Summary
يظهر هنا بروتوكول لاختبار التعب الميكانيكي في حالة خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام نهج التشوه الكهربائي المعدل السعة. يمكن استخدام هذا النهج العام لقياس التغيرات المنهجية في الخصائص المورفولوجية والميكانيكية الحيوية للخلايا البيولوجية في تعليق من التشوه الدوري.
Abstract
تشتهر خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) بتشوهها الملحوظ. يتعرضون مرارا وتكرارا لتشوه كبير عند المرور عبر دوران الأوعية الدقيقة. يظهر انخفاض التشوه في كرات الدم الحمراء المسنة من الناحية الفسيولوجية. لا يمكن بسهولة استخدام التقنيات الحالية لقياس تشوه الخلايا لقياس التعب ، والتدهور التدريجي في أغشية الخلايا الناجم عن الأحمال الدورية. نقدم بروتوكولا لتقييم التدهور الميكانيكي في كرات الدم الحمراء من إجهادات القص الدورية باستخدام التشوه الكهربائي القائم على تعديل مفتاح إزاحة السعة (ASK) في قناة الموائع الدقيقة. باختصار ، يتم إثارة الأقطاب الكهربائية المتداخلة في قناة الموائع الدقيقة بتيار متناوب منخفض الجهد عند ترددات الراديو باستخدام مولد إشارة. تستجيب كرات الدم الحمراء المعلقة للمجال الكهربائي وتظهر رحلان كهربائي إيجابي (DEP) ، والذي ينقل الخلايا إلى حواف القطب. ثم تتمدد الخلايا بسبب القوى الكهربائية التي تمارس على نصفي الخليتين ، مما يؤدي إلى تمدد أحادي المحور ، يعرف باسم التشوه الكهربائي. يمكن تعديل مستوى إجهاد القص والتشوه الناتج بسهولة عن طريق تغيير سعة موجة الإثارة. وهذا يتيح تحديد كميات التشوه غير الخطي لكرات الدم الحمراء استجابة للتشوهات الصغيرة والكبيرة عند الإنتاجية العالية. يؤدي تعديل موجة الإثارة باستخدام إستراتيجية ASK إلى حدوث تشوه كهربائي دوري بمعدلات تحميل وترددات قابلة للبرمجة. هذا يوفر طريقة مريحة لتوصيف التعب كرات الدم الحمراء. يتيح نهج التشوه الكهربائي المعدل ASK الخاص بنا ، لأول مرة ، قياسا مباشرا لإجهاد كرات الدم الحمراء من الأحمال الدورية. يمكن استخدامه كأداة للاختبار الميكانيكي الحيوي العام ، لتحليل تشوه الخلايا والتعب في أنواع الخلايا الأخرى والظروف المرضية ، ويمكن أيضا دمجه مع استراتيجيات للتحكم في البيئة المكروية للخلايا ، مثل توتر الأكسجين والإشارات البيولوجية والكيميائية.
Introduction
خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) هي أكثر الخلايا تشوها في جسم الإنسان1. ترتبط قابليتها للتشوه ارتباطا مباشرا بوظائفها في حمل الأكسجين. تم العثور على انخفاض التشوه في كرات الدم الحمراء ليرتبط مع التسبب في العديد من اضطرابات كرات الدمالحمراء 2. قادتنا قياسات التشوه إلى فهم أفضل للأمراض المرتبطة بكرات الدم الحمراء3. يمكن أن يختلف العمر الطبيعي لكرات الدم الحمراء من 70 إلى 140 يوما4. لذلك ، من المهم قياس كيفية انخفاض قابليتها للتشوه جنبا إلى جنب مع عملية الشيخوخة ، على سبيل المثال ، سلوك التعب بسبب إجهادات القص الدورية3.
يعد قياس تشوه كرات الدم الحمراء عند الإنتاجية العالية أمرا صعبا بسبب قوى مقياس piconewton (~ 10-12 N) التي يتم تطبيقها على الخلايا الفردية. على مدى العقد الماضي ، تم تطوير العديد من التقنيات لقياس تشوه الخلايا5. يمكن إجراء قياسات تشوه كرات الدم الحمراء على مستوى الخلية الواحدة عن طريق شفط الماصة والملاقط البصرية ، بينما يتم إجراء التحليلات السائبة عن طريق قياس التدرج التناضحي. توفر تحليلات قياس كتكتاوات الدم وفرة من البيانات ، مما يوفر فرصة لتشخيص اضطرابات الدم 6,7. يمكن أيضا تحليل تشوه كرات الدم الحمراء باستخدام نظرية المرونة اللزجة بواسطة مجهر القوة الذرية للمسبار الغرواني. في هذه الطريقة ، يتم تطبيق التحليل الحسابي لتقدير معامل المرونة لكرات الدم الحمراء ، مع الأخذ في الاعتبار كل من الاستجابات المعتمدة على الوقت والحالة المستقرة. يمكن قياس تشوه كرات الدم الحمراء الفردية باستخدام طريقة صفيف الغرفة الدقيقة أحادية الخلية. تحلل هذه الطريقة كل خلية من خلال الغشاء وعلامات الفلورسنت الخلوية لتوفير معلومات عن تشوه كرات الدم الحمراء وتوزيع الخصائص الخلوية في مجموعات كرات الدم الحمراء المعقدة للكشف عن الاضطرابات الدموية8.
التعب هو عامل رئيسي في تدهور خصائص المواد الهندسية والمواد الحيوية. يتيح اختبار التعب إجراء تحليل كمي لسلامة وطول عمر الهيكل المعرض للتحميل الدوري. لطالما تم إعاقة تحليل التعب في الخلايا البيولوجية بسبب عدم وجود طريقة عامة وقابلة للتطبيق بسهولة وإنتاجية عالية وكمية لتنفيذ التشوه الدوري في أغشية الخلايا. هذا ممكن مع استخدام تعديل الإشارة الكهربائية وتقنيات التشوه الكهربائي المنفذة في بيئة الموائع الدقيقة. يتم تطبيق تقنية مفتاح إزاحة السعة (ASK) كتعديل رقمي من خلال تعديل مفتاح On-Off (OOK) في هذه المقالة. يشير مفهوم المفاتيح إلى إرسال الإشارات الرقمية عبر القناة ، الأمر الذي يتطلب إشارة حاملة موجة جيبية لتعمل9. يمكن ضبط أوقات التشغيل والإيقاف على قدم المساواة. تحت ON-keying ، تدخل كرات الدم الحمراء في حالة مشوهة أثناء تعرضها لقوة تشوه كهربائي خارجي (Fdep) 10 تم إنشاؤها بواسطة المجال الكهربائي غير المنتظم. تحت OFF-keying ، تكون كرات الدم الحمراء في حالة استرخاء. نلاحظ إجهاد كرات الدم الحمراء ، أي التدهور التدريجي في قدرتها على التمدد مع زيادة دورات التحميل. يمكن أن يوفر فقدان التشوه الناجم عن التعب في كرات الدم الحمراء نظرة ثاقبة على تلف الغشاء المتراكم أثناء الدورة الدموية ، مما يمكننا من إجراء مزيد من التحقيق في الروابط بين إجهاد الخلايا وحالات المرض.
نقدم هنا إجراءات خطوة بخطوة حول كيفية تنفيذ اختبار التعب لكرات الدم الحمراء في جهاز الموائع الدقيقة عبر التشوه الكهربائي المعدل ASK وإعدادات النظام مثل جهاز الموائع الدقيقة ، والتحميل الميكانيكي ، والتخيل المجهري لتوصيف التدهور التدريجي في التشوه الميكانيكي لكرات الدم الحمراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الدم البشري الكامل غير المحدد تجاريا. وأجري العمل المتعلق بعينات الدم في مختبر من المستوى 2 للسلامة الأحيائية باستخدام البروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية في جامعة فلوريدا أتلانتيك.
1. إعداد جهاز الموائع الدقيقة
- قم بلصق رقاقة السيليكون الرئيسية SU-8 لتصميم قناة الموائع الدقيقة داخل طبق بتري بلاستيكي مقاس 14 سم وقم بتنظيفه بغاز N2 .
- تزن 60 جم من قاعدة polydimethylsiloxane (PDMS) و 6 جم من عامل معالجة PDMS في كوب ورقي. اخلطي الجزأين باستخدام ملعقة خشبية حتى يصبح الخليط أبيض غائم.
- صب خليط PDMS في طبق بتري البلاستيكي الذي يحتوي على رقاقة السيليكون. ضع طبق بتري في مجفف مفرغ مع محبس 3 اتجاهات. أدر صمام المحبس لتوصيل الفراغ بغرفة التجفيف لإزالة فقاعات الهواء من PDMS.
- أعد إدخال الهواء إلى حجرة التجفيف عن طريق ضبط صمام المحبس لتوصيل غرفة المجفف بالمحيط في حوالي 5 دقائق دورات. كرر حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء من ميزات القنوات.
- ضع طبق بتري داخل فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. بمجرد انقضاء الوقت ، قم بإزالة طبق بتري ، واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، وضعه على حصيرة تقطيع.
- باستخدام مشرط ، اقطع جزء PDMS فوق رقاقة السيليكون. ضع PDMS المقطوع بين ورقتي فيلم تغليف المختبر. تسهل الفجوة المتكونة بين المسافة البادئة للقناة الدقيقة والفيلم شبه الشفاف تحديد موقع قناة الموائع الدقيقة بالإضافة إلى مدخلها ومخرجها.
- باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقطع قناة فردية من PDMS الكبير. قم بثقب مدخل 3 مم وفتحة مخرج 1.5 مم باستخدام لكمات الخزعة الخاصة بالحجمين (الشكل 1 أ).
- ضع القناة المثقوبة ، بحيث يكون جانب القناة متجها لأعلى ، على شريحة زجاجية نظيفة. ضع ركيزة زجاجية مقاس 20 مم × 15 مم تحتوي على أقطاب كهربائية متداخلة من أكسيد القصدير الإنديوم (ITO) ذات الأغشية الرقيقة على نفس الشريحة الزجاجية مع توجيه الأقطاب الكهربائية لأعلى.
- ضع الشريحة الزجاجية برفق مع PDMS والركيزة في منظف البلازما. أغلق صمام الغاز ، وقم بتشغيل مفتاح المضخة ، وانتظر 2 دقيقة للحصول على قراءة مستشعر من 600 - 800 mTorr.
- قم بتشغيل مفتاح الطاقة وانتظر 30 ثانية. أدر مقبض طاقة التردد اللاسلكي من منخفض إلى مرتفع وانتظر لمدة 1 دقيقة.
- بعد ذلك ، اعكس التسلسل عن طريق تدوير مقبض التردد اللاسلكي إلى المستوى المنخفض ، ومفتاح الطاقة إلى OFF ، ومفتاح المضخة إلى OFF ، وفتح صمام الغاز.
- مباشرة بعد فتح حجرة منظف البلازما ، ارفع وتدوير PDMS بحيث يكون جانب القناة متجها لأسفل (180 درجة). ضع القناة أعلى ركيزة ITO. بدأت عملية الترابط.
- باستخدام الملقط ، اضغط برفق على زوايا PDMS لمدة 3 ثوان تقريبا. تجنب الضغط على القناة نفسها.
ملاحظة: تحدث عملية الترابط تلقائيا عند الاتصال الجسدي بين السطحين المعالجين. - قم بتحميل وسيط التحضير في حقنة سعة 1 مل بإبرة 23 جرام. بلل القناة بعناية عن طريق إدخال الإبرة مباشرة في بئر المدخل ثم تحرير الوسيط. تعمل ببطء. لا تدخل فقاعات الهواء. احتضان لمدة 3 دقائق على الأقل.
- قم بإزالة الوسط الرئيسي باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر. اغسل القناة بوسيط DEP 3 مرات عن طريق إدخال وسيط DEP في القناة. حافظ على القناة رطبة في جميع الأوقات.
2. اختبار لاعبا اساسيا
ملاحظة: تم تصميم تركيبات الاختبار باستخدام برنامج 3D CAD وتتضمن وحدة سكنية أساسية ووحدة علوية (الشكل 1B). بعد ذلك ، يتم تصنيعها باستخدام آلة طحن CNC ذات 3 محاور مع حد تسامح قياسي يبلغ حوالي ± يتم فحص أبعاد 0.005 بوصة من تركيبات الاختبار باستخدام الفرجار الإلكتروني (غير معروض). عقم لاعبا اساسيا غير مطلوب للاختبار الميكانيكي الحيوي في المختبر.
- أسلاك ما قبل اللحام في نهايات كوب اللحام لمجموعتين من موصلات المكبس الزنبركية.
- أدخل موصلات مكبس الزنبرك في الوحدة العلوية وقم بإنشاء رابطة دائمة عن طريق إضافة قطرة من غراء الإيبوكسي.
3. إعداد العازلة للعمل التشوه الكهربائي
- لتحضير وسط DEP ، قم بوزن 12.75 جم من السكروز و 0.45 جم من سكر العنب باستخدام الميزان.
- قم بإذابة كلا المساحيق في وعاء واحد يحتوي على 150 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) و 3.5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- باستخدام جهاز اختبار الموصلية منخفضة المدى ، قم بقياس الموصلية وتأكد من أنها 0.04 ثانية / م (الشكل 2).
ملاحظة: يمكن استخدام قيمة توصيل مختلفة ، والتي يمكن أن تغير علامة وحجم قوة DEP الناتجة11. ومع ذلك ، يتطلب التشوه الكهربائي قوة DEP موجبة. - باستخدام مقياس الأسموزية ، تأكد من أن الأسمولية ضمن المعدل الطبيعي لبلازما الدم ، 275 إلى 295 mOsm / kg من الماء (الشكل 3). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. تم إعداد وسيط DEP الآن.
- في أنبوب سعة 15 مل ، قم بإذابة 0.5 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في 10 مل من وسط DEP. تخلط جيدا. تم الآن إعداد الوسيط الرئيسي للجهاز.
4. إعداد تعليق الخلية
- اغسل 20 ميكرولتر من الدم الكامل عن طريق الطرد المركزي للدم باستخدام 1 مل من PBS عند 268 × جم لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
- أعد تعليق كرات الدم الحمراء في 1 مل من PBS. ماصة بلطف لخلط. اغسل كرات الدم الحمراء لمدة 3 دقائق عند 268 × جم وتخلص من المادة الطافية.
- استخرج 5 ميكرولتر من حبيبات كرات الدم الحمراء باستخدام طرف ماصة صغيرة سعة 10 ميكرولتر ووزعها بالكامل في 1 مل من وسط DEP. اغسل الخلايا بالطرد المركزي عند 268 × جم لمدة 3 دقائق.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كرات الدم الحمراء في 1 مل من وسط DEP. ماصة بلطف لخلط.
- اغسل كرات الدم الحمراء لمدة 3 دقائق عند 268 × جم وتخلص من المادة الطافية. ماصة 2 ميكرولتر من حبيبات كرات الدم الحمراء إلى 500 ميكرولتر من وسط DEP. يتم الآن تحضير معلق الخلية بتركيز في نطاق 62 - 104 خلية / ميكرولتر12 ، والتي يمكن تأكيدها باستخدام شريحة عد الخلايا القياسية.
5. إعداد التشوه الكهربائي واختبار التعب
- ضع جهاز الموائع الدقيقة في الجزء السفلي من تركيبات الاختبار. قم بمحاذاة الجزء العلوي من التركيب مع الجهاز وقم بتجميع الجزأين باستخدام مجموعتين من مسامير وصواميل النايلون (الشكل 4).
- ضع تركيبات الاختبار على مرحلة المجهر. حدد موقع مجموعة واحدة مرغوبة من الأقطاب الكهربائية تحت المجهر.
- قم بتوصيل الزوج المقابل من أسلاك القطب الكهربائي التي تطابق مجموعة القطب الموجودة بطرف الإخراج لمولد الوظيفة (الشكل 4).
- قم بإزالة 5 ميكرولتر من وسط DEP من مدخل 3 مم لقناة الموائع الدقيقة. قم بتحميل 5 ميكرولتر ببطء من تعليق الخلية في المدخل باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر.
- السماح للخلايا لتستقر لمدة 1 دقيقة. إذا لزم الأمر ، أضف وسيط DEP إضافيا إلى المدخل لدفع الخلايا إلى القناة.
- راقب القناة تحت تكبير 20x. استخدم مرشح تمرير النطاق 414/46 نانومتر لتحسين تباين التصوير.
- اضغط على زر الجيب وحدد موجة جيبية بسعة 2 فولتRMS بتردد 3 ميجاهرتز. اضغط على زر Mod لتمكين التعديل. قم بتغيير وضع الموجة إلى ASK بالضغط على خيار النوع .
- اضبط تردد التعديل على 250 ميجاهرتز ، وهو ما يتوافق مع فترة تحميل وتفريغ 4 ثوان (الشكل 5 أ). قم بتشغيل إخراج مولد الوظائف.
- سجل مقطع فيديو مدته 1 دقيقة كل 10 دقائق بمعدل 30 إطارا لكل ثانية (fps).
6. توصيف تشوه كرات الدم الحمراء
- باستخدام تطبيق تحرير الفيديو ، افتح .avi الملفات المسجلة في الخطوة السابقة بالضغط على Ctrl + O. استخدم المخطط الزمني لاختيار إطار اهتمام وقم بتعيين إطارات بداية التحديد ونهايته لتكون متطابقة بالضغط على مفتاح Home ثم مفتاح الإنهاء على لوحة المفاتيح.
- تصدير إطار الصورة. حدد تنسيق الإخراج ليكون JPEG واضغط على موافق.
- افتح تطبيق ImageJ وقم بتحميل الصور المحفوظة في الخطوة السابقة. ابدأ بتعيين القياسات المطلوبة بالضغط على تحليل > تعيين القياسات والتأكد من تحديد خانات الاختيار الخاصة بالمنطقة والمحيط واحتواء القطع الناقص . اضغط على موافق.
- بعد ذلك، قم بتحويل الصورة إلى درجات رمادية باختيار نوع > الصورة > 8 بت.
- ثم قم بتحويل الصورة إلى ثنائية باستخدام Image > ضبط > Thresholding. في شاشة العتبة، اضبط منزلقي التمرير حسب الحاجة. اضغط على تطبيق ثم أغلق مربع الحوار عتبة.
- اختر تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار، اضغط على مربع الاختيار المسمى إظهار الكل. لا تغلق هذا المربع.
- حدد أداة العصا (التتبع)، وحدد خلية قابلة للتطبيق في الصورة، واضغط على T على لوحة المفاتيح. سيتم ترقيم الخلية المحددة. يمكن تحديد خلية جديدة مرة أخرى. حدد جميع الخلايا القابلة للتطبيق المراد قياسها. يتم تحديد الخلايا القابلة للتطبيق على أنها تلك المعزولة عن الخلايا الأخرى. يمكن أن يتراوح عدد هذه الخلايا من 50 إلى 200 في مجال رؤية واحد.
- ارجع إلى مربع مدير عائد الاستثمار واضغط على قياس. يؤدي هذا إلى فتح مربع النتائج. الأعمدة المسماة الرئيسية والصغرى هي أطوال المحاور الرئيسية والثانوية القطعية المجهزة (بالبكسل) ، على التوالي. اختر ملف > حفظ باسم لتصدير القياسات كملف بتنسيق CSV.
- باستخدام أي برنامج تحليل حسابي مناسب ، احسب حاصل قسمة التخصص الرئيسي والثانوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما تم تحميل تعليق الخلية في قناة الموائع الدقيقة ، لوحظ توزيع موحد نسبيا للخلايا. عند خرج الإشارة (على سبيل المثال ، موجة جيبية بسيطة أو مرحلة On-Keying من ASK) من مولد الوظائف ، ولدت الأقطاب الكهربائية ذات الأغشية الرقيقة المتداخلة مجالا كهربائيا غير منتظم للتيار المتردد. استجابت الخلايا العالقة تلقائيا لهذا الإثارة الكهربائية وأظهرت سلوكا إيجابيا ل DEP ، أي التحرك نحو حواف الأقطاب الكهربائية ذات شدة المجال الأعلى. وبالتالي ، تم محاذاة الخلايا على طول حواف الأقطاب الكهربائية وتم تمديدها بسبب التشوه الكهربائي. في ظل مرحلة On-Keying ، يتم تمديد كرات الدم الحمراء بسبب التشوه الكهربائي ؛ في ظل مرحلة إيقاف المفاتيح ، يتم استرخاء كرات الدم الحمراء (الشكل 5 ب). الحفاظ على خصوصية الخلايا مهم في هذا البروتوكول. باستخدام عامل التخفيف كما هو مذكور في هذا البروتوكول ، كان تعليق الخلية لكرات الدم الحمراء العادية في نطاق 62 - 104 خلية / ميكرولتر. عند التركيز ضمن هذا النطاق ، تمكنا من الحصول على إنتاجية عالية لقياس الخلية مع تقليل تراكم الخلايا بسبب تأثير DEP الإيجابي.
عند تتبع كرات الدم الحمراء الفردية أثناء اختبار التعب لمدة 1 ساعة ، لاحظنا انخفاضا تدريجيا في التشوه الخلوي (الشكل 5C). تم قياس التشوه من خلال نسبة المحاور الرئيسية والثانوية للقطع الناقص الذي تم استخدامه لتناسب كرات الدم الحمراء الفردية ، باستخدام برنامج تصوير مفتوح المصدر (الشكل 6). تم فتح الصور ذات الأهمية في البرنامج. لم يكن من الضروري معايرة حجم البكسل في مقياس الطول لقياس قابلية التشوه. يمكن تحليل البيانات الرقمية ورسمها باستخدام البرنامج.
في هذا البروتوكول ، تم جمع بيانات تشوه كرات الدم الحمراء في الفترة الزمنية البالغة 10 دقائق خلال 1 ساعة من التحميل الميكانيكي الدوري باستخدام 250 mHz ASK لتعديل الموجة الجيبية 2 VRMS-3 MHz. لوحظ انخفاض تدريجي في تشوه الخلايا. تم العثور على إجمالي فقدان التشوه لكرات الدم الحمراء في ظل حالة اختبار التعب هذه بنسبة 18٪ (الشكل 7).
الشكل 1: جهاز الموائع الدقيقة للتشوه الكهربائي. (أ) رسم تخطيطي لقناة الموائع الدقيقة مع ثقوب مثقوبة بالخزعة 1.5 مم و 3 مم لمخرج العينة ومدخل ، على التوالي. ( ب) منظر متفجر لمجموعة تركيبات الاختبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشغيل مقياس الموصلية. تم استخدام مقياس الموصلية للتحقق من أن موصلية وسط DEP تساوي 0.04 ثانية / م. يتم غمر مجسات الاستشعار في قاعدة العداد في العينة للحصول على قراءة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تشغيل مقياس الأسمومتر. تم استخدام مقياس الأسموزي للتحقق من التركيز الاسموزي لوسط DEP. الخطوة 1 - ضع طرف العينة في مكانه على جهاز أخذ العينات وقم بتحميل 20 ميكرولتر من العينة. الخطوة 2 - ضع جهاز أخذ العينات داخل قاعدة التشغيل وأسفل قمة المهد. الخطوة 3 - ادفع قاعدة التشغيل بالكامل لأسفل حتى تصل إلى نقطة توقف إيجابية. الخطوة 4 - تقوم الأداة بإجراء الاختبار لمدة 1 دقيقة تقريبا وتعرض النتيجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اتصال مولد الوظائف. صورة للإعداد التجريبي لاختبار التعب ، بما في ذلك مجموعة تركيبات الاختبار ومولد الوظائف. يتم توصيل وسادات قطب ITO بمولد الوظائف بواسطة كابل مشبك BNC إلى التمساح عبر الأسلاك الملحومة مسبقا في أكواب دبوس Pogo المضغوطة في الوحدة العلوية لتركيبات الاختبار. يقع جهاز الموائع الدقيقة مع قناتين متوازيتين مستقلتين على الوحدة السفلية لتركيبات الاختبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: استجابة الخلية لمفتاح التشغيل والإيقاف. (أ) تشغيل وإيقاف تشغيل موجة جيبية معدلة لاختبار التعب لمدة 1 ساعة: موجة جيبية من سعةRMS 2 V عند 3 MHz لعمل التشوه الكهربائي ، تردد تعديل 250 mHz مما يؤدي إلى 2 ثانية من التمدد و 2 ثانية من الاسترخاء. (ب) في مرحلة تشغيل المفاتيح ، تتمدد كرات الدم الحمراء بسبب التشوه الكهربائي ؛ في إطار مرحلة إيقاف المفاتيح ، يتم استرخاء كرات الدم الحمراء. (ج) يظهر التشوه الكهربي لخلية ممثلة تدهورا تدريجيا في تشوه الغشاء خلال 1 ساعة من التمدد الدوري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: توصيف تشوه كرات الدم الحمراء باستخدام ImageJ. الخطوة 1 - قم باستيراد الصورة إلى برنامج تحرير الصور وتحويلها إلى تدرج رمادي 8 بت. الخطوة 2 - اضبط الحد الأدنى لتحويل الصور إلى ثنائي. الخطوة 3 - حدد الخلايا باستخدام أداة العصا (التتبع) وقم بإدارة التحديدات باستخدام مدير عائد الاستثمار. الخطوة 4 - حدد الخلايا للحصول على قياسات للمحاور الرئيسية والثانوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: انخفاض تشوه الخلايا. التدهور التدريجي في تشوه كرات الدم الحمراء بسبب التشوه الكهربائي الدوري. يظهر شريط الخطأ الانحراف المعياري (n = 69). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام تعديل ASK OOK لموجة جيبية تحفز قوة DEP لاختبار التعب الميكانيكي لكرات الدم الحمراء على مدى فترة طويلة من الزمن. في هذا البروتوكول ، قصرنا اختبار التعب في المختبر على 1 ساعة لمنع الآثار الأيضية الضارة المحتملة على تشوه الخلية. يمكن برمجة ظروف اختبار التعب الشاملة باستخدام تقنية التشوه الكهربائي المعدل ASK. يمكن برمجة معلمات مثل تردد التحميل والسعة ومعدل التحميل. يمكن برمجة تردد التحميل إلى قيم متفاوتة لتحديد اعتماد التعب على تردد التحميل وكذلك الاختلافات بين التحميل الدوري والتحميل الثابت13.
يمكن ضبط حجم التمدد بسهولة باستخدام مستوى جهد مختلف للتشوهات الصغيرة أو الكبيرة. ومع ذلك ، عند استخدام مستويات الجهد العالي لتشمل تشوها كبيرا ، يلاحظ أن التشوه الكهربائي سيؤدي إلى كرات الدم الحمراء على شكل يشبه اللهب (الشكل 6 ، الخطوة 3). يمكن أن يؤدي ذلك إلى حدوث أخطاء عند تركيب أشكال الخلايا مع علامات الحذف ، والتي تقطع الحواف المدببة للخلايا. في ظل هذه الظروف ، خاصة عند استخدام التشوه الكهربائي لاستخراج معلمات مرونة لزوجة القص الغشائي ، يمكن استخدام استراتيجيتين: (أ) استخدام نموذج حسابي لأشكال الخلايا الحقيقية سيوفر نتائج أكثر دقة من نموذج الشكل الإهليلجي التحليلي البسيط ؛ (ب) سيوفر استخدام نموذج حسابي لأشكال الخلايا الحقيقية نتائج أكثر دقة من نموذج الشكل الإهليلجي التحليلي البسيط. (ii) استخدام مستوى جهد أصغر لتمديد الخلايا بحيث يمكن تركيب أشكال الخلايا بشكل جيد مع علامات الحذف.
في البروتوكول الحالي ، كانت الموصلية المتوسطة 0.04 S / m ، والتي يمكن تعديلها حسب الحاجة. نظرا لأن التمدد الخلوي الناجم عن التشوه الكهربائي مرتبط بالقيم الحقيقية لعامل Clausius Mossotti المعقد ، يمكن أن يختلف تردد الموجة الجيبية عن 3 MHz المحدد. المفتاح هو تقليل الجهد للحث على التشوه الكهربائي مع الحفاظ على تأثير تسخين جول ضئيل. يمكن تحديد الإثارة الكهربائية المثلى باستخدام نظرية DEP أو باستخدام أدوات حسابية لنمذجة العزل الكهربائي للخلايا ، مثل My DEP11.
وتجدر الإشارة إلى أن تجميد الخلية غير مطلوب في هذا البروتوكول لأن الخلايا التي تخضع للتشوه الكهربائي تظهر بطبيعتها DEP إيجابيا ، والذي ينقل الخلايا إلى حواف القطب تلقائيا. يتيح لنا ذلك إجراء اختبار على معلقات الخلايا وشل حركة جميع الخلايا التي تتفاعل مع القطب الكهربائي وتمتد الخلايا في نفس الوقت. بمجرد الانتهاء من الاختبار ، يمكن إزالة الخلايا بسهولة من الجهاز عن طريق شطف القناة بالوسيط. إن خاصية البروتوكول الحالي التي تجعله يعمل بشكل جيد مع الخلايا المعلقة قد تحد من تطبيقه لاختبار الخلايا الملتصقة. ومع ذلك، يمكننا فصل الخلايا اللاصقة عن الركيزة باستخدام مواد كيميائية مثل حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك. نظرا لأنه يمكن تصميم الاختبار ليتم إكماله في وقت قصير نسبيا ، من دقائق إلى 1 ساعة ، فلدينا ما يكفي من الوقت لإجراء اختبار التعب الميكانيكي قبل أن ترسو الخلايا وتنتشر14.
في البروتوكول الحالي ، تم استخدام شريحة ITO متاحة تجاريا مع أقطاب كهربائية متداخلة بنطاق 100 ميكرومتر. يعد تصميم القطب الكهربائي المتقاطع مفيدا لقياس خلايا متعددة في وقت واحد لنسبة الطول إلى المساحة ، حيث يتم شد الخلايا عند حواف الأقطاب الكهربائية. يعتمد معدل إنتاجية القياس أيضا على مجال المراقبة ، حيث يضع حجم الخلية وقابلية التشوه قيودا على الحد الأدنى من فجوة الأقطاب الكهربائية. يمكن تقليل عرض النطاق الترددي للأقطاب الكهربائية لزيادة عدد خلايا المراقبة للحصول على إنتاجية أعلى. يمكن أن تكون مواد القطب معادن أخرى ، مثل التيتانيوم أو الذهب ؛ ومع ذلك ، قد تكون شفافية مواد القطب خيارا أفضل حيث يمكن حظر جزء من أغشية الخلايا بواسطة الأقطاب الكهربائية غير الشفافة. لا يزال من الممكن إجراء الاختبار إذا كان من الممكن استخدام نموذج شكل رياضي ذي صلة للخلية ، مثل الإهليلجي13 ، أثناء معالجة التصوير.
من الناحية النظرية ، يمكن أن تعمل تقنيات التشوه الكهربائي والتشوه الكهربائي المعدلة ASK على أنواع الخلايا الأخرى ، في ظل الظروف المناسبة ، على سبيل المثال ، الموصلية المتوسطة والإثارة الكهربائية. القيد هو مقدار الاستطالة التي يمكننا ملاحظتها. كرات الدم الحمراء هي نموذج خلية جيد لتشوهها الكبير وطبيعتها المتداولة. تم تطبيق البروتوكول الحالي لدراسة كرات الدم الحمراء البشرية في كل من الصحة والمرض وهو مجهز بسهولة ببيئة دقيقة للغاز لدراسة التعب الناجم عن نقص الأكسجين13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل NSF / CMMI Mechanobiology لناقلات الأكسجين الاصطناعي القائمة على الهيموجلوبين (# 1941655) و NSF / CMMI التحليل الديناميكي والتعب لخلايا الدم الحمراء الصحية والمريضة (# 1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M.
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
