106) दाता ए (64.92 ± 4.66 μg यूरिया / दिन / 106 PHHs) की तुलना में वृद्धि हुई थी जब दिन 7, 10, और 14 PHH लॉट विशिष्ट डेटा(चित्रा 6)का औसत होता है। दाता बी (113.49 ± 37.34 μg यूरिया / दिन / 106 PHHs) और दाता ए (69.12 ± 17.06 μg यूरिया / दिन / 106 PHHs) में क्रमशः 150,000 PHHs / अच्छी तरह से घनत्व पर 14-दिवसीय संस्कृति अवधि में सबसे बड़ा यूरिया संश्लेषण था। दोनों दाता लॉट में सबसे कम यूरिया उत्पादन और उच्चतम सीवी 300,000 पीएचएच / कुएं पर था। यूरिया संश्लेषण में कोई महत्वपूर्ण अंतर इस्तेमाल किया बोने घनत्व में देखा गया. दाता ए के लिए यूरिया संश्लेषण के लिए सबसे कम सीवी तब देखा गया जब दाता बी (28.26%) के लिए 250,000 पीपीएच/कुएं (23.11%) और 200,000 पीएचएच/कुएं पर सुसंस्कृत किया गया। जैसा कि इन परिणामों द्वारा हाइलाइट किया गया है, पीएचएच के दिए गए बहुत से के लिए इष्टतम बीजारोपण घनत्व परख के समय वांछित संगम के स्तर और मापा जा रहे परिणामों की प्रकृति पर निर्भर करता है; उच्च बीजारोपण घनत्व हमेशा उच्च संकेत या गतिशील रेंज के साथ सहसंबंधित नहीं हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: फीडर कोशिकाओं के साथ हेपेटोसाइट्स के चढ़ाना, संवर्धन और कार्यात्मक परीक्षण का प्रवाह चार्ट। (ए) फीडर कोशिकाओं को एक विशिष्ट विगलन माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) में पिघलाया जाता है, एक पूर्ण चढ़ाना माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) में फिर से निलंबित कर दिया जाता है, और कोशिकाओं को गिना जाता है। कोशिकाओं को पतला, चढ़ाया जाता है, और 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। (बी) हेपेटोसाइट्स को एक विशिष्ट विगलन माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) में पिघलाया जाता है, एक पूर्ण चढ़ाना माध्यम में फिर से निलंबित किया जाता है, और कोशिकाओं को गिना जाता है। हेपेटोसाइट्स पतला होते हैं और फीडर कोशिकाओं के साथ चढ़ाया जाता है। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर 2-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, संस्कृति के पहले 60 मिनट के लिए हर 15 मिनट में एनएसईडब्ल्यू गति में मिलाते हुए। चढ़ाना माध्यम संस्कृति के रखरखाव के लिए एक पूर्व गर्म पूर्ण संस्कृति माध्यम के साथ बदल दिया है ( सामग्री की तालिकादेखें). संस्कृतियों को प्रतिदिन खिलाया जाता है। (सी) 7, 10 और 14 दिनों में, एल्ब्यूमिन और यूरिया परीक्षण के लिए मध्यम नमूने एकत्र किए जाते हैं। 14 दिन पर नमूनों के संग्रह के बाद, कोशिकाओं को तय किया जाता है और साइटोकैटिन 18 ( सामग्री की तालिकादेखें) एंटीबॉडी 16-24 घंटे 4 डिग्री सेल्सियस पर दाग दिया जाता है। इसके अलावा, उन्हें एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट किया जाता है, धोया जाता है, और कैप्चर और छवि विश्लेषण के लिए डीएपीआई ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ घुड़सवार किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण। कैप्चर की गई छवियों का ImageJ प्रसंस्करण। चरण 1: माइक्रोस्कोप-विशिष्ट स्केल बार के आधार पर सभी छवियों पर एक पैमाना लागू होता है। चरण 2: छवि प्रकार बदल गया है। चरण 3: DAPI कणों का चयन करने के लिए एक थ्रेशोल्ड सीमा लागू की जाती है। चरण 4: एक कण विश्लेषण किया जाता है, और गिनती दर्ज की जाती है। चरण 5: संलग्न फीडर कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, एक मर्ज की गई छवि को बहु-बिंदु उपकरण का उपयोग करके गिना जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फीडर कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत विभिन्न यकृत बोने घनत्व की आकृति विज्ञान। पीएचएच के 7 और 14 दिनों पर प्रतिनिधि छवियां 150,000, 200,000, 250,000, और 300,000 पीएचएच / कुओं के यकृत बोने घनत्व पर फीडर कोशिकाओं (50,000 कोशिकाओं / कुआं) के साथ सुसंस्कृत हैं। छवियों को एक उल्टे चरण विपरीत माइक्रोस्कोप पर एक 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर लिया गया. स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: फीडर कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत विभिन्न यकृत बोने घनत्व के फ्लोरोसेंट इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री। (ए) 150,000, 200,000, 250,000, और 300,000 पीएचएच / कुओं के यकृत बोने घनत्व पर दिन 14 पर साइटोकैटिन 18 (लाल) धुंधला की प्रतिनिधि छवियां। प्रत्येक बोने घनत्व के लिए दो कुओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए तय किए गए थे. कुओं को 1:1000 पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे इनक्यूबेट किया गया था। एक माध्यमिक एंटीबॉडी अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1:500 पर इस्तेमाल किया गया था. DAPI (नीला) परमाणु दाग कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कुओं में जोड़ा गया था. छवियों को एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर एक 10X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर लिया गया. स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी) संलग्न हेपेटोसाइट्स और विभिन्न यकृत बोने घनत्व के प्रतिशत प्लेटबिलिटी की गणना की गई इमेजजे का उपयोग करके गणना की गई। *p ≤ 0.05, 200,000, 250,000, और 300,000 PHHs/कुएं के लिए प्रतिशत प्लेटबिलिटी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं (n ≥ प्रति स्थिति 5 छवियाँ)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फीडर कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत हेपेटोसाइट्स का एल्ब्यूमिन उत्पादन। 150,000, 200,000, 250,000, और 300,000 PHHs/कुएं पर यकृत बोने घनत्व से एल्बुमिन उत्पादन। कॉलम कुल संलग्न हेपेटोसाइट्स के लिए सामान्यीकृत एल्ब्यूमिन / दिन के माइक्रोग्राम के 14-दिवसीय औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक रेखा 7, 10 और 14 दिनों के बीच सीवी का प्रतिनिधित्व करती है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं (एन ≥ प्रतिकृति के साथ प्रति शर्त 2 कुएं)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: फीडर कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत हेपेटोसाइट्स का यूरिया संश्लेषण। 150,000, 200,000, 250,000, और 300,000 PHHs/कुएं पर यकृत बोने घनत्व से यूरिया संश्लेषण। कॉलम कुल संलग्न हेपेटोसाइट्स के लिए सामान्यीकृत μg यूरिया / दिन के 14-दिन के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक रेखा 7, 10 और 14 दिनों के बीच% सीवी का प्रतिनिधित्व करती है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं (एन ≥ प्रतिकृति के साथ प्रति शर्त 2 कुएं)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मानक (एस) # एकाग्रता (μg/mL) यूरिया समाधान (μL) पूर्ण संस्कृति (μL)
1 100 53.3
75 mg/dL स्टॉक		 346.7
2 50 100
(S1 समाधान)		 100
3 25 100
(S2 समाधान)		 100
4 12.5 100
(S3 समाधान)		 100
5 6.26 100
(S4 समाधान)		 100
6 3.125 100
(S5 समाधान)		 100
7 1.5625 100
(S6 समाधान)		 100
ख़ाली जगह 0 0 100

तालिका 1: यूरिया मानक नमूना तैयार करना। 75 mg/dL स्टॉक यूरिया का उपयोग करके, 100 μg/mL यूरिया समाधान तैयार करें। मानक वक्र के लिए अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सुझाए गए संस्करणों को विभाज्य करें।

Discussion

वर्णित यकृत संस्कृति प्रणाली प्रयोगशालाओं में स्थापित की जा सकती है जो मानक टिशू कल्चर इंस्ट्रूमेंटेशन से लैस हैं। फीडर कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत पीएचएच से मिलकर, सिस्टम उपयोगकर्ता को स्थिर एल्ब्यूमिन उत्पादन और यूरिया संश्लेषण के साथ कम से कम दो सप्ताह के लिए पीएचएच संस्कृति की अनुमति देता है। PHH डोनर लॉट परिवर्तनशीलता के कारण, सिस्टम में उपयोग के लिए केवल पूर्व-जांच और योग्य PHH की सिफारिश की जाती है। यद्यपि संलग्न पीएचएच की संख्या दाता लॉट और सीडिंग घनत्व के आधार पर भिन्न होती है, लेकिन प्रत्येक दाता लॉट के भीतर सापेक्ष प्लेटबिलिटी समान रहती है। जबकि अनुशंसित बीजारोपण घनत्व की सलाह दी जाती है, उपरोक्त आंकड़े बताते हैं कि हेपेटोसाइट सीडिंग घनत्व को विभिन्न प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जा सकता है; हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अधिक संख्या में पीएचएच बोने से उच्च या अधिक सुसंगत कार्यात्मक आउटपुट प्रदान नहीं हो सकते हैं। मूल्यांकन किए गए PHH लॉट के विश्लेषण ने एल्ब्यूमिन उत्पादन और यूरिया संश्लेषण के लिए सबसे कम सीवी दिखाया, जिसमें 150,000 PHHs/अच्छी तरह से और 200,000 PHHs/कुएं के कम सीडिंग घनत्व का उपयोग किया गया; हालांकि, किसी भी बीजारोपण घनत्व पर एल्ब्यूमिन और यूरिया के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। 250,000 पीएचएच / कुएं और 300,000 पीएचएच / अच्छी तरह से उच्च बीजारोपण घनत्व 14-दिवसीय संस्कृति अवधि में एल्ब्यूमिन और यूरिया में अधिक कमी दिखाते हैं। प्लेटबिलिटी में निहित दाता परिवर्तनशीलता एल्ब्यूमिन उत्पादन और यूरिया संश्लेषण की स्थिरता को 250,000 PHHs/अच्छी तरह से और परीक्षण किए गए दाता लॉट के लिए 300,000 PHHs/अच्छी तरह से प्रभावित कर सकती है। बड़े हेपेटोसाइट स्फेरॉइड के समान, TV2D+ सिस्टम में PHHs को ओवरसीडिंग करने से PHHs की दीर्घकालिक संस्कृति और कार्यक्षमता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है।

विगलन, चढ़ाना और रखरखाव में सभी कदम सफल संस्कृति और डेटा उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं; हालांकि, कई सामान्य गलतियाँ हैं जिनसे अनुभवहीन उपयोगकर्ता बच सकते हैं। PHHs तापमान में उतार-चढ़ाव, कतरनी तनाव, और हवा 9,10 के संपर्क में माध्यमिक क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। लंबे समय तक विगलन समय सीमा और अत्यधिक पाइपिंग से बचने के लिए पीएचएच को पिघलाते समय सावधानी बरतनी चाहिए। हाथ डालने की विधि, टाइमर और पानी के स्नान से बर्फ में तत्काल स्थानांतरण का उपयोग इन सामान्य त्रुटियों को कम करेगा जो पीएचएच की व्यवहार्यता और प्लेटबिलिटी को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, आपूर्ति श्रृंखला के मुद्दे अधिक आम होने के साथ, कोलेजन-लेपित प्लेटों को प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। कोलेजन प्रकार I (5-10 μg/cm2) के व्यावसायिक समाधानों का उपयोग करके टिशू कल्चर-उपचारित प्लेटों की मैनुअल कोटिंग का उपयोग इस मुद्दे को दूर करने के लिए किया जा सकता है; हालांकि, इष्टतम प्रदर्शन और स्थिरता के लिए, पूर्व-लेपित कोलेजन प्लेटों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। पीएचएच की शुरूआत के लिए फीडर सेल-केवल संस्कृति से संक्रमण की प्रक्रिया में, फीडर सेल परत को सूखने से रोकना महत्वपूर्ण है। फीडर कोशिकाओं को कभी भी हवा के संपर्क में न आने दें। किसी भी वायु जोखिम समय से खराब फीडर सेल परत की गुणवत्ता हो सकती है, जो पीएचएच की दीर्घकालिक संस्कृति को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगी। मध्यम परिवर्तनों के बीच अवशिष्ट माध्यम की एक छोटी मात्रा को रहने की अनुमति देना सबसे अच्छा अभ्यास है। अवसर पर, पीएचएच में अलगाव से अतिरिक्त मलबे हो सकते हैं, जो आकृति विज्ञान को देखना मुश्किल बना सकते हैं। इस मुद्दे के साथ मदद करने के लिए, एक मध्यम परिवर्तन से पहले थाली हिला और वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग करें. अंत में, जब एक मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन, ध्यान से खर्च किए गए माध्यम महाप्राण, ध्यान रखना सुसंस्कृत कोशिकाओं को परेशान नहीं करने के लिए. सेल परत पर सीधे pipetting से बचने के लिए अच्छी तरह से के किनारे नीचे पिपेट ताजा मध्यम मात्रा. उपयोगकर्ता को अनुशंसित 3-अच्छी तरह से परिवर्तन (धारा 3 और 4) का उपयोग करके हर माध्यम परिवर्तन पर वायु जोखिम से भी बचना चाहिए। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक दैनिक माध्यम परिवर्तन आदर्श है लेकिन आवश्यक नहीं है।

हालांकि अधिकांश प्रयोगशालाओं में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप आम हो गए हैं, विशिष्ट छवि विश्लेषण करने के लिए आवश्यक सॉफ़्टवेयर अतिरिक्त खर्च उठा सकते हैं। ImageJ को मुफ्त में डाउनलोड किया जा सकता है, जिससे यह आसानी से सुलभ छवि विश्लेषण उपकरण बन जाता है। प्रोटोकॉल में कदम एक आधार प्रदान करते हैं जिसके लिए उपयोगकर्ता को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, विशेष रूप से डीएपीआई धुंधला का कण विश्लेषण; हालांकि, फ्लोरोसेंट इमेजिंग क्षमता की अनुपस्थिति में, दिन 14 पर पीएचएच लगाव मान विश्लेषण के बहुत विशिष्ट प्रमाण पत्र पर प्रदान किए जाते हैं। खराब थ्रेसहोल्डिंग के परिणामस्वरूप डीएपीआई कणों की गलत गिनती होगी। आकार बहिष्करण सेट करने से पहले व्यक्तिगत डीएपीआई कणों के सतह क्षेत्र की जांच करने की भी सिफारिश की जाती है। यह ओवल आइकन [चित्रा 2 (1), संपादन टैब के नीचे सर्कल आइकन] का उपयोग करके और एक सर्कल खींचकर प्राप्त किया जा सकता है जो डीएपीआई कण को शामिल करता है। विश्लेषण टैब का उपयोग चयनित DAPI कण के क्षेत्र को मापने के लिए किया जा सकता है। विशिष्ट माप विश्लेषण टैब [चरण 8.9 और चित्रा 2 (4)] के तहत सेट माप का उपयोग कर चुना जा सकता है.

पीएचएच की खेती के लिए वर्तमान तरीकों में पारंपरिक 2-आयामी मोनोकल्चर11 में सेल लगाव बढ़ाने के लिए कोलेजन-आई जैसे कोटिंग्स का उपयोग शामिल है या म्यूरिन-आधारित मैट्रिगेल की तरह एक बाह्य मैट्रिक्स के साथ ओवरलेइंग करना शामिल है, एक तकनीक जिसे आमतौर पर "सैंडविच संस्कृति" 12,13,14,15 कहा जाता है. जबकि सैंडविच संस्कृति तकनीक पारंपरिक मोनोकल्चर की तुलना में समय के साथ PHH आकृति विज्ञान और ध्रुवीयता में सुधार करती है, दोनों दृष्टिकोणों में अभी भी PHH के अधिकांश प्लेटेबल लॉट के लिए संस्कृति में दीर्घकालिक फेनोटाइपिक स्थिरता की कमी है। PHHs संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया एक और विधि 3 डी spheroids बना रहा है; हालांकि, जैसा कि पहले ग्लिकलिस एट अल.4 द्वारा कहा गया था, दाता परिवर्तनशीलता के कारण अंडाकार आकृति के प्रजनन क्षमता के साथ तकनीकी चुनौतियां हो सकती हैं। अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक यकृत मॉडल बनाने के प्रयास में, बहुकोशिकीय मॉडल विकसित किए गए हैं। जैसा कि वेयर एट अल 7 द्वारा वर्णित है, माइक्रोपैटर्निंग, म्यूरिन फाइब्रोब्लास्ट और पीएचएच से घिरे प्राथमिक मानव यकृत साइनसॉइड एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करना इन विट्रो संस्कृति के समय में लंबे समय तक सक्षम है। हालांकि, micropatterning एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया हो सकती है, और गैर मानव फीडर कोशिकाओं चयापचय संकेतों में पृष्ठभूमि के लिए योगदान कर सकते हैं, कुछ अनुप्रयोगों में इस मंच की उपयोगिता को सीमित. हेपेटोसाइट्स के सह-संस्कृति के लिए फीडर कोशिकाओं के रूप में मानव और चूहे त्वचीय fibroblasts और गोजातीय महाधमनी endothelial कोशिकाओं सहित विभिन्न गैर जिगर कोशिकाओं के उपयोग एल्ब्यूमिन स्राव और तंग जंक्शन गठन जिगर मूल16 के फीडर कोशिकाओं के सह-संस्कृतियों के समान दिखाया गया है. हालांकि, इस प्रणाली में पीएचएच की स्थिरता और कार्यक्षमता पर प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए टीवी 2 डी + गैर-यकृत फीडर कोशिकाओं और संस्कृति में पीएचएच के बीच बातचीत के तंत्र की और जांच करने की आवश्यकता है। पहले वीवर एट अल.8 द्वारा वर्णित संस्कृति प्रणाली 42 दिनों तक यकृत कालोनियों में पीएचएच को सफलतापूर्वक कल्चर कर सकती है, जिससे व्यापक पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क बन सकते हैं। इस प्रणाली में सुसंस्कृत PHHs प्रमुख यकृत कार्यक्षमता बनाए रखा, साइटोक्रोम 1A2, 2B6, और 3A4 गतिविधि और Uridine 5 '-diphospho-glucuronosyltransferase (UGT) -आधारित एंजाइम गतिविधि, चरण I और द्वितीय metabolite गठन, albumin उत्पादन, और यूरिया संश्लेषण के लिए कम से कम 22 इन विट्रो में दिनों के लिए कोई Matrigel के साथ. यह संस्कृति प्रणाली स्थिर, शारीरिक रूप से प्रासंगिक आउटपुट का उत्पादन करती है जो औषधीय और विषैले अनुप्रयोगों के लिए किसी भी प्रयोगशाला के लिए आसानी से अनुकूल हैं। हालांकि टीवी 2 डी + सिस्टम में प्रमुख पीएचएच कार्यों को बनाए रखा जाता है, लेकिन 3 डी स्फेरॉइड मॉडल की कोई प्रत्यक्ष तुलना नहीं की गई है; हालांकि, संस्कृति प्रणालियों के बीच एक ही पीएचएच दाताओं की तुलना में भविष्य का काम दोनों तरीकों की सीमाओं और लाभों को निर्धारित करने में मूल्यवान साबित होगा।

टीवी 2 डी + के संभावित अनुप्रयोगों में चयापचय निकासी और कम टर्नओवर यौगिकों की दवा-दवा बातचीत, दवा-प्रेरित यकृत की चोट, और एग्रोकेमिकल्स के जोखिम मूल्यांकन का मूल्यांकन शामिल है। नई और उभरती दवाओं की यकृत निकासी की सटीक भविष्यवाणी करना प्रमुख हेपेटोसेलुलर कार्यक्षमता के प्रतिधारण के साथ एक स्थिर और लंबे समय तक पीएचएच संस्कृति पर निर्भर करता है, जो कम टर्नओवर यौगिकों का मूल्यांकन करते समय विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होता है। इसके अतिरिक्त, जोखिम मूल्यांकन और रासायनिक-प्रेरित यकृत विषाक्तता प्रमुख स्वास्थ्य चिंताएं हैं, और वर्तमान मॉडल संभावित पुरानी रासायनिक विषाक्तता का सही मूल्यांकन करने के लिए संस्कृति में दीर्घकालिक स्थिरता और कार्यक्षमता प्रदान नहीं करते हैं जो तीव्र जोखिम के लिए माध्यमिक हो सकते हैं। टीवी 2 डी + में सुसंस्कृत स्वस्थ और रोगग्रस्त पीएचएच ने फ़ंक्शन और लिपिड स्वभाव में विशिष्ट अंतर दिखाया जो समय17 के साथ बनाए रखा गया था। ये अध्ययन विभिन्न प्रकार के औषधीय और विषैले अनुप्रयोगों के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में टीवी 2 डी + का समर्थन करते हैं।

Disclosures

JO, LW, EG, EL, SP, और JW LifeNet Health के कर्मचारी हैं, जो गैर-लाभकारी संगठन है जो TV2D+ का उत्पादन करता है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि और आंकड़ा समीक्षा के साथ उनकी सहायता के लिए मेलिसा केलर और वेंडी हेटमैन को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm PES  filter unit  Thermo Fisher Scientific  565-0020 User preference 
15 mL or 50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific  352196 or 352070 User preference 
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific  A-21428 Other secondary antibodies can work
Anti-Cytokeratin 18 antibody  abcam ab24561 Necessary using same dilution
AOPI  Nexcelom  CS2-0106-5mL Used for Cellometer counting 
Biosafety cabinet  Labconoco 3460801 User preference 
Black-walled, clear bottom, 96-well plate  Thermo Fisher Scientific  165305 User preference 
Centrifuge Thermo Fisher Scientific  Sorvall X4R Capable of speeds up to 400 x g
Collagen coated plate, 24-well Greiner Bio-One 662950 Rat tail collagen coating
Counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002 Used for Cellometer counting 
Culture medium  LifeNet Health  MED-TCCM
Culture supplement  LifeNet Health  MED-TCSC
DAPI  Thermo Fisher Scientific  00-4959-52 Contains mounting medium
DPBS (-Ca, -Mg) Thermo Fisher Scientific  14190250 User preference 
Feeder cell supplement  LifeNet Health  MED-TCSA
Feeder cell thawing medium LifeNet Health  MED-FCTM
Fluorescent microscope  Zeiss AxioObserver Z1 Equipped with user specific filters 
Hepatocyte thawing medium LifeNet Health  MED-HHTM4C-50ML
Human albumin ELISA kit  abcam ab108788 Necessary if using same dilution
Human feeder cells LifeNet Health  PHFC24
Humidified incubator  VWR 97025-842 Capable of 5% CO2 
IC Fixation buffer Thermo Fisher Scientific  00-8222-49 Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used
ImageJ National Insitute of Health  Version 1.52a  1.52a or higher 
Inverted phase contrast microscope  Olympus CK40-F100 User preference 
Microcentrifuge tubes VWR 20170-022 User preference 
Micropipettes (various sizes) USA Scientific  ErgoOne User preference 
Permeabilization buffer (10x) Thermo Fisher Scientific  00-8333-56 Other permeabilization buffers can work
Plate reader  BMG Labtech CLARIOstar Capable of reading absorbance 450-640 nm
Plating medium  LifeNet Health  MED-TCPM
Plating supplement  LifeNet Health  MED-TCSB
Primary human hepatocytes  LifeNet Health  various  Catalog number may vary based on lot number
Secondary antibody  Thermo Fisher Scientific  A-21428 User preference 
Serological pipet controller Gilson  F110120 User preference 
Storage bottle 100–500 mL  VWR 76311-770 User preference 
Urea Nitrogen (BUN) Test  Stanbio 0580-250
Water bath PolyScience WBE05 Capable for use at 37 °C

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References

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Odanga, J. J., Gianulis, E., Whaley, L., LeCluyse, E. L., Presnell, S., Weaver, J. R. An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications. J. Vis. Exp. (200), e65992, doi:10.3791/65992 (2023).

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