Summary
Nylige tekniske fremskritt muliggjorde skalert produksjon av en in vitro-plattform for legemiddelmetabolisme og toksisitetsapplikasjoner. Et helmenneskelig 2D+ leversystem (TV2D+) gir fysiologisk relevante resultater ved hjelp av tradisjonelle todimensjonale dyrkningsmetoder. Denne protokollen vil støtte sluttbrukere i oppsett, vedlikehold og bruk av systemet.
Abstract
Det er fortsatt en utfordring å finne en langsiktig, humanrelevant kulturmodell for primære humane hepatocytter (PHH) for farmakologiske og toksikologiske studier. Nåværende in vitro-modellplattformer er ofte upraktiske og komplekse, mangler fenotypisk stabilitet over tid, og støtter ikke flere PHH-partier, mangler eksperimentell reproduserbarhet og fleksibilitet. Her gir vi en detaljert protokoll for tining, plating og vedlikehold av et helt menneskelig 2D + leversystem (TV2D +), som utnytter standard todimensjonale (2D) kulturteknikker og utstyr samtidig som levetiden og fenotypisk stabilitet over tid opprettholdes som vanligvis følger med mer komplekse tredimensjonale (3D) systemer. Resultatene viser feste og prosent platebarhet i TV2D+ som funksjon av PHH såtetthet, samt stabil funksjonalitet i minst 2 uker i kultur. En rekke PHH-såtettheter vurderes for å oppnå en vellykket langsiktig kultur. Når de er etablert riktig, organiserer PHH-ene i TV2D+ seg i hepatocyttkolonier, uttrykker en leverspesifikk markør og opprettholder levedyktighet, arkitektonisk integritet og fysiologisk relevante nivåer av albumin og urea. Denne unike kombinasjonen av egenskaper gjør TV2D+-systemet til en egnet levermodell for en rekke farmakologiske og toksikologiske applikasjoner.
Introduction
Forutsi terapeutisk sikkerhet og effekt er en viktig del av preklinisk legemiddelutvikling. Imidlertid er konvensjonelle prekliniske in vitro levermodeller begrenset i deres evne til nøyaktig å etterligne in vivo levercellulært mikromiljø og opprettholde hepatocyttfunksjonalitet og morfologi over tid. Det er behov for modeller som gir stabil metabolsk kompetanse i mer enn 1 uke for å vurdere langsomme omsetningsforbindelser eller undersøke utfall assosiert med subakutt eller kronisk eksponering. In vivo dyreforsøk klarer ofte ikke å forutsi legemiddeleffekt og risiko på grunn av translasjonsforskjeller i humane leverclearancemekanismer1. Nåværende in vitro 2-dimensjonale (2D) levermodeller, som tradisjonell primær human hepatocytt (PHH) monokultur eller sandwichkulturer, mangler fenotypisk stabilitet og lang levetid i kultur, noe som fører til tap av viktig hepatocellulær funksjon og arkitektonisk integritet over tid2. En alternativ metode innebærer dannelse av 3-dimensjonale (3D) hepatocyttsfæroider, som tilbyr et mer relevant mikromiljø versus 2D-kultur. Imidlertid er denne metoden begrenset av tilgjengeligheten av råvarer, PHH donor-lot utvalg, reproduserbarhet og tap av levedyktighet med økende sfæroid størrelse 3,4,5,6. Flercellede plattformer har blitt introdusert der PHH blir sådd med materceller på mikromønstrede plater i fast størrelse. Selv om disse modellene kan muliggjøre lengre kulturtider, kan ikke-menneskelige materceller som brukes i disse plattformene endre eksperimentelle resultater og begrense deres anvendelse på grunn av medfødt bakgrunnsbidrag til legemiddelclearance og metabolske profiler 1,7. TruVivo all-human 2D + leversystemet (TV2D +) nylig beskrevet i Weaver, et al8, ble utviklet for å løse noen av begrensningene i tradisjonelle, samkultur og 3D-kulturmetoder for PHH. De ikke-levermaterceller reduserer forskjellene mellom arter i metabolisme og parakrin produksjon og gir den støtten som er nødvendig for primære hepatocytter på en reproduserbar, robust måte som ikke kan leveres av tilsvarende ikke-parenkymale leverceller fra et enkelt donorparti på grunn av begrensninger i ekspansjon, fenotype og ytelse. De valgte matercellene kunne utvides konsekvent før bruk og manglet behovet for transformasjon eller differensiering. Som beskrevet av Glicklis et al.4 og Khetani et al.5, har 3D-kulturmodeller som hepatocytt-sfæroider utfordringer med reproduserbarhet på grunn av donorvariabilitet og opprettholdelse av konsistens i sfæroidstørrelse, noe som påvirker næringsdiffusjon i sfæroider større enn 200 μm, noe som fører til redusert levedyktighet og funksjonalitet. I likhet med 3D-sfæroiddannelse er TV2D+-systemet avhengig av selvmontering av PHH-er; Imidlertid er de dannede PHH-koloniene spredt over overflaten av brønnen på en enkeltcelledybde i stedet for komprimert til et enkelt aggregat. Denne kulturmetoden kan være nyttig for å adressere donorvariabilitet, slik at PHHer kan belagt, dyrkes og opprettholde grunnleggende funksjonalitet ved forskjellige såtettheter. TV2D+-systemet kan også øke robustheten til brukerhåndtering på grunn av tap under manipulering eller spesialutstyr som kreves for å utføre utvidet kultur i 3D-sfæroider.
TV2D+-systemet kombinerer standard 2D-kultur med lang levetid og fenotypisk stabilitet som vanligvis følger med 3D-systemer. Protokollen beskrevet her gir trinnvise instruksjoner for brukere med grunnleggende vevskulturferdigheter i laboratorier utstyrt med standardutstyr som biosikkerhetsskap, sentrifuger og CO2 -inkubatorer. Hvert trinn i prosessen er skissert i detalj, inkludert medieforberedelse, tining, plating og vedlikehold av det resulterende kultursystemet. Protokollen inneholder også en metode for å bestemme grunnleggende hepatocyttfunksjonalitetsutganger, albumin og urea, samt immunfluorescerende bildeanalyse for å bestemme PHH-vedlegg for normalisering. Når de er etablert riktig, organiserer PHHene i TV2D + seg i hepatocyttkolonier, etterligner den opprinnelige levermorfologien, og opprettholder utvidet levedyktighet, arkitektonisk integritet og fysiologisk relevante nivåer av albumin og urea i minst 2 uker8. Fordi systemet kan tillate en rekke PHH-såtettheter, kan det være nyttig for å øke tilgjengeligheten av mindre platable PHH-partier som har ønskelige donoregenskaper. Denne kombinasjonen av tilgjengelighet og funksjonalitet gjør TV2D+ til en egnet levermodell for en rekke farmakologiske og toksikologiske applikasjoner.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene til Lifenet Healths etiske komité. Manuskriptet inneholder ingen studier med mennesker eller dyrestudier utført av noen av forfatterne. Alle celler ble isolert fra donorvev fullt ut samtykket til forskningsformål av Lifenet Health.
1. Middels forberedelse
- Tine en flaske hver matercelle tinemedium, supplement A, supplement B og supplement C (se materialtabellen) i et vannbad på 37 °C eller 16-24 timer ved 4 °C.
- Aliquot hele flasken (10 ml) med tinemedium for materceller til et konisk rør på 15 ml eller 50 ml.
NOTAT: Størrelsen på cellepelleten vil være lettere å se ved hjelp av et 15 ml konisk rør. - Tilsett 4,5 ml tilskudd B og 11 ml tilskudd A til en flaske pletteringsmedium (75 ml) (se Materialfortegnelse) for å lage et komplett pletteringsmedium.
MERK: Komplett pletteringsmedium har en konsentrasjon på FBS <5% v / v. - I en separat flaske, tilsett 100 ml kulturmedium (se materialtabell), 1 ml supplement C og 14 ml supplement A for å lage et komplett kulturmedium.
MERK: Komplett kulturmedium har en konsentrasjon på FBS <1% v / v - Oppbevar gjenværende tilskudd C og tilskudd A ved -20 °C til uke 2 medium forberedelse.
MERK: Gjentatte fryse-tine sykluser vil redusere holdbarheten til kosttilskudd. Det anbefales å bare fryse-tine en gang. - Før bruk, varm 10 ml matercelle tinemedium, hepatocyttiningsmedium, komplett plating medium og komplett kultur medium i 20-30 minutter i et 37 ° C vannbad.
2. Tining, telling og plating av humane materceller (figur 1A)
- Dyrk matercellene ca. 1 time før såing av PHH. Tine materceller (se materialfortegnelse) i et vannbad på 37 °C i 1-2 minutter.
MERK: Unngå langvarig eksponering (f.eks. >2 min) ved å overvåke tining og fjerning av hetteglasset når væsken løsner i kryovialet når den snus opp. - Umiddelbart etter tining, legg matercellene på is.
- Ved hjelp av aseptiske teknikker, i et biosikkerhetskabinett (BSC), tilsett nytinte celler til 10 ml matercelle tinemedium.
- Bruk en 1000 mikrol pipette til å vaske hetteglasset én gang med 1 ml celle/tine medium suspensjon og samle opp.
- Spinn ved 400 x g i 4 minutter ved romtemperatur (RT).
- Kast supernatanten forsiktig for ikke å forstyrre cellepelleten ved pipettering eller vakuumaspirasjon. Resuspender cellepellet i 1 ml komplett pletteringsmedium og tell matercellene.
MERK: Materceller kan telles ved hjelp av akridin oransje og propidiumjodid (AOPI) på en automatisert celleteller eller trypanblå ved hjelp av et hemacytometer. Celleantallet kan variere avhengig av teknologi og bruker. For best resultat, telle dupliserte prøver og forbli konsekvent i den valgte metodikken. - Fortynn cellesuspensjonen til 100 000 celler/ml ved hjelp av det komplette pletteringsmediet.
- Plate 500 μL (50 000 celler) per brønn av den fortynnede cellesuspensjonen på en kollagenbelagt 24-brønnsplate (se materialfortegnelse).
- Rist platen i en nord (N)-Sør (S)-Øst (E)-Vest (W) bevegelse ved å bruke en frem og tilbake bevegelse i N-S retning 2 ganger etterfulgt av samme bevegelse E-W. Gjenta denne risteprotokollen 2 ganger til i totalt 3 runder.
MERK: Utfør risting med moderat kraft for å unngå sprut på platelokket mens du fortsatt hjelper til med cellefordeling (se video). - Inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 60 minutter.
- Vis matercellevedlegg før du fortsetter å tine hepatocytter.
MERK: Akseptabelt matercellefeste er visuelt ca. 50 % sammenflytende.
3. Tining, telling og plating av primære humane hepatocytter (figur 1B)
- Etter 30 min matercellekultur, filtrer foroppvarmet tinemedium for hepatocytter gjennom en 0,2 μm polyetersulfon (PES) filterenhet.
- Tine PHH i et vannbad på 37 °C i 1-2 minutter.
MERK: Unngå langvarig eksponering (f.eks. >2 min) ved å overvåke tining og fjerning av hetteglasset når væsken løsner i kryovialet når den snus opp. - Umiddelbart etter tining, legg PHH på is.
- I en BSC, hell PHH-suspensjonen i hepatocyttinemediet.
MERK: Unngå pipettering av PHH-cellesuspensjoner når det er mulig. Det er mest kritisk å ikke utføre pipettering under overføringen av tinte PHH fra kryovialet til tinemediet. - Bruk en 1000 mikrol pipette til å vaske hetteglasset 3-4 ganger ved forsiktig å pipetere 1 ml hepatocytt/tine medium suspensjon tilbake i hetteglasset og samle opp vasken ved å helle den tilbake i tinemediet.
- Sett hetten på og snu forsiktig tint PHH-suspensjon 5 ganger.
- Spinn ved 100 x g i 8 min ved RT.
- Kast supernatanten forsiktig for ikke å forstyrre cellepelleten ved pipettering eller vakuumaspirasjon. Til veggen av det koniske røret, tilsett 3 ml komplett pletteringsmedium.
- Rock det koniske røret fra side til side for å resuspendere cellepelleten.
- Tilsett ytterligere 5 ml komplett pletteringsmedium til de resuspenderte hepatocytter.
- Telle PHHs.
MERK: PHH kan telles ved hjelp av AOPI på en automatisert celleteller eller trypanblå ved hjelp av et hemacytometer. Celleantallet kan variere avhengig av teknologi og bruker. For best resultat, telle dupliserte prøver og forbli konsekvent i den valgte metodikken. - Fortynn cellesuspensjonen til ønsket såtetthet (300 000-600 000 PHHs/ml) ved bruk av hele pletteringsmediet.
MERK: Optimal hepatocyttsåingstetthet kan variere fra parti til parti. Den anbefalte såtettheten for et gitt parti vil bli gitt i analysesertifikatet (COA). Bruk ligningen nedenfor for å bestemme hepatocytter / ml for en 24-brønnsplate.
- Fjern mediet fra de belagte matercellene ved pipettering eller vakuumaspirasjon.
MERK: For å sikre levedyktigheten til matercellene, anbefales det å bytte ikke mer enn 3 brønner om gangen. - Plat umiddelbart 500 μL (150.000-300.000 celler) per brønn av den fortynnede hepatocyttsuspensjonen på den forhåndsbelagte kollagen 24-brønnplaten som inneholder materceller.
- Rist platen i en N-S-E-W-bevegelse ved å bruke en frem og tilbake bevegelse i N-S-retningen 2 ganger etterfulgt av samme bevegelse E-W. Gjenta denne risteprotokollen 2 ganger til i totalt 3 runder.
NOTAT: Utfør risting med moderat kraft for å unngå sprut på platelokket mens du fortsatt hjelper til med cellefordeling. - Inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 2-4 timer. De første 60 minuttene med kultur, rist platen hvert 15. minutt i N-S-E-W-bevegelse som i trinn 3.15 ovenfor.
- Etter inkubasjon, fjern platen fra inkubatoren og legg den i BSC.
- Rist platen og fjern hele pletteringsmediet ved pipettering eller vakuumaspirasjon.
MERK: For å sikre kulturens levedyktighet anbefales det å bytte ikke mer enn 3 brønner om gangen. - Tilsett umiddelbart 500 μL forvarmet komplett kulturmedium til hver brønn.
4. Vedlikehold
- Alikot og forvarmende komplett kulturmedium i et 37 °C vannbad i 20-30 min. Omtrent 13,5 ml medium er nødvendig for en 24-brønns plate.
- Fôrkulturer daglig med 500 μL per brønn av friskt, forvarmet komplett kulturmedium.
MERK: For å sikre kulturens levedyktighet anbefales det å bytte ikke mer enn 3 brønner om gangen. - Forbered fersk komplett kultur medium hver 7.
5. Innsamling av dyrkningssupernatantprøver for måling av albumin og urea
- På dag 7, 10 og 14 samles 500 μL medium fra ønsket prøvebrønn(er) inn i et mikrosentrifugerør(er), som vist i figur 1C.
- Spinn prøven(e) ved 320 x g i 10 minutter ved 4 °C for å pelletsrester.
- Bruk en pipette til å overføre supernatant(er) prøve(r) til nye(r) mikrosentrifugerør(er), slik at pelleten ikke forstyrres.
- Kjør prøvene på albumin- og/eller ureaanalysen (se henholdsvis pkt. 10 og 11).
MERK: Prøver kan oppbevares ved -20 °C til -80 °C i 2 uker.
6. Fargedag I
FORSIKTIG: Fikseringsbuffer inneholder paraformaldehyd. Paraformaldehyd kan forårsake øyeskader, hudirritasjon og organtoksisitet. Arbeid i et område med god ventilasjon og bruk passende personlig verneutstyr (PPE).
- Etter innsamling av mediumprøver på dag 14, tilsett 300 μL fikseringsbuffer (se materialtabell) til hver brønn som skal farges, som vist i figur 1C. Beis minimum 2 brønner.
- Inkuber ved 4 °C i 20–60 minutter.
- Forbered 1x permeabiliseringsbuffer (se materialfortegnelse) ved å tilsette 5 ml 10x stamløsning til 45 ml 1x PBS (se materialfortegnelse).
MERK: 1x permeabiliseringsbufferen kan lagres ved 4 ° C i 1 måned. - Vask 2 ganger med 300 μL 1x permeabiliseringsbuffer på is.
- Tilsett 300 μL primært antistoff cytokeratin 18 (se materialfortegnelse) ved bruk av en 1:1000 fortynning i 1x permeabiliseringsbuffer på is.
MERK: Minimalt, inkuber en brønn med 1x permeabiliseringsbuffer bare for en sekundær antistoffkontroll. - Inkuber 16-24 timer ved 4 °C.
7. Farging dag II
- Neste dag, fjern det primære antistoffet ved pipettering eller vakuumaspirasjon.
- Vask 2 ganger med 300 μL per brønn med 1x permeabiliseringsbuffer på is.
- Tilsett 300 mikroliter fluorescerende sekundært antistoff (se materialtabellen) ved bruk av en 1:500 fortynning i 1x permeabiliseringsbuffer (inkluderer kun sekundær kontroll).
MERK: Unngå lys når du bruker fluorescerende antistoffer. - Inkuber i 30-45 min ved 4 °C i mørket.
- Fjern det sekundære antistoffet ved pipettering eller vakuumaspirasjon.
- Vask 2 ganger med 300 μL per brønn med 1x permeabiliseringsbuffer på is.
- Vask 1 gang med 300 μL per brønn på 1x PBS.
- Legg 150 μL av 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) monteringsmedium (se tabell over materialer) til hver brønn og inkubere i 15 min ved RT i mørket.
MERK: Tallerkenen kan pakkes inn i parafilm og oppbevares ved 4 °C i mørket i 1 uke. - Se under et fluorescerende mikroskop. Ta 5 bilder av hver spesifikke fluorescerende kanal for hver brønn ved hjelp av 10x objektivlinsen (sørg for at ett bilde har en skalastang).
MERK: DAPI har en eksitasjon / utslipp på 358 nm / 461 nm. Bruk et fluorescerende mikroskop utstyrt med passende deteksjonsfiltre for både DAPI og det sekundære antistofffluoroforet.
8. ImageJ-analyse (figur 2)
MERK: Det anbefales å bruke ImageJ versjon 1.52a eller nyere.
- Åpne et bilde som inneholder en skalalinje i ImageJ. Klikk på Rett linje-ikonet og tegn en linje til den nøyaktige lengden på skalalinjen [Figur 2 (1)]
MERK: Klikk om nødvendig på Forstørrelsesglass-ikonet for å zoome inn eller ut. - Klikk på kategorien Analyser . Uthev og klikk Angi skala.
- Endre Kjent avstand til avstanden til skalastangen. Endre Lengdeenheter til enhetene på skalalinjen. Bruk innstillingene globalt ved å merke av for Globalt. Klikk OK for å angi skalaen.
MERK: Når denne innstillingen er brukt, vil hvert bilde som åpnes vise det beregnede området av synsfeltet i enheter som er lagt inn av brukeren. - Åpne et bilde med bare DAPI-innhold i ImageJ. Klikk på Prosess-fanen og Trekk fra bakgrunn. Fjern bakgrunnen 50 piksler om gangen til de ufargede områdene er svarte.
MERK: Hvis bildet ikke inneholder bakgrunn, er dette trinnet ikke nødvendig. - Klikk kategorien Bilde og uthev Type. Klikk på 8-bit for å lage bildet gråtoner [Figur 2 (2)].
- Terskel bildet manuelt eller automatisk for å inkludere alle DAPI-partiklene (pass på at du ikke overskrider terskelverdien manuelt) [figur 2 (3)]. Klikk på Bilde-fanen og uthev Juster. Klikk på Terskelverdi. Klikk på Bruk når du er ferdig.
- Klikk på Prosess-fanen og merk Binær. Klikk Vannskille.
- Klikk på Analyser-fanen og merk /klikk på Analyser partikler [Figur 2 (4)]. Sett størrelsen til 5-uendelig og sirkularitet til 0,00-1,00. I rullegardinfanen Vis velger du Disposisjoner. Sørg for at det er merket av for Vis resultater, Oppsummer og Inkluder hull. Klikk OK.
MERK: Det ønskede partikkelområdet kan justeres hvis terskelverdi gir bakgrunnspiksler. - Registrer telleresultatet som TOTAL DAPI.
- Åpne et sammenslått Cytokeratin 18/DAPI-bilde i ImageJ.
- Bruk flerpunktsikonet [figur 2 (5)] til å telle alle DAPI-partikler som ikke er farget for Cytokeratin 18 manuelt.
- Registrer resultatet som FEEDER-CELLER. Bruk ligningen nedenfor for å bestemme hepatocytt DAPI.
Hepatocytt DAPI = Total DAPI - Matercelle DAPI
9. Kvantifisering av totalt festede hepatocytter og prosentvis vedlegg (Plateability)
- Opprett en skalafaktor for kulturområdet med 24 brønner ved hjelp av ligningen nedenfor. Målinger av synsfelt finner du øverst i hvert bilde som åpnes [Figur 2 (2), grønn boks].
- Beregn de totale vedlagte hepatocytter ved hjelp av ligningen nedenfor.
Vedlagte hepatocytter = Skaleringsfaktor × Hepatocytt DAPI - Beregn prosentvis vedlegg av hepatocytter ved hjelp av ligningen nedenfor.
10. Albumin-analyse
- Mål albuminproduksjonen ved hjelp av en sandwichenzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) (se materialtabell) på prøver fortynnet ved 1:200.
MERK: For nøyaktighet bekrefter brukeren at prøvene faller innenfor det lineære området for standardkurven. Det spesifiserte settet inneholder alle materialer og instruksjoner for å utføre analysen. - Normaliser prøvekonsentrasjoner til festede hepatocytter ved hjelp av ligningen nedenfor.
11. Urea analyse
FORSIKTIG: Blodureanitrogen (BUN) syrereagens inneholder svovelsyre. Svovelsyrekonsentrasjonen i BUN-syrereagenset betraktes som etsende. Må ikke inntas. Arbeid i et område med god ventilasjon og bruk passende PPE.
- Ureasyntese måles ved hjelp av en modifisert diacetylmonoksimmetode (se materialtabell).
- Fortynn 53,3 μL av 75 mg / dl urea til 346,7 μL komplett kulturmedium for å lage Standard #1 (100 μg / ml)
- Merk rør 2-8 og bruk en 1: 2 seriell fortynning for å gjøre ureaanalysestandardene (tabell 1).
- Tilsett 10 μL prøve eller standard til brønner på en svartvegget, klar bunn 96-brønnplate (se materialfortegnelse).
- Tilsett 150 μL BUN-reagens til hver brønn som inneholder prøve. Forbered BUN-reagens ved å blande 1/3 BUN-fargereagens med 2/3 BUN-syrereagens. Bruk ligningen nedenfor for å hjelpe til med beregninger.
BUN-fargereagens (ml) = totalt BUN-reagens nødvendig × 0,333
BUN-syrereagens (ml) = totalt BUN-reagens nødvendig × 0,667 - Inkuber tallerkenen i 90 minutter i en ovn eller inkubator ved 60 °C.
- Les av plateabsorbansen umiddelbart ved 540 nm og 650 nm.
- Opprett en standardkurve ved å trekke blank og bakgrunnsabsorbans (650 nm) fra alle prøver og standarder. Generer en linje med best tilpasning ved lineær regresjonsanalyse.
- Bestem ukjent prøvekonsentrasjon fra standardkurven.
- Normaliser prøvekonsentrasjonene til festede hepatocytter ved hjelp av ligningen nedenfor.
Representative Results
Den overordnede metoden for plating, dyrking og grunnleggende funksjonalitetstesting av leverkultursystemet involverer vanlige primære cellekulturteknikker og analyse, som illustrert i figur 1. Hepatocyttfeste og prosentvis plateabilitet ble beregnet dag 14 ved hjelp av ImageJ-analyse av minst fem bilder av Cytokeratin 18 og DAPI-farging per brønn (figur 2). Representative bilder av PHHer dyrket med materceller er vist i figur 3. De forskjellige leversåtetthetene viste visuelle forskjeller i samløp basert på såtetthet og opprettholdt typisk hepatisk, kuboidal morfologi i 14 dager med kultur. Bilder av hepatocyttdonorparti A og B ble tatt for hver testede såtetthet (figur 4A). Den gjennomsnittlige prosentplatabiliteten for donor B (89,04 % ± 3,99 %, 198 552 ± 49 885 PHH) var høyere enn donor A (66,08 % ± 6,67 %, 146 128 ± 33 063 PHH) på tvers av alle såtettheter som ble brukt (figur 4B). Donor A hadde signifikant høyere prosentvis plateabilitet ved bruk av 150 000 PHHs/brønn (76,07 % ± 12,87 %) sammenlignet med 250 000-300 000 PHHs/well (62,75 % ± 9,64 %). Donor B viste ingen signifikante forskjeller i hepatocyttprosent plateabilitet. Donor B hadde lavest hepatocyttplateabilitet (85,78 % ± 13,25 %) ved høyeste såtetthet, 300 000 PHH/brønn. I likhet med donor A hadde seeding donor B ved 150 000 PHH / brønn den høyeste prosentandelen platabilitet av hepatocytter (94,75% ± 15,07%).
Albuminproduksjon og ureasyntese ble målt ved tre tidspunkter i løpet av 14-dagers kulturperioden og normalisert til beregnede vedlagte hepatocytter. Samlet sett hadde donor A økt albuminproduksjon sammenlignet med donor B (41,32 ± 4,58 μg alb / dag / 106 PHH vs. 34,66 ± 10,03 μg alb / dag / 106 PHHs) (figur 5). Donorene A og B hadde den høyeste albuminproduksjonen sådd hepatocytter på henholdsvis 150 000 PHHs/brønn, 45,91 ± 5,96 μg alb / dag / 106 PHH og 48,67 ± 20,44 μg alb / dag / 106 PHHs. Det ble ikke sett signifikante forskjeller i albuminproduksjonen i såtetthetene som ble brukt. Som nevnt av Baudy et al.3, er det ønskelig at leverens mikrofysiologiske systemer opprettholder konsistent albuminproduksjon og ureasyntese med mindre enn 50% endring over 14 dager med kultur. Variasjonskoeffisienten (CV) ble beregnet ved å dividere gjennomsnittet med standardavviket for dag 7, 10 og 14. Alle prøvene ble kjørt i duplikater. CV for albuminproduksjon over 14-dagers kulturperioden ved 150 000 PHH/brønn var 12,24 % for donor A og 37,97 % for donor B, mindre enn 50 %-kriteriet ønsket. En høy variasjon i albuminproduksjonen ble sett hos både donor A og donor B når de ble sådd ved 250 000 og 300 000 PHH/brønn. Ved disse såtetthetene opplever begge giverne en bratt nedgang i albuminproduksjonen mellom dag 7, 10 og 14 i kulturen (CV-donor A, 22,49% og donor B, 45,07%).
Donor B ureasyntese (95,09 ± 18,91 μg urea/dag/106) var økt sammenlignet med donor A (64,92 ± 4,66 μg urea/dag/106 PHH) ved gjennomsnitt av dag 7, 10 og 14 PHH partispesifikke data (figur 6). Donor B (113,49 ± 37,34 μg urea/dag/106 PHH) og donor A (69,12 ± 17,06 μg urea/dag/106 PHHs) hadde størst ureasyntese over en 14-dagers kulturperiode sådd med en tetthet på henholdsvis 150 000 PHHs/well og 200 000 PHHs/well. Begge donorpartiene hadde lavest ureaproduksjon og høyeste CV på 300 000 PHH/brønn. Ingen signifikante forskjeller i ureasyntese ble sett i såtetthetene som ble brukt. Den laveste CV for ureasyntese for donor A ble sett ved dyrkning ved 250 000 PPH/brønn (23,11 %) og 200 000 PHH/brønn for donor B (28,26 %). Som fremhevet av disse resultatene, avhenger optimal såtetthet for et gitt parti PHH av konfluensnivået som ønskes på tidspunktet for analysen og arten av resultatene som måles; Høyere såtetthet korrelerer ikke alltid med høyere signal eller dynamisk område.
Figur 1: Flytskjema over plating, dyrking og funksjonstesting av hepatocytter med materceller. (A) Materceller tines i et bestemt tinemedium (se materialtabell), resuspenderes i et komplett pletteringsmedium (se materialtabell), og cellene telles. Cellene fortynnes, belegges og inkuberes i 60 minutter ved 37 °C/5 % CO2. (B) Hepatocytter tines i et spesifikt tinemedium (se materialfortegnelse), resuspenderes i et komplett pletteringsmedium, og cellene telles. Hepatocytter fortynnes og belegges med materceller. Cellene inkuberes i 2-4 timer ved 37 °C/5% CO2, og rister i en N-S-E-W-bevegelse hvert 15. minutt de første 60 minuttene av kulturen. Pletteringsmediet erstattes med et forvarmet komplett kulturmedium for vedlikehold av kultur (se Materialtabell). Kulturene mates daglig. (C) På dag 7, 10 og 14 samles mediumprøver for albumin- og ureatesting. Etter prøvetaking dag 14 fikseres cellene og farges med antistoff mot cytokeratin 18 (se materialtabell) 16-24 timer ved 4 °C. Videre inkuberes de i et passende sekundært antistoff, vaskes og monteres med DAPI (se materialfortegnelse) for opptak og bildeanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bildeanalyse med ImageJ-programvare. ImageJ-behandling av bilder som er tatt. Trinn 1: En skala brukes på alle bilder basert på den mikroskopspesifikke skalalinjen. Trinn 2: bildetypen endres. Trinn 3: en terskelgrense brukes for å velge DAPI-partikler. Trinn 4: en partikkelanalyse utføres, og tellingen registreres. Trinn 5: For å bestemme antall vedlagte materceller, telles et sammenslått bilde ved hjelp av flerpunktsverktøyet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Morfologi av ulike leversåtettheter dyrket med materceller. Representative bilder på dag 7 og 14 av PHHs dyrket med materceller (50.000 celler / brønn) ved leversåtettheter på 150.000, 200.000, 250.000 og 300.000 PHH / brønner. Bildene ble tatt med en 10x objektivlinse på et invertert fasekontrastmikroskop. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fluorescerende immuncytokjemi av ulike leversåtettheter dyrket med materceller. (A) Representative bilder av Cytokeratin 18 (rød) farging på dag 14 ved leversåtettheter på 150 000, 200 000, 250 000 og 300 000 PHHs/brønner. To brønner for hver såtetthet ble festet i 30 min ved 4 °C. Brønnene ble inkubert 16-24 timer ved 4 °C med primært antistoff ved 1:1000. Sekundært antistoff ble brukt ved 1:500 i 30 minutter ved 4 °C i mørket. DAPI (blå) kjernefysisk flekk ble tilsatt brønner i 15 minutter ved romtemperatur. Bildene ble tatt med en 10X objektivlinse på et invertert fluorescerende mikroskop. Skalastang = 100 μm. (B) Beregnede vedlagte hepatocytter og prosent plateabilitet av forskjellige leversåtettheter beregnet ved hjelp av ImageJ. *p ≤ 0,05, til prosent platebarhet for 200 000, 250 000 og 300 000 PHH/brønn. Feilfelt representerer standardavvik (n ≥ 5 bilder per betingelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Albuminproduksjon av hepatocytter dyrket med materceller. Albuminproduksjon fra leversåingstettheter ved 150 000, 200 000, 250 000 og 300 000 PHH/brønn. Kolonner representerer 14-dagers gjennomsnittet av mikrogram albumin / dag normalisert til totalt festet hepatocytter. En linje representerer CV mellom dag 7, 10 og 14. Feilfelt representerer standardavvik (n ≥ 2 brønner per tilstand med replikater). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Ureasyntese av hepatocytter dyrket med materceller. Ureasyntese fra leversåingstettheter ved 150 000, 200 000, 250 000 og 300 000 PHH / brønn. Kolonner representerer 14-dagers gjennomsnitt av μg urea / dag normalisert til totalt festet hepatocytter. En linje representerer %CV mellom dag 7, 10 og 14. Feilfelt representerer standardavvik (n ≥ 2 brønner per tilstand med replikater). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Standard (er) # | Konsentrasjon (μg/ml) | Urealøsning (μL) | Komplett kultur (μL) |
| 1 | 100 | 53.3 75 mg / dL lager |
346.7 |
| 2 | 50 | 100 (S1-løsning) |
100 |
| 3 | 25 | 100 (S2-løsning) |
100 |
| 4 | 12.5 | 100 (S3-løsning) |
100 |
| 5 | 6.26 | 100 (S4-løsning) |
100 |
| 6 | 3.125 | 100 (S5-løsning) |
100 |
| 7 | 1.5625 | 100 (S6-løsning) |
100 |
| Blank | 0 | 0 | 100 |
Tabell 1: Urea standard prøvepreparering. Bruk 75 mg / dL lager urea, lag en 100 μg / ml ureaoppløsning. Aliquot de foreslåtte volumene for å nå den endelige konsentrasjonen for standardkurven.
Discussion
Det beskrevne leverkultursystemet kan etableres i laboratorier som er utstyrt med standard vevskulturinstrumentering. Systemet består av PHH-er dyrket med materceller, og lar brukeren dyrke PHH i minst to uker med stabil albuminproduksjon og ureasyntese. På grunn av variasjon i PHH-donorpartier anbefales kun forhåndsscreenede og kvalifiserte PHH-er for bruk i systemet. Selv om antall festede PHH-er varierer basert på donorparti og såtetthet, forblir den relative platebarheten lik innenfor hvert donorparti. Selv om anbefalte såtettheter anbefales, antyder dataene ovenfor at hepatocyttsåingstetthet kan justeres for forskjellige eksperimentelle behov; Det skal imidlertid bemerkes at seeding av et større antall PHHer kanskje ikke gir høyere eller mer konsistente funksjonelle utganger. Analyse av de evaluerte PHH-partiene viste lavest CV for albuminproduksjon og ureasyntese ved bruk av lavere såtetthet på 150 000 PHH/brønn og 200 000 PHHs/brønn; Det ble imidlertid ikke funnet signifikante forskjeller mellom albumin og urea ved noen såingstetthet. Høyere såtetthet på 250 000 PHH/brønn og 300 000 PHHs/brønn viser en større nedgang i albumin og urea i løpet av 14-dagers kulturperioden. Iboende donorvariabilitet i platebarhet kan påvirke konsistensen av albuminproduksjon og ureasyntese ved 250 000 PHHs/brønn og 300 000 PHHs/well for de testede donorpartiene. I likhet med store hepatocyttsfæroider, kan overseeding av PHH i TV2D + -systemet ha negative effekter på den langsiktige kulturen og funksjonaliteten til PHH.
Alle trinn i tining, plating og vedlikehold er avgjørende for vellykket kultur og datagenerering; Det er imidlertid flere vanlige feil uerfarne brukere kan unngå. PHH er svært utsatt for skader sekundært til temperatursvingninger, skjærspenning og eksponering for luft 9,10. Forholdsregler bør tas ved tining av PHH for å unngå langvarig tinetid og overdreven pipettering. Bruken av en håndhellemetode, en tidtaker og umiddelbar overføring fra vannbad til is vil redusere disse vanlige feilene som kan påvirke levedyktigheten og platabiliteten til PHH-ene. I tillegg, med forsyningskjedeproblemer som blir vanligere, kan det være vanskelig å skaffe kollagenbelagte plater. Manuelt belegg av vevskulturbehandlede plater ved bruk av kommersielle løsninger av kollagen type I (5-10 μg / cm2) kan brukes til å overvinne dette problemet; For optimal ytelse og konsistens anbefales det imidlertid å bruke forhåndsbelagte kollagenplater. I prosessen med overgang fra matercellekultur til innføring av PHH, er det kritisk å forhindre at matercellelaget tørker ut. Tillat aldri lufteksponering til matercellene. Enhver lufteksponeringstid kan føre til dårlig matercellelagskvalitet, noe som vil påvirke den langsiktige kulturen til PHH negativt. Det er beste praksis å la en liten mengde gjenværende medium forbli mellom middels endringer. Noen ganger kan PHH inneholde overflødig rusk fra isolasjon, noe som kan gjøre det vanskelig å se morfologi. For å hjelpe med dette problemet, rist platen før en middels endring og bruk vakuumaspirasjon. Til slutt, når du utfører en middels forandring, må du forsiktig aspirere det brukte mediet, og pass på at du ikke forstyrrer de dyrkede cellene. Pipett friskt mediumvolum ned på siden av brønnen for å unngå pipettering direkte på cellelaget. Brukeren bør også unngå lufteksponering ved hver middels endring, ved å bruke den anbefalte 3-brønnsendringen (avsnitt 3 og 4). Det skal også bemerkes at en daglig middels endring er ideell, men ikke nødvendig.
Selv om fluorescerende mikroskoper har blitt vanlig i de fleste laboratorier, kan programvare som trengs for å utføre spesifikk bildeanalyse medføre ekstra utgifter. ImageJ kan lastes ned gratis, noe som gjør det til et lett tilgjengelig bildeanalyseverktøy. Trinnene i protokollen gir et grunnlag som brukeren kan trenge å optimalisere, spesielt partikkelanalyse av DAPI-farging; I fravær av fluorescerende avbildningsevne er imidlertid PHH-festeverdier ved dag 14 angitt på partispesifikke analysesertifikater. Dårlig terskel vil føre til unøyaktig telling av DAPI-partiklene. Det anbefales også å sjekke overflaten av individuelle DAPI-partikler før du angir en størrelsesekskludering. Dette kan oppnås ved å bruke det ovale ikonet [Figur 2 (1), sirkelikonet under fanen Rediger ] og tegne en sirkel som omfatter DAPI-partikkelen. Kategorien Analyser kan deretter brukes til å måle arealet til den valgte DAPI-partikkelen. Spesifikke målinger kan velges ved hjelp av Angi målinger under fanen Analyser [trinn 8.9 og figur 2 (4)].
Nåværende metoder for dyrking av PHH involverer bruk av belegg som kollagen-I for å øke cellefeste i tradisjonell 2-dimensjonal monokultur11 eller overlegg med en ekstracellulær matrise, som murinbasert Matrigel, en teknikk som ofte refereres til som "sandwichkultur"12,13,14,15. Mens sandwichkulturteknikken forbedrer PHH-morfologi og polaritet over tid sammenlignet med tradisjonell monokultur, mangler begge tilnærmingene fortsatt langsiktig fenotypisk stabilitet i kultur for de fleste tallerkenable partier av PHH. En annen metode som brukes til å dyrke PHHer er å lage 3D-sfæroider; Som tidligere nevnt av Glicklis et al.4, kan det imidlertid være tekniske utfordringer med reproduserbarhet av sfæroidstørrelse på grunn av donorvariabilitet. I et forsøk på å lage en mer fysiologisk relevant levermodell, har flercellede modeller blitt utviklet. Som beskrevet av Ware et al.7, ved bruk av mikropatterning, aktiverte murine fibroblaster og primære humane lever sinusoid endotelceller omgitt av PHHs lengre in vitro kulturtider. Imidlertid kan mikropatterning være en kompleks og tidkrevende prosess, og de ikke-menneskelige matercellene kan bidra til bakgrunn i metabolske signaler, og begrense nytten av denne plattformen i visse applikasjoner. Bruken av forskjellige ikke-leverceller, inkludert humane og rotte dermale fibroblaster og bovine aorta endotelceller som materceller for samkultur av hepatocytter har vist albuminsekresjon og tett kryssdannelse som ligner på kokulturer av materceller av leveropprinnelse16. Imidlertid må mekanismen for interaksjoner mellom TV2D + ikke-levermaterceller og PHHene i kultur undersøkes videre for bedre å forstå innflytelsen på stabiliteten og funksjonaliteten til PHHene i dette systemet. Kultursystemet som tidligere ble beskrevet av Weaver et al.8 kan med hell dyrke PHH i leverkolonier i opptil 42 dager, og danne omfattende gallekanalikulære nettverk. PHHene dyrket i dette systemet opprettholdt viktig leverfunksjonalitet, inkludert cytokrom 1A2, 2B6 og 3A4 aktivitet og uridin 5'-difosfo-glukuronosyltransferase (UGT)-basert enzymaktivitet, fase I og II metabolittdannelse, albuminproduksjon og ureasyntese i minst 22 dager in vitro uten Matrigel. Dette kultursystemet produserer stabile, fysiologisk relevante utganger som lett kan tilpasses ethvert laboratorium for farmakologiske og toksikologiske applikasjoner. Selv om viktige PHH-funksjoner opprettholdes i TV2D+-systemet, er det ikke gjort direkte sammenligninger med 3D-sfæroidmodellen; Imidlertid vil fremtidig arbeid som sammenligner de samme PHH-giverne mellom kultursystemene vise seg å være verdifullt for å bestemme grensene og fordelene ved begge metodene.
Potensielle anvendelser av TV2D + inkluderer evaluering av metabolsk clearance og legemiddelinteraksjoner av forbindelser med lav omsetning, legemiddelindusert leverskade og risikovurdering av landbrukskjemikalier. Nøyaktig prediksjon av leverclearance av nye og framvoksende legemidler er avhengig av en stabil og langvarig PHH-kultur med retensjon av viktig hepatocellulær funksjonalitet, noe som er spesielt utfordrende ved evaluering av forbindelser med lav omsetning. I tillegg er risikovurdering og kjemisk indusert levertoksisitet store helseproblemer, og dagens modeller gir ikke langsiktig stabilitet og funksjonalitet i kultur for nøyaktig å evaluere potensiell kronisk kjemisk toksisitet som kan være sekundær til akutt eksponering. Friske og syke PHHer dyrket i TV2D+ viste karakteristiske forskjeller i funksjon og lipiddisposisjon som ble beholdt over tid17. Disse studiene støtter TV2D+ som et lovende verktøy for en rekke farmakologiske og toksikologiske anvendelser.
Disclosures
JO, LW, EG, EL, SP og JW er ansatte i LifeNet Health, den ideelle organisasjonen som produserer TV2D+.
Acknowledgments
Vi takker Mellissa Keller og Wendy Hetman for deres hjelp med manus- og figurgjennomgang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
| 15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
| Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
| Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
| AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
| Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
| Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
| Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
| Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
| Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
| Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
| DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
| Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
| Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
| Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
| Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
| Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
| Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
| IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
| ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
| Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
| Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
| Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
| Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
| Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
| Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
| Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
| Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
| Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
| Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
| Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |
References
- Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
- Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity. Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).
- Baudy, A. R., et al. Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry. Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Khetani, S. R., et al. Microengineered liver tissues for drug testing. Journal of Laboratory Automation. 20 (3), 216-250 (2015).
- Monckton, C. P., Brown, G. E., Khetani, S. R. Latest impact of engineered human liver platforms on drug development. APL Bioengineering. 5 (3), 031506 (2021).
- Ware, B. R., Durham, M. J., Monckton, C. P., Khetani, S. R. A cell culture platform to maintain long-term phenotype of primary human hepatocytes and endothelial cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 187-207 (2018).
- Weaver, J. R., et al. The morphology, functionality, and longevity of a novel all human hepatic cell-based tri-culture system. Toxicology In Vitro. 86, 105504 (2023).
- Li, W., et al. Matrix stiffness and shear stresses modulate hepatocyte functions in a fibrotic liver sinusoidal model. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), G272-G282 (2021).
- Thompson, S. M., et al. Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study. Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).
- Mooney, D., et al. Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix. Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).
- Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. L. Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration. The FASEB Journal. 10 (13), 1471-1484 (1996).
- Hamilton, G. A., et al. Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions. Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Sivaraman, A., et al. A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Goulet, F., Normand, C., Morin, O. Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes. Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).
- Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences. Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. 62nd Annual Meeting & ToxExpo, , Nashville, TN. 4283 (2023).
