Summary
Här presenteras ett protokoll för mekanisk utmattningstestning i fallet med humana röda blodkroppar med användning av en amplitudmodulerad elektrodeformationsmetod. Detta allmänna tillvägagångssätt kan användas för att mäta de systematiska förändringarna i morfologiska och biomekaniska egenskaper hos biologiska celler i en suspension från cyklisk deformation.
Abstract
Röda blodkroppar (RBC) är kända för sin anmärkningsvärda deformerbarhet. De genomgår upprepade gånger avsevärd deformation när de passerar genom mikrocirkulationen. Minskad deformerbarhet ses i fysiologiskt åldrade RBC. Befintliga tekniker för att mäta celldeformerbarhet kan inte enkelt användas för att mäta trötthet, den gradvisa nedbrytningen i cellmembran orsakad av cykliska belastningar. Vi presenterar ett protokoll för att utvärdera mekanisk nedbrytning i röda blodkroppar från cykliska skjuvspänningar med hjälp av ASK-modulationsbaserad elektrodeformation i en mikrofluidisk kanal. Kortfattat exciteras de interdigiterade elektroderna i mikrofluidikkanalen med en lågspänningsväxelström vid radiofrekvenser med hjälp av en signalgenerator. RBC i suspension svarar på det elektriska fältet och uppvisar positiv dielektrofores (DEP), som flyttar celler till elektrodkanterna. Cellerna sträcks sedan på grund av de elektriska krafter som utövas på de två cellhalvorna, vilket resulterar i enaxlig sträckning, känd som elektrodeformation. Nivån på skjuvspänningen och den resulterande deformationen kan enkelt justeras genom att ändra amplituden för excitationsvågen. Detta möjliggör kvantifieringar av olinjär deformerbarhet av röda blodkroppar som svar på små och stora deformationer vid hög genomströmning. Modifiering av excitationsvågen med ASK-strategin inducerar cyklisk elektrodeformation med programmerbara belastningshastigheter och frekvenser. Detta ger ett bekvämt sätt för karakterisering av RBC-trötthet. Vår ASK-modulerade elektrodeformationsmetod möjliggör för första gången en direkt mätning av RBC-utmattning från cykliska belastningar. Det kan användas som ett verktyg för allmän biomekanisk testning, för analyser av celldeformerbarhet och trötthet i andra celltyper och sjukdomstillstånd, och kan också kombineras med strategier för att kontrollera cellernas mikromiljö, såsom syrespänning och biologiska och kemiska signaler.
Introduction
Röda blodkroppar (RBC) är de mest deformerbara cellerna i människokroppen1. Deras deformerbarhet är direkt relaterad till deras syrebärande funktionalitet. Minskad deformerbarhet i RBC har visat sig korrelera med patogenesen av flera RBC-störningar2. Deformerbarhetsmätningar har lett oss till en bättre förståelse av RBC-relaterade sjukdomar3. Den normala livslängden för RBC kan variera från 70 till 140 dag4. Därför är det viktigt att mäta hur deras deformerbarhet minskar tillsammans med åldringsprocessen, t.ex. deras utmattningsbeteende på grund av cykliska skjuvspänningar3.
Att mäta RBC-deformerbarhet vid hög genomströmning är utmanande på grund av piconewton-skalkrafterna (~ 10-12 N) som appliceras på de enskilda cellerna. Under det senaste decenniet har många tekniker utvecklats för att mäta celldeformerbarhet5. Deformationsmätningar av röda blodkroppar på encellsnivå kan utföras med pipettaspiration och optisk pincett, medan bulkanalyser görs med osmotisk gradientektacytometri. Ektacytometrianalyser ger ett överflöd av data, vilket ger möjlighet att diagnostisera blodsjukdomar 6,7. Deformerbarheten hos röda blodkroppar kan också analyseras med hjälp av den viskoelastiska teorin genom kolloidsond atomkraftmikroskopi. I denna metod tillämpas beräkningsanalys för att uppskatta den elastiska modulen för RBC, med hänsyn till både tidsberoende och steady-state-svar. Deformerbarheten hos enskilda röda blodkroppar kan mätas med hjälp av encellsmetoden med mikrokammarmatris. Denna metod analyserar varje cell genom membranet och cytosoliska fluorescerande markörer för att ge information om RBC-deformerbarhet och fördelningen av cellulära egenskaper i komplexa RBC-populationer för att detektera hematologiska störningar8.
Utmattning är en nyckelfaktor i nedbrytningen av egenskaper hos konstruerade material och biomaterial. Utmattningsprovning möjliggör en kvantitativ analys av integriteten och livslängden hos en struktur som utsätts för cyklisk belastning. Analys av utmattning i biologiska celler har länge försvårats av avsaknaden av en allmän, lätt tillämpbar, hög genomströmning och kvantitativ metod för implementering av cyklisk deformation i cellmembran. Detta är möjligt med användning av elektrisk signalmodulering och elektrodeformationstekniker implementerade i en mikrofluidisk miljö. Amplitudskiftnyckeltekniken (ASK) som en digital modulering tillämpas genom OOK-modulering (On-Off keying) i den här artikeln. Begreppet keying avser överföring av digitala signaler över kanalen, vilket kräver en sinusvågbärarsignal för att fungera9. PÅ- och AV-tiderna kan ställas in lika. Under ON-keying går RBC in i ett deformerat tillstånd medan de utsätts för en extern elektrodeformationskraft (Fdep)10 skapad av det ojämna elektriska fältet. Under OFF-keying är RBC: er i sitt avslappnade tillstånd. Vi observerar tröttheten hos röda blodkroppar, nämligen en progressiv försämring av deras förmåga att sträcka sig med ökande belastningscykler. Den trötthetsinducerade deformerbarhetsförlusten i röda blodkroppar kan ge insikter om den ackumulerade membranskadan under blodcirkulationen, vilket gör det möjligt för oss att ytterligare undersöka sambanden mellan celltrötthet och sjukdomstillstånd.
Här tillhandahåller vi steg-för-steg-procedurer för hur utmattningstestning av RBC implementeras i en mikrofluidisk enhet via ASK-modulerad elektrodeformation och systeminställningarna såsom mikrofluidisk anordning, mekanisk belastning och mikroskopisk föreställning för karakterisering av den gradvisa nedbrytningen i mekanisk deformerbarhet av RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Avidentifierat humant helblod erhölls kommersiellt. Arbetet med blodproverna utfördes i ett biosäkerhetsnivå 2-laboratorium med hjälp av protokoll som godkänts av den institutionella biosäkerhetskommittén vid Florida Atlantic University.
1. Beredning av mikrofluidisk anordning
- Tejpa ner SU-8-masterkiselskivan för mikrofluidisk kanaldesign på insidan av en 14 cm petriskål av plast och rengör den medN2-gas .
- Väg upp 60 g polydimetylsiloxan (PDMS) bas och 6 g PDMS-härdningsmedel i en pappersmugg. Blanda de två delarna med en träspatel tills blandningen är en grumlig vit färg.
- Häll PDMS-blandningen i petriskålen av plast som innehåller kiselskivan. Placera petriskålen i en vakuumexsickator med en 3-vägs stoppkran. Vrid ventilen på stoppkranen för att ansluta vakuumet till exsickatorkammaren för att avlägsna luftbubblor från PDMS.
- Återför luft till sorptorkammaren genom att justera avstängningsventilen för att ansluta adsorkammaren till omgivningstemperaturen i cykler om cirka 5 minuter. Upprepa tills alla luftbubblor har tagits bort från kanalernas funktioner.
- Ställ in petriskålen i en ugn på 70 °C i 4 timmar. När tiden har gått, ta bort petriskålen, låt den svalna till rumstemperatur och lägg den på en skärmatta.
- Skär ut delen av PDMS ovanför kiselskivan med en skalpell. Placera utklippt PDMS mellan de två arken av lab-wrapping film. Spalten som bildas mellan mikrokanalens indrag och den halvtransparenta filmen underlättar identifieringen av mikrofluidkanalens placering samt dess respektive inlopp och utlopp.
- Använd ett rakblad och skär ut en enskild kanal från det stora PDMS. Stansa ett 3 mm inloppshål och 1,5 mm utloppshål med biopsistansar respektive de två storlekarna (figur 1A).
- Placera den hålstansade kanalen, med kanalsidan uppåt, på en ren glasskiva. Placera ett 20 mm x 15 mm glassubstrat innehållande tunnfilmsinterdigiterade elektroder av indiumtennoxid (ITO) på samma glasskiva med elektroderna uppåt.
- Placera försiktigt glasskivan med PDMS och substrat i en plasmarenare. Stäng gasventilen, slå på pumpomkopplaren och vänta 2 minuter för att få en sensoravläsning på 600 - 800 mTorr.
- Slå på strömbrytaren och vänta i 30 sekunder. Vrid RF-strömvredet från lågt till högt och vänta i 1 minut.
- Vänd sedan sekvensen genom att vrida RF-ratten till den låga, strömbrytaren till OFF, pumpomkopplaren till OFF och öppna gasventilen.
- Omedelbart efter att plasmarenarens kammare har öppnats, lyft och vrid PDMS så att kanalsidan är vänd nedåt (180°). Placera kanalen på toppen av ITO-substratet. Bindningsprocessen har börjat.
- Använd pincett och tryck försiktigt ner på hörnen på PDMS i cirka 3 sekunder. Undvik att trycka på själva kanalen.
OBS: Bindningsprocessen sker spontant vid fysisk kontakt mellan de två behandlade ytorna. - Fyll på grundmediet i en 1 ml spruta med en 23 G nål. Blöt försiktigt kanalen genom att föra in nålen rakt in i inloppsbrunnen och släpp sedan mediet. Arbeta långsamt. Introducera inte luftbubblor. Inkubera i minst 3 minuter.
- Ta bort det primära mediet med en 10 μL pipettspets. Tvätta kanalen med DEP-medium 3 gånger genom att föra in DEP-mediet i kanalen. Håll kanalen våt hela tiden.
2. Testfixtur
OBS: Testfixturen är konstruerad med 3D CAD-programvara och inkluderar en bashusenhet och en toppenhet (figur 1B). Sedan tillverkas den med en 3-axlig CNC-fräsmaskin med en standardtoleransgräns på cirka ± 0,005-tums dimensionen av testfixturen kontrolleras med en elektronisk bromsok (visas inte). Fixturens sterilitet krävs inte för biomekanisk in vitro-testning.
- Förlödda ledningar i lödkoppändarna på två uppsättningar fjäderkolvkontakter.
- Sätt i fjäderkolvanslutningarna i toppenheten och skapa en permanent bindning genom att tillsätta en droppe epoxilim.
3. Förberedelse av elektrodeformationsbuffert
- För att förbereda DEP-mediet, väg 12,75 g sackaros och 0,45 g dextros med en skala.
- Lös båda pulverna i en enda behållare med 150 ml avjoniserat (DI) vatten och 3,5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Använd en konduktivitetstestare med lågt intervall och mät konduktiviteten och se till att den är 0,04 S / m (figur 2).
OBS: Ett annat konduktivitetsvärde kan användas, vilket kan ändra tecknet och storleken på den resulterande DEP-kraften11. Elektrodeformation kräver emellertid en positiv DEP-kraft. - Använd en osmometer, bekräfta att osmolariteten ligger inom det normala intervallet för blodplasma, 275 till 295 mOsm / kg vatten (figur 3). Förvaras vid 4 °C. DEP-mediet är nu förberedt.
- Lös 0,5 g bovint serumalbumin (BSA) i 10 ml DEP-medium i ett 15 ml rör. Blanda noggrant. Enhetens primära medium är nu förberedt.
4. Beredning av cellsuspension
- Tvätta 20 μl helblod genom att centrifugera blodet med 1 ml PBS vid 268 x g i 3 minuter. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera RBC:erna i 1 ml PBS. Pipettera försiktigt för att blanda. Tvätta röda blodkropparna i 3 minuter vid 268 x g och kassera supernatanten.
- Extrahera 5 μl RBC-pellet med en 10 μl mikropipettspets och fördela fullständigt i 1 ml av DEP-mediet. Tvätta cellerna genom centrifugering vid 268 x g i 3 minuter.
- Kassera supernatanten och suspendera de röda blodkropparna igen i 1 ml DEP-medium. Pipettera försiktigt för att blanda.
- Tvätta röda blodkropparna i 3 minuter vid 268 x g och kassera supernatanten. Pipettera 2 μL RBC-pellet till 500 μL DEP-medium. Cellsuspensionen bereds nu med en koncentration inom ett intervall av 62 - 104 celler/μL12, vilket kan bekräftas med hjälp av ett standardglas för cellräkning.
5. Elektrodeformationsinställning och utmattningsprovning
- Placera mikrofluidanordningen i testfixturens nedre del. Rikta in den övre delen av fixturen mot enheten och montera de två delarna med två uppsättningar nylonskruvar och muttrar (figur 4).
- Placera testfixturen på mikroskopsteget. Leta reda på en önskad uppsättning elektroder under mikroskopet.
- Anslut motsvarande par elektrodtrådar som matchar den placerade elektroduppsättningen till funktionsgeneratorns utgångsterminal (figur 4).
- Avlägsna 5 μl av DEP-mediet från mikrofluidkanalens 3 mm-inlopp. Fyll långsamt på 5 μL av cellsuspensionen i inloppet med en 10 μL pipettspets.
- Låt cellerna slå sig ner i 1 min. Om det behövs lägger du till ytterligare ett DEP-medium i inloppet för att trycka in celler i kanalen.
- Observera kanalen under 20x förstoring. Använd ett 414/46 nm bandpassfilter för att förbättra bildbildens kontrast.
- Tryck på sinusknappen och definiera en sinusvåg med en2 V RMS-amplitud vid 3 MHz-frekvensen. Tryck på Mod-knappen för att aktivera modulering. Ändra vågläget till ASK genom att trycka på alternativet Typ .
- Ställ in moduleringsfrekvensen på 250 mHz, vilket motsvarar en lastnings-lossningsperiod på 4 s (figur 5A). Slå PÅ utgången från funktionsgeneratorn.
- Spela in en 1 min video var 10: e minut med 30 bilder per s (fps).
6. Karakterisering av RBC-deformation
- Använd ett videoredigeringsprogram och öppna .avi filer som spelats in i föregående steg genom att trycka på Ctrl+O. Använd tidslinjen för att välja en intresseram och ange att markeringens start- och slutbildrutor ska vara identiska genom att trycka på Home-tangenten och sedan på End-tangenten på tangentbordet.
- Exportera bildramen. Välj det utdataformat som ska vara JPEG och tryck på OK.
- Öppna ImageJ-applikationen och ladda bilderna som sparades i föregående steg. Börja med att ställa in nödvändiga mätningar genom att trycka på Analysera > Ställ in mått och se till att kryssrutorna för Area, Perimeter och Fit Ellipse är markerade. Tryck på OK.
- Konvertera sedan bilden till gråskala genom att välja Bild > Typ > 8-bitars.
- Konvertera sedan bilden till binär med hjälp av Image > Adjust > Thresholding. I dialogrutan Tröskelvärde justerar du de två skjutreglagen efter behov. Tryck på Verkställ och stäng sedan dialogrutan Tröskelvärde.
- Välj Analysera > verktyg > ROI Manager. I ROI-hanteraren trycker du på kryssrutan Visa alla. Stäng inte den här rutan.
- Välj verktyget Trollspö (kalkering), markera en lämplig cell i bilden och tryck på T på tangentbordet. Den valda cellen numreras. En ny cell kan väljas igen. Markera alla tillämpliga celler som ska mätas. De tillämpliga cellerna identifieras som de som är isolerade från andra celler. Antalet av dessa celler kan sträcka sig från 50 till 200 i ett enda synfält.
- Gå tillbaka till rutan ROI Manager och tryck på Mät. Då öppnas rutan Resultat. Kolumner märkta Major och Minor är längderna på de monterade ellipsens huvud- respektive delaxlar (i pixlar). Välj Arkiv > Spara som om du vill exportera måtten som en CSV-formaterad fil.
- Använd lämplig programvara för beräkningsanalys och beräkna kvoten mellan större och mindre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När cellsuspensionen laddades i den mikrofluidiska kanalen observerades en relativt jämn fördelning av celler. Vid signalutgången (t.ex. en enkel sinusvåg eller On-Keying-fas av ASK) från funktionsgeneratorn genererade de interdigiterade tunnfilmselektroderna ett ojämnt växelströmselektriskt fält. De suspenderade cellerna svarade spontant på denna elektriska excitation och uppvisade ett positivt DEP-beteende, nämligen att röra sig mot kanterna på elektroder med högre fältstyrka. Följaktligen justerades cellerna längs elektrodernas kanter och sträcktes på grund av elektrodeformation. Under On-Keying-fasen sträcks RBC på grund av elektrodeformation; under Off-Keying-fasen är RBC: er avslappnade (figur 5B). Att upprätthålla celldiskretitet är viktigt i detta protokoll. Med användning av utspädningsfaktorn som anges i detta protokoll var cellsuspensionen av normala röda blodkroppar i intervallet 62-104 celler/μl. Vid en koncentration inom detta område kunde vi få en hög genomströmning av cellmätning samtidigt som ackumuleringen av celler minimerades på grund av den positiva DEP-effekten.
När vi spårade enskilda RBC under 1 h utmattningstestning observerade vi en gradvis minskning av cellulär deformation (figur 5C). Deformerbarheten kvantifierades av förhållandet mellan huvud- och minoraxlarna för en ellips som användes för att passa de enskilda RBC: erna med hjälp av bildprogramvara med öppen källkod (figur 6). Bilder av intresse öppnades i programmet. Det var inte nödvändigt att kalibrera pixelstorleken till längdskala för deformerbarhetsmätningen. Numeriska data kan analyseras och plottas ytterligare med hjälp av programvara.
I detta protokoll samlades deformationsdata för RBC in i tidsintervallet 10 min under 1 h cyklisk mekanisk belastning med användning av 250 mHz ASK för att modulera 2 VRMS-3 MHz sinusvåg. En gradvis minskning av celldeformerbarheten observerades. Den totala deformerbarhetsförlusten för röda blodkroppar under detta utmattningstesttillstånd befanns vara 18 % (figur 7).
Figur 1: Mikrofluidisk anordning för elektrodeformation. (A) Schematisk bild av mikrofluidkanalen med biopsistansade hål på 1,5 mm respektive 3 mm för provutlopp respektive inlopp. (B) Sprängskiss av provningsfixturenheten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konduktivitetsmätarens funktion. En konduktivitetsmätare användes för att verifiera konduktiviteten hos DEP-mediet till 0,04 S / m. Avkänningsproberna vid mätarens bas är nedsänkta i provet för att erhålla en avläsning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Osmometerns funktion. En osmometer användes för att verifiera den osmotiska koncentrationen av DEP-mediet. Steg 1 - Fäst en provspets på plats på provtagaren och fyll på 20 μL prov. Steg 2 - Vila provtagaren i manöverhållaren och under vaggans topp. Steg 3 - Tryck ner hela manöverhållaren tills den når ett positivt stopp. Steg 4 - Instrumentet kör testet i cirka 1 min och visar resultatet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Anslutning till funktionsgeneratorn. Bild av experimentuppställningen för utmattningsprovning, inklusive testfixturenheten och en funktionsgenerator. ITO-elektrodkuddar är anslutna till funktionsgeneratorn med BNC-till-alligatorklämkabel via ledningarna förlödda i Pogo-stiftkopparna som pressas in i testfixturens övre enhet. Den mikrofluidiska anordningen med två oberoende parallella kanaler sitter på testfixturens bottenenhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Cellens svar på on-off-knappning. (A) På/av-modulerad sinusvåg för 1 timmes utmattningsprovning: sinusvåg med 2 V RMS-amplitud vid 3 MHz för elektrodeformation, moduleringsfrekvens på 250 mHz vilket resulterar i 2 s sträckning och 2 s avkoppling. (B) Under On-Keying-fasen sträcks RBC: er på grund av elektrodeformation; under Off-Keying-fasen är RBC: er avslappnade. (C) Elektrodeformation av en representativ cell visar gradvis nedbrytning i membrandeformation under 1 h cyklisk sträckning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Karakterisering av RBC-deformerbarhet med hjälp av ImageJ. Steg 1 - Importera bilden till bildredigeringsprogram och konvertera den till 8-bitars gråskala. Steg 2 - Justera tröskeln för att konvertera bilder till binär. Steg 3 - Välj celler med trollstavsverktyget (spårning) och hantera val med ROI-chefen. Steg 4 - Markera cellerna för att få mått för större och mindre axlar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Minskning av celldeformerbarhet. Gradvis nedbrytning av RBC-deformerbarhet på grund av cyklisk elektrodeformation. Felfältet visar standardavvikelsen (n = 69). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ASK OOK-moduleringen av en DEP-kraftinducerande sinusvåg kan användas för att testa den mekaniska utmattningen hos RBC under en lång tidsperiod. I detta protokoll begränsade vi in vitro-utmattningstestningen till 1 timme för att förhindra de potentiella negativa metaboliska effekterna på celldeformerbarheten. Omfattande utmattningstestförhållanden kan programmeras med hjälp av ASK-modulerad elektrodeformationsteknik. Parametrar som laddningsfrekvens, amplitud och laddningshastighet kan alla programmeras. Lastfrekvensen kan programmeras till varierande värden för att bestämma utmattningens beroende av belastningsfrekvens samt skillnader mellan cyklisk belastning och statisk belastning13.
Sträckningsstorleken kan enkelt justeras genom att använda en annan spänningsnivå för små eller stora deformationer. Men när man använder högspänningsnivåer för att inkludera stor deformation noteras att elektrodeformation kommer att resultera i flamliknande formade RBC (figur 6, steg 3). Detta kan medföra fel vid montering av cellformer med ellipser, vilket skär av cellernas spetsiga kanter. Under denna omständighet, speciellt när man använder elektrodeformationen för att extrahera membranskjuvningsviskoelasticitetsparametrar, kan två strategier användas: (i) användning av en beräkningsmodell av sanna cellformer kommer att ge mer exakta resultat än den enkla analytiska elliptiska formmodellen; (ii) använda en mindre spänningsnivå för att sträcka celler så att cellformerna kan utrustas väl med ellipser.
I det nuvarande protokollet var medieledningsförmågan 0,04 S/m, som kan justeras efter behov. Eftersom elektrodeformationsinducerad cellulär sträckning är relaterad till de verkliga värdena för den komplexa Clausius Mossotti-faktorn kan sinusvågfrekvensen skilja sig från den valda 3 MHz. Nyckeln är att minimera spänningen för att inducera elektrodeformation samtidigt som en försumbar Joule-uppvärmningseffekt bibehålls. En optimal elektrisk excitation kan bestämmas med hjälp av DEP-teori eller med hjälp av beräkningsverktyg för dielektrisk modellering av celler, såsom My DEP11.
Det bör noteras att cellimmobilisering inte krävs i detta protokoll eftersom celler som genomgår elektrodeformation i sig uppvisar positiv DEP, vilket flyttar celler till elektrodkanterna spontant. Detta gör att vi kan utföra tester på cellsuspensioner och immobilisera alla celler som interagerar med elektroden och samtidigt sträcker cellerna. När testningen är klar kan celler enkelt tas bort från enheten genom att spola kanalen med mediet. Kännetecknet för det nuvarande protokollet som gör att det fungerar bra med suspenderande celler kan begränsa dess tillämpning för att testa vidhäftande celler. Vi kan emellertid lossa vidhäftande celler från substratet med hjälp av kemikalier som etylendiamintetraättiksyra. Eftersom testningen kan utformas för att slutföras på relativt kort tid, från minuter till 1 h, har vi tillräckligt med tid för att utföra mekanisk utmattningstestning innan cellerna förankrar och sprider14.
I det nuvarande protokollet användes ett kommersiellt tillgängligt ITO-chip med 100 μm-bandinterdigiterade elektroder. Interdigiterad elektroddesign är fördelaktig för att mäta flera celler åt gången för längd-till-area-förhållandet, eftersom cellerna sträcks vid elektrodernas kanter. Mätningens genomströmning är också beroende av observationsfältet, där cellstorlek och deformerbarhet sätter begränsningar för elektrodernas minsta gap. Elektrodernas bandbredd kan minskas ytterligare för att öka antalet observationsceller för högre genomströmning. Elektrodmaterialen kan vara andra metaller, såsom titan eller guld; Elektrodmaterialens transparens kan dock vara ett bättre val eftersom en del av cellmembranen kan blockeras av de icke-transparenta elektroderna. Testet kan fortfarande utföras om en relevant matematisk formmodell av cellen, såsom en ellipsoid13, kan användas under bildbehandling.
Teoretiskt sett kan denna elektrodeformation och ASK-modulerade elektrodeformationstekniker fungera på andra celltyper, givet rätt förhållanden, t.ex. medelledningsförmåga och elektriska excitationer. En begränsning är hur mycket töjning vi kan observera. RBC är en bra cellmodell för sin stora deformerbarhet och cirkulerande natur. Det nuvarande protokollet har tillämpats för att studera humana röda blodkroppar i både hälsa och sjukdom och är lätt utrustad med en gasmikromiljö för att studera hypoxisk trötthet13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) och NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M.
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
