Summary
Presentert her er en protokoll for mekanisk utmattelsestesting i tilfelle av humane røde blodlegemer ved bruk av en amplitudemodulert elektrodeformasjonstilnærming. Denne generelle tilnærmingen kan brukes til å måle de systematiske endringene i morfologiske og biomekaniske egenskaper hos biologiske celler i en suspensjon fra syklisk deformasjon.
Abstract
Røde blodlegemer (RBC) er kjent for sin bemerkelsesverdige deformabilitet. De gjennomgår gjentatte ganger betydelig deformasjon når de passerer gjennom mikrosirkulasjonen. Redusert deformabilitet ses i fysiologisk aldrende RBC. Eksisterende teknikker for å måle celledeformabilitet kan ikke lett brukes til å måle tretthet, gradvis nedbrytning i cellemembraner forårsaket av sykliske belastninger. Vi presenterer en protokoll for å evaluere mekanisk nedbrytning i RBC fra sykliske skjærspenninger ved bruk av amplitude shift keying (ASK) modulasjonsbasert elektrodeformasjon i en mikrofluidisk kanal. Kort fortalt er de interdigiterte elektrodene i den mikrofluidiske kanalen begeistret med en lavspent vekselstrøm ved radiofrekvenser ved hjelp av en signalgenerator. RBC i suspensjon reagerer på det elektriske feltet og utviser positiv dielektroforese (DEP), som beveger celler til elektrodekantene. Cellene blir deretter strukket på grunn av de elektriske kreftene som utøves på de to cellehalvdelene, noe som resulterer i uniaxial strekking, kjent som elektrodeformasjon. Nivået av skjærspenning og den resulterende deformasjonen kan enkelt justeres ved å endre amplituden til eksitasjonsbølgen. Dette muliggjør kvantifiseringer av ikke-lineær deformabilitet av RBC som respons på små og store deformasjoner ved høy gjennomstrømning. Modifisering av eksitasjonsbølgen med ASK-strategien induserer syklisk elektrodeformasjon med programmerbare lasthastigheter og frekvenser. Dette gir en praktisk måte for karakterisering av RBC-tretthet. Vår ASK-modulerte elektrodeformasjonstilnærming muliggjør for første gang en direkte måling av RBC-tretthet fra sykliske belastninger. Det kan brukes som et verktøy for generell biomekanisk testing, for analyser av celledeformabilitet og tretthet i andre celletyper og syke tilstander, og kan også kombineres med strategier for å kontrollere mikromiljøet i celler, for eksempel oksygenspenning og biologiske og kjemiske signaler.
Introduction
Røde blodlegemer (RBC) er de mest deformerbare cellene i menneskekroppen1. Deres deformabilitet er direkte relatert til deres oksygenbærende funksjonalitet. Redusert deformabilitet i RBC har vist seg å korrelere med patogenesen av flere RBC-lidelser2. Deformabilitetsmålinger har ført oss til en bedre forståelse av RBC-relaterte sykdommer3. Den normale levetiden til RBC kan variere fra 70 til 140 dag4. Derfor er det viktig å måle hvordan deformabiliteten avtar sammen med aldringsprosessen, for eksempel utmattingsatferden på grunn av sykliske skjærspenninger3.
Måling av RBC-deformabilitet ved høy gjennomstrømning er utfordrende på grunn av piconewtonskalakreftene (~ 10-12 N) som påføres de enkelte cellene. I løpet av det siste tiåret har mange teknologier blitt utviklet for å måle celledeformabilitet5. Deformasjonsmålinger av RBC på encellenivå kan utføres ved pipetteaspirasjon og optisk pinsett, mens bulkanalyser gjøres ved osmotisk gradient ektacytometri. Ektacytometrianalyser gir en overflod av data, noe som gir mulighet til å diagnostisere blodsykdommer 6,7. Deformabiliteten til RBC kan også analyseres ved hjelp av viskoelastisk teori ved kolloid sonde atomkraftmikroskopi. I denne metoden brukes beregningsanalyse for å estimere den elastiske modulen til RBC, med tanke på både tidsavhengige og stabile responser. Deformabiliteten til individuelle RBC kan måles ved å bruke enkeltcelle mikrokammerarray-metoden. Denne metoden analyserer hver celle gjennom membranen og cytosoliske fluorescerende markører for å gi informasjon om RBC-deformabilitet og fordelingen av cellulære egenskaper i komplekse RBC-populasjoner for å oppdage hematologiske lidelser8.
Fatigue er en nøkkelfaktor i nedbrytningen av egenskapene til konstruerte materialer og biomaterialer. Utmattingstesting muliggjør en kvantitativ analyse av integriteten og levetiden til en konstruksjon utsatt for syklisk belastning. Analyse av tretthet i biologiske celler har lenge vært hemmet av mangelen på en generell, lett anvendelig, høy gjennomstrømning og kvantitativ metode for implementering av syklisk deformasjon i cellemembraner. Dette er mulig ved bruk av elektrisk signalmodulasjon og elektrodeformasjonsteknikker implementert i en mikrofluidisk setting. Amplitude shift-tasteteknikken (ASK) som en digital modulasjon brukes gjennom On-Off keying (OOK) modulasjon i denne artikkelen. Begrepet keying refererer til overføring av digitale signaler over kanalen, som krever et sinusbølgebærersignal for å fungere9. PÅ- og AV-tidene kan settes like. Under ON-keying går RBC-er inn i en deformert tilstand mens de utsettes for en ekstern elektrodeformasjonskraft (Fdep)10 opprettet av det ujevne elektriske feltet. Under OFF-keying er RBC i sin avslappede tilstand. Vi observerer tretthet av RBC, nemlig en progressiv nedbrytning i deres evne til å strekke seg med økende belastningssykluser. Det tretthetsinduserte deformabilitetstapet i RBC kan gi innsikt i den akkumulerte membranskaden under blodsirkulasjonen, slik at vi kan undersøke sammenhengen mellom celleutmattelse og sykdomstilstander ytterligere.
Her gir vi trinnvise prosedyrer for hvordan utmattingstesting av RBC implementeres i en mikrofluidisk enhet via ASK-modulert elektrodeformasjon og systeminnstillingene som mikrofluidisk enhet, mekanisk belastning og mikroskopisk avbildning for karakterisering av gradvis nedbrytning i mekanisk deformerbarhet av RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Avidentifisert humant fullblod ble kommersielt oppnådd. Arbeidet med blodprøvene ble utført i et biosikkerhetsnivå 2-laboratorium ved hjelp av protokoller godkjent av Institutional Biosafety Committee ved Florida Atlantic University.
1. Forberedelse av mikrofluidisk enhet
- Teip ned SU-8 master silisiumskiven for mikrofluidisk kanaldesign på innsiden av en plast 14 cm petriskål og rengjør den med N2 gass.
- Vei 60 g polydimetylsiloksan (PDMS) base og 6 g PDMS-herdemiddel i en papirkopp. Bland de to delene med en trespatel til blandingen er en overskyet hvit farge.
- Hell PDMS-blandingen i petriskålen av plast som inneholder silisiumskiven. Legg petriskålen i en vakuumtørker med en 3-veis stoppekran. Vri ventilen på stoppekranen for å koble vakuumet til tørkekammeret for å fjerne luftbobler fra PDMS.
- Gjeninnfør luft i tørkekammeret ved å justere stoppekranventilen for å koble tørkekammeret til omgivelsene i løpet av ca. 5 minutters sykluser. Gjenta til alle luftbobler er fjernet fra kanalfunksjonene.
- Sett petriskålen inn i en ovn ved 70 °C i 4 timer. Når tiden er gått, fjern petriskålen, la den avkjøles til romtemperatur og legg den på en skjærematte.
- Bruk en skalpell, kutt ut delen av PDMS over silisiumskiven. Plasser utskjæringen PDMS mellom de to arkene med lab-innpakningsfilm. Gapet dannet mellom innrykket til mikrokanalen og den halvtransparente filmen letter identifiseringen av plasseringen av den mikrofluidiske kanalen, så vel som dens respektive innløp og utløp.
- Bruk et barberblad til å kutte ut en individuell kanal fra de store PDMS-ene. Punch et 3 mm innløpshull og 1,5 mm utløpshull med biopsistanser i de to størrelsene (figur 1A).
- Plasser den hullete kanalen, med kanalsiden vendt oppover, på en ren glasssklie. Plasser et 20 mm x 15 mm glasssubstrat som inneholder tynnfilm Indium Tin Oxide (ITO) interdigiterte elektroder på samme glassglass med elektrodene vendt opp.
- Plasser forsiktig glassglasset med PDMS og substrat i en plasmarenser. Lukk gassventilen, slå på pumpebryteren og vent 2 minutter for å oppnå en sensoravlesning på 600 - 800 mTorr.
- Slå på strømbryteren og vent i 30 s. Vri RF-strømknappen fra lav til høy og vent i 1 min.
- Deretter reverserer du sekvensen ved å vri RF-knappen til den lave, strømbryteren til AV, pumpebryteren til AV og åpne gassventilen.
- Umiddelbart etter at plasmarenserens kammer er åpnet, løft og roter PDMS slik at kanalsiden vender ned (180°). Plasser kanalen på toppen av ITO-underlaget. Bindingsprosessen har begynt.
- Bruk pinsett, trykk forsiktig ned på hjørnene av PDMS i ca 3 s. Unngå å trykke på selve kanalen.
MERK: Bindingsprosessen skjer spontant ved fysisk kontakt mellom de to behandlede flatene. - Legg primingmediet i en 1 ml sprøyte med en 23 G kanyle. Fukt kanalen forsiktig ved å stikke nålen rett inn i innløpsbrønnen og deretter slippe mediet. Operer sakte. Ikke innfør luftbobler. Inkuber i minst 3 minutter.
- Fjern hovedmediet med en 10 μL pipettespiss. Vask kanalen med DEP-medium 3 ganger ved å sette inn DEP-mediet i kanalen. Hold kanalen våt til enhver tid.
2. Testarmatur
MERK: Testarmaturen er utformet ved hjelp av 3D CAD-programvare og inkluderer en basehusenhet og en toppenhet (figur 1B). Deretter produseres den ved hjelp av en 3-akset CNC-fresemaskin med en standard toleransegrense på rundt ± 0,005-tommers dimensjon av testarmaturen kontrolleres ved hjelp av en elektronisk tykkelse (ikke vist). Armaturens sterilitet er ikke nødvendig for in vitro biomekanisk testing.
- Forloddetråder i loddekoppendene av to sett med fjærstempelkontakter.
- Sett fjærstempelkontaktene inn i toppenheten og opprett en permanent binding ved å legge til en dråpe epoksylim.
3. Forberedelse av elektrodeformasjonsbuffer
- For å forberede DEP-mediet, veier du 12,75 g sukrose og 0,45 g dextrose ved hjelp av en skala.
- Løs opp begge pulverene i en enkelt beholder med 150 ml avionisert (DI) vann og 3,5 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
- Bruk en konduktivitetstester med lavt område til å måle konduktiviteten og sikre at den er 0,04 S/m (figur 2).
MERK: En annen konduktivitetsverdi kan brukes, noe som kan endre fortegnet og størrelsen på den resulterende DEP-kraften11. Elektrodeformasjon krever imidlertid en positiv DEP-kraft. - Bruk osmometer til å bekrefte at osmolariteten er innenfor normalområdet for blodplasma, 275 til 295 mOsm/kg vann (figur 3). Oppbevares ved 4 °C. DEP-mediet er nå klargjort.
- Oppløs 0,5 g bovint serumalbumin (BSA) i et 15 ml rør av DEP-mediet. Bland godt. Enhetens primære medium er nå forberedt.
4. Tilberedning av cellesuspensjon
- Vask 20 μL av fullblodet ved å sentrifugere blodet med 1 ml PBS ved 268 x g i 3 minutter. Kast supernatanten.
- Resuspender RBC i 1 ml PBS. Pipetter forsiktig for å blande. Vask RBC i 3 minutter ved 268 x g og kast supernatanten.
- Trekk ut 5 mikroliter RBC-pellet ved hjelp av en 10 mikropipettespiss og dispenser helt ut i 1 ml av DEP-mediet. Vask cellene ved å sentrifugere ved 268 x g i 3 minutter.
- Kast supernatanten og resuspender RBCene i 1 ml DEP-medium. Pipetter forsiktig for å blande.
- Vask RBC i 3 minutter ved 268 x g og kast supernatanten. Pipett 2 μL RBC-pellet til 500 μL DEP-medium. Cellesuspensjonen fremstilles nå med en konsentrasjon innenfor et område på 62 - 104 celler / μL12, som kan bekreftes ved hjelp av et standard celletellingslysbilde.
5. Elektrodeformasjonsoppsett og utmattingstesting
- Plasser den mikrofluidiske enheten i den nederste delen av testarmaturen. Juster den øverste delen av armaturen til enheten og monter de to delene ved hjelp av to sett med nylonskruer og muttere (figur 4).
- Plasser testarmaturen på mikroskopstadiet. Finn ett ønsket sett med elektroder under mikroskopet.
- Koble det tilsvarende paret elektrodeledninger som passer til det lokaliserte elektrodesettet til utgangsterminalen til funksjonsgeneratoren (figur 4).
- Fjern 5 μL av DEP-mediet fra 3 mm-innløpet til den mikrofluidiske kanalen. Legg sakte 5 μl av cellesuspensjonen inn i innløpet ved hjelp av en 10 μL pipettespiss.
- La cellene slå seg ned i 1 min. Legg om nødvendig til et ekstra DEP-medium på innløpet for å skyve celler inn i kanalen.
- Vær oppmerksom på kanalen under 20x forstørrelse. Bruk et båndpassfilter på 414/46 nm for å forbedre kontrasten til bildebehandlingen.
- Trykk på sinusknappen og definer en sinusbølge med en 2 V RMS-amplitude ved 3 MHz-frekvensen. Trykk på Mod-knappen for å aktivere modulering. Endre bølgemodus til ASK ved å trykke på Type-alternativet.
- Sett modulasjonsfrekvensen til 250 mHz, noe som tilsvarer en 4 s laste- og losseperiode (figur 5A). Slå PÅ utgangen fra funksjonsgeneratoren.
- Ta opp en 1 min video hvert 10. minutt med 30 bilder per s (fps).
6. Karakterisering av RBC-deformasjon
- Ved hjelp av et videoredigeringsprogram åpner du .avi filer som er tatt opp i forrige trinn, ved å trykke Ctrl + O. Bruk tidslinjen til å velge en ramme av interesse og angi at start- og sluttrammene for valg skal være identiske ved å trykke på Hjem-tasten og deretter Slutt-tasten på tastaturet.
- Eksporter bilderammen. Velg utdataformatet som skal JPEG, og trykk OK.
- Åpne ImageJ-applikasjonen og last inn bildene som ble lagret i forrige trinn. Begynn med å angi de nødvendige målingene ved å trykke på Analyser > angi mål og sikre at avmerkingsboksene for Område, Perimeter og Tilpass-ellipse er merket av. Trykk på OK.
- Deretter konverterer du bildet til gråtoner ved å velge Bilde > Type > 8-bit.
- Konverter deretter bildet til binært ved hjelp av Image > Adjust > Thresholding. I dialogboksen Terskelverdi justerer du de to glidebryterne etter behov. Trykk på Bruk og lukk deretter dialogboksen Terskelverdi.
- Velg Analyser > verktøy > ROI Manager. I ROI Manager trykker du på avkrysningsruten merket Vis alle. Ikke lukk denne boksen.
- Velg tryllestavverktøyet (sporing), velg en aktuell celle i bildet, og trykk T på tastaturet. Den valgte cellen blir nummerert. En ny celle kan merkes på nytt. Merk alle aktuelle celler som skal måles. De aktuelle cellene er identifisert som de som er isolert fra andre celler. Antallet av disse cellene kan variere fra 50 til 200 i et enkelt synsfelt.
- Gå tilbake til ROI Manager-boksen, og trykk på Mål. Dette åpner Resultater-boksen. Søyler merket Store og Mindre er lengdene på henholdsvis de monterte ellipseaksene og mollaksene (i piksler). Velg Fil > Lagre som for å eksportere målingene som en CSV-formatert fil.
- Bruk hvilken som helst passende beregningsanalyseprogramvare, beregne kvotienten til Major og Minor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når cellesuspensjon ble lastet i den mikrofluidiske kanalen, ble det observert en relativt jevn fordeling av celler. Ved signalutgangen (f.eks. en enkel sinusbølge eller On-Keying-fase av ASK) fra funksjonsgeneratoren, genererte de tynnfilminterdigiterte elektrodene et ujevnt elektrisk felt med vekselstrøm. De suspenderte cellene reagerte spontant på denne elektriske eksitasjonen og viste en positiv DEP-oppførsel, nemlig å bevege seg mot kantene av elektroder med høyere feltstyrke. Følgelig ble cellene justert langs kantene på elektrodene og ble strukket på grunn av elektrodeformasjon. Under On-Keying-fasen strekkes RBC på grunn av elektrodeformasjon; Under Off-Keying-fasen er RBC-er avslappet (figur 5B). Opprettholdelse av cellediskrethet er viktig i denne protokollen. Ved bruk av fortynningsfaktoren som angitt i denne protokollen, var cellesuspensjon av normale RBC i området 62-104 celler/μL. Ved en konsentrasjon innenfor dette området var vi i stand til å oppnå en høy gjennomstrømning av cellemåling samtidig som akkumuleringen av celler ble minimert på grunn av den positive DEP-effekten.
Ved sporing av individuelle RBC i løpet av 1 timers utmattelsestesting observerte vi en gradvis reduksjon i cellulær deformasjon (figur 5C). Deformabilitet ble kvantifisert av forholdet mellom de store og mindre aksene til en ellipse som ble brukt til å passe de enkelte RBC-ene, ved hjelp av åpen kildekode-bildebehandlingsprogramvare (figur 6). Bilder av interesse ble åpnet i programvaren. Det var ikke nødvendig å kalibrere pikselstørrelsen i lengdeskala for deformerbarhetsmålingen. Numeriske data kan analyseres og plottes videre ved hjelp av programvare.
I denne protokollen ble deformasjonsdata for RBC samlet inn i tidsintervallet på 10 minutter i løpet av 1 time syklisk mekanisk belastning ved bruk av 250 mHz ASK for å modulere 2 VRMS-3 MHz sinusbølgen. En gradvis reduksjon i celledeformabilitet ble observert. Det totale deformabilitetstapet for RBC under denne tretthetstesttilstanden ble funnet å være 18% (figur 7).
Figur 1: Mikrofluidisk enhet for elektrodeformasjon. (A) Skjematisk fremstilling av den mikrofluidiske kanal med hull i biopsi på 1,5 mm og 3 mm for henholdsvis prøveuttak og innløp. (B) Eksploderende visning av testarmaturenheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Drift av konduktivitetsmåleren. En konduktivitetsmåler ble brukt til å verifisere konduktiviteten til DEP-mediet til å være 0,04 S/m. Sensorprobene ved foten av måleren er nedsenket i prøven for å oppnå en avlesning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Osmometerdrift. Et osmometer ble brukt til å verifisere den osmotiske konsentrasjonen av DEP-mediet. Trinn 1 - Fest en prøvespiss på plass på prøvetakeren og last inn 20 μL prøve. Trinn 2 - Hvil prøvetakeren i driftsholderen og under holderen. Trinn 3 - Skyv hele driftsholderen ned til den når et positivt stopp. Trinn 4 - Instrumentet kjører testen i ca. 1 min og viser resultatet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tilkobling til funksjonsgenerator. Bilde av det eksperimentelle oppsettet for utmattingstesting, inkludert testarmaturenheten og en funksjonsgenerator. ITO-elektrodeputer er koblet til funksjonsgeneratoren med BNC-til-alligatorklipskabel via ledningene som er forhåndsloddet inn i Pogo-pinnekoppene presset inn i toppenheten på testarmaturen. Den mikrofluidiske enheten med to uavhengige parallelle kanaler sitter på bunnenheten til testarmaturen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Cellens respons på av-taster. (A) On-off keying modulert sinusbølge for 1 time utmattelsestesting: sinusbølge på 2 V RMS-amplitude ved 3 MHz for elektrodeformasjonsvirkning, modulasjonsfrekvens på 250 mHz som resulterer i 2 s strekking og 2 s avslapning. (B) Under On-Keying-fasen strekkes RBC på grunn av elektrodeformasjon; Under Off-Keying-fasen er RBC-er avslappet. (C) Elektrodeformasjon av en representativ celle viser gradvis nedbrytning i membrandeformasjon i løpet av 1 time med syklisk strekking. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Karakterisering av RBC-deformabilitet ved bruk av ImageJ. Trinn 1 - Importer bildet til bilderedigeringsprogramvare og konverter det til 8-biters gråtoner. Trinn 2 - Juster terskelen for å konvertere bilder til binær. Trinn 3 - Velg celler med tryllestaven (sporing) verktøyet og administrere valg med avkastningen manager. Trinn 4 - Velg cellene for å få målinger for større og mindre akser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Reduksjon i celledeformabilitet. Gradvis nedbrytning i RBC-deformabilitet på grunn av syklisk elektrodeformasjon. Feillinjen viser standardavviket (n = 69). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ASK OOK-modulasjonen av en DEP-kraftinduserende sinusbølge kan brukes til å teste den mekaniske utmattingen av RBC over lang tid. I denne protokollen begrenset vi in vitro utmattelsestesting til 1 time for å forhindre potensielle negative metabolske effekter på celledeformabiliteten. Omfattende utmattingstestforhold kan programmeres ved hjelp av ASK-modulert elektrodeformasjonsteknikk. Parametere som lastefrekvens, amplitude og lasthastighet kan alle programmeres. Lastfrekvensen kan programmeres til varierende verdier for å bestemme avhengigheten av tretthet på lastfrekvens, samt forskjeller mellom syklisk belastning og statisk belastning13.
Strekkstørrelsen kan enkelt justeres ved å bruke et annet spenningsnivå for små eller store deformasjoner. Ved bruk av høyspenningsnivåer for å inkludere stor deformasjon, bemerkes det imidlertid at elektrodeformasjon vil resultere i flammelignende formede RBC (figur 6, trinn 3). Dette kan føre til feil når du tilpasser cellefigurer med ellipser, som kutter av de spisse kantene av celler. Under denne omstendigheten, spesielt når du bruker elektrodeformasjonen til å trekke ut membranskjærviskoelastisitetsparametere, kan to strategier brukes: (i) bruk av en beregningsmodell av sanne celleformer vil gi mer nøyaktige resultater enn den enkle analytiske elliptiske formmodellen; (ii) bruke et mindre spenningsnivå for å strekke celler slik at celleformene kan være godt utstyrt med ellipser.
I gjeldende protokoll var middels konduktivitet 0,04 S/m, som kan justeres etter behov. Siden elektrodeformasjonsindusert cellulær strekking er relatert til de reelle verdiene til den komplekse Clausius Mossotti-faktoren, kan sinusbølgefrekvensen være forskjellig fra den valgte 3 MHz. Nøkkelen er å minimere spenningen for å indusere elektrodeformasjon samtidig som den opprettholder en ubetydelig Joule-oppvarmingseffekt. En optimal elektrisk eksitasjon kan bestemmes ved hjelp av DEP-teori eller ved hjelp av beregningsverktøy for dielektrisk modellering av celler, for eksempel Min DEP11.
Det skal bemerkes at celle immobilisering ikke er nødvendig i denne protokollen, da celler som gjennomgår elektrodeformasjon, iboende viser positiv DEP, som beveger celler til elektrodekantene spontant. Dette gjør at vi kan utføre testing på cellesuspensjoner og immobilisere alle celler som interagerer med elektroden og samtidig strekker cellene. Når testingen er ferdig, kan cellene enkelt fjernes fra enheten ved å skylle kanalen med mediet. Karakteristikken for den nåværende protokollen som gjør at den fungerer godt med suspenderende celler, kan begrense dens anvendelse for å teste adherente celler. Imidlertid kan vi løsne adherente celler fra substratet ved hjelp av kjemikalier som etylendiamintetraeddiksyre. Siden testingen kan utformes for å fullføres på relativt kort tid, fra minutter til 1 time, har vi nok tid til å utføre mekanisk utmattingstesting før cellene anker og sprerseg 14.
I den nåværende protokollen ble det brukt en kommersielt tilgjengelig ITO-brikke med 100 μm bånd interdigiterte elektroder. Interdigitated elektrode design er fordelaktig for å måle flere celler om gangen for lengde-til-arealforholdet, da cellene strekkes på kantene av elektroder. Gjennomstrømningen av målingen er også avhengig av observasjonsfeltet, hvor cellestørrelse og deformabilitet setter begrensninger på elektrodens minste gap. Båndbredden til elektrodene kan reduseres ytterligere for å øke antall observasjonsceller for høyere gjennomstrømning. Elektrodematerialene kan være andre metaller, for eksempel titan eller gull; Imidlertid kan gjennomsiktigheten av elektrodematerialene være et bedre valg som en del av cellemembraner kan blokkeres av de ikke-gjennomsiktige elektrodene. Testingen kan fortsatt utføres hvis en relevant matematisk formmodell av cellen, for eksempel en ellipsoid13, kan brukes under bildebehandling.
Teoretisk sett kan denne elektrodeformasjonen og ASK-modulerte elektrodeformasjonsteknikker fungere på andre celletyper, gitt de rette forholdene, for eksempel middels ledningsevne og elektriske eksitasjoner. En begrensning er hvor mye forlengelse vi kan observere. RBC er en god cellemodell for sin store deformabilitet og sirkulerende natur. Den nåværende protokollen har blitt brukt til å studere menneskelige RBC i både helse og sykdom og er lett utstyrt med et gassmikromiljø for å studere hypoksisk tretthet13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen er finansiert av NSF / CMMI mekanobiologi av hemoglobinbaserte kunstige oksygenbærere (# 1941655) og NSF / CMMI dynamisk og utmattelsesanalyse av friske og syke røde blodlegemer (# 1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M.
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
