本文介绍了一种采用振幅调制电变形方法对人红细胞进行机械疲劳测试的实验方案。该通用方法可用于测量悬浮状态下生物细胞在周期性形变过程中形态学和生物力学特性的系统性变化。
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本文内容
摘要
摘要
红细胞（RBC）以其显著的变形能力而著称。在通过微循环时，它们会反复经历显著的形变。生理老化红细胞的变形能力会降低。现有的测量细胞变形能力的技术难以用于测量疲劳，即细胞膜在循环载荷作用下逐渐发生的退化。本文提出一种利用基于幅移键控（ASK）调制的电致变形技术，在微流控通道中评估红细胞在循环剪切应力下机械退化的实验方案。简言之，通过信号发生器向微流控通道内的叉指电极施加射频范围内的低电压交流电，使悬浮的红细胞响应电场并表现出正向介电泳（DEP）效应，从而被驱动至电极边缘。随后，由于作用于细胞两半部分的电力，细胞被拉伸，产生单轴拉伸，即电致变形。通过调节激励波形的幅值，可方便地调控剪切应力水平及相应的形变程度，从而实现对红细胞在小形变和大形变条件下非线性变形能力的高通量定量分析。采用ASK策略对激励波形进行调制，可实现具有可编程加载速率和频率的循环电致变形，为红细胞疲劳特性的表征提供了便捷手段。本研究建立的ASK调制电致变形方法首次实现了对红细胞在循环载荷下疲劳效应的直接测量。该方法可作为通用生物力学测试工具，用于分析其他细胞类型及疾病状态下细胞的变形能力与疲劳特性，并可与调控细胞微环境（如氧张力及生物化学信号）的策略相结合。
引言
红细胞（RBC）是人体中最可变形的细胞1。其变形能力与其携氧功能直接相关。红细胞变形能力降低已被发现与多种红细胞疾病的发病机制相关2。变形能力的测量有助于我们更好地理解与红细胞相关的疾病3。正常红细胞的寿命可在70至140天之间变化4。因此，测量其变形能力如何随着衰老过程而下降非常重要，例如，由于循环剪切应力导致的疲劳行为3。
高通量测量红细胞（RBC）变形能力具有挑战性，因为施加在单个细胞上的力处于皮牛顿量级（~10-12 N）。在过去十年中，已开发出多种技术用于测量细胞变形能力5。在单细胞水平上对红细胞进行变形测量可通过微管吸吮法和光镊技术实现，而群体分析则采用渗透梯度变形指数测定法（ektacytometry）。变形指数测定分析可提供大量数据，有助于诊断血液系统疾病6,7。红细胞的变形能力也可通过胶体探针原子力显微镜结合粘弹性理论进行分析。该方法通过计算分析，综合考虑时间依赖性和稳态响应，估算红细胞的弹性模量。单个红细胞的变形能力还可利用单细胞微腔阵....
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方案
去标识化的人全血通过商业途径获得。涉及血液样本的操作在生物安全二级实验室中进行，并遵循佛罗里达大西洋大学机构生物安全委员会批准的实验方案。
1. 微流控装置的制备
- 将用于微流控通道设计的 SU-8 母版硅片用胶带固定在 14 cm 塑料培养皿内侧，并用 N2 气体清洁。
- 在纸杯中称取 60 g 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底和 6 g PDMS 固化剂，用木刮刀混合两组分，直至混合物呈乳白色。
- 将 PDMS 混合物倒入含有硅片的塑料培养皿中。将培养皿放入带有三通旋塞的真空干燥器中，旋转旋塞阀门使真空与干燥器腔体连通，以去除 PDMS 中的气泡。
- 通过调节旋塞阀门，使干燥器腔体与外界环境连通，约每 5 分钟重新引入一次空气。重复此过程，直至通道结构中的所有气泡均被去除。
- 将培养皿置于 70 ˚C 烤箱中加热 4 小时。时间结束后取出培养皿，使其冷却至室温，然后放置在切割垫上。
- 使用手术刀切下硅片上方的 PDMS 部分。将切下的 PDMS 夹在两层实验室包裹膜之间。微通道凹陷与半透明膜之间形成的间隙有助于识别微流控通道的位置及其相应的进样口和出样口。
- 使用剃刀片从大块 PDMS 中切出单个通道。使用与两种尺寸相对应的活检打孔器，分别打出 3 mm 的进样孔和 1.5 mm 的出样孔（....
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结果
当将细胞悬液注入微流控通道时，可观察到细胞分布相对均匀。在函数发生器输出信号（例如简单的正弦波或ASK的键控开启相位）作用下，薄膜叉指电极产生非均匀的交变电场。悬浮细胞自发响应此电刺激，表现出正向介电泳（DEP）行为，即向电场强度更高的电极边缘移动。因此，细胞沿电极边缘排列，并因电致变形而被拉伸。在键控开启相位下，红细胞因电致变形而被拉伸；在键控关闭相位下，红细胞则处于松弛状态（图5B）。在本实验方案中，保持细胞的离散性至关重要。按照本方案所述的稀释倍数，正常红细胞悬液的浓度范围为1 - 6.2 × 104 个细胞/µL。在此浓度范围内，我们能够在实现高通量细胞测量的同时，最大限度地减少因正向介电泳效应导致的细胞聚集。
在1小时疲劳测试期间追踪单个红细胞时，我们观察到细胞变形程度逐渐降低（图5C）。通过使用开源成像软件，将单个红细胞拟合为椭圆，并以椭圆长轴与短轴的比值来量化其变形能力（图6
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讨论
通过使用ASK OOK调制的介电泳力诱导正弦波，可对红细胞（RBCs）进行长时间的机械疲劳测试。在本实验方案中，我们将体外疲劳测试时间限制为1小时，以避免可能对细胞变形能力产生不利的代谢影响。可利用ASK调制的电极变形技术编程设定全面的疲劳测试条件。加载频率、振幅和加载速率等参数均可进行编程设置。可通过将加载频率设定为不同数值，来确定疲劳对加载频率的依赖性，以及循环加载与静态加载之间的差异13。
通过使用不同的电压水平，可以轻松调节拉伸程度，以适应小形变或大形变。然而，当采用高电压水平引起大形变时，需注意电致形变会导致红细胞呈现火焰状（图6，步骤3）。此时，若使用椭圆模型拟合细胞形状，会截去细胞的尖端部分，从而引入误差。在此情况下，特别是在利用电致形变提取细胞膜剪切黏弹性参数时，可采用两种策略：（i）使用真实细胞形状的计算模型，相比简单的解析椭圆模型可提供更准确的结果；（ii）采用较低的电压水平拉伸细胞，使细胞形状能够被椭圆良好拟合。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国家科学基金会/机械与材料创新部资助，项目包括基于血红蛋白的人工氧载体的力学生物学（#1941655）以及健康与病变红细胞的动态与疲劳分析（#1635312）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 天平 | ViBRA | HT-224R | |
| 带通滤光片 | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD 带Luer-Lok™接头的一次性注射器，1 mL | 费舍科学（Fisher Scientific） | 14-823-30 | |
| 带推杆系统的活检穿孔器，1.5 mm | 费舍科学（Fisher Scientific） | 12-460-403 | |
| 带推杆系统的活检穿孔器，3 mm | 费舍科学（Fisher Scientific） | 12-460-407 | 直径1.5 mm和3 mm |
| 钝头针，23号 | BSTEAN | X001308N97 | |
| 牛血清白蛋白 | RMBIO | BSA-BSH | |
| 离心机 | SCILOGEX | 911015119999 | |
| 50 mL锥形管 | 费舍科学（Fisher Scientific） | 05-539-13 | |
| 葡萄糖 | 费舍科学（Fisher Scientific） | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC低电导率仪 | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf 带 snap-cap 的微量离心管 | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | 绘图 | |
| 函数发生器 | SIGLENT | SDG830 | |
| 玻璃/ITO电极基底 | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院（NIH） | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| 倒置显微镜 | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| 实验室烘箱 | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | 数字型号 |
| Matlab | MathWorks | 绘图 | |
| 微渗透压计 - 型号 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm实验室封口膜 | 费舍科学（Fisher Scientific） | 13-374-12 | |
| 培养皿 | FALCON | SKU=351006 | ICSI/活检皿 50*9 mm |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | LONZA | 04-479Q | |
| 等离子清洗机 | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD软件 | |
| 蔗糖 | 费舍科学（Fisher Scientific） | 50-188-2419 | |
| 真空干燥器 | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| 木制刮勺 | 费舍科学（Fisher Scientific） | NC0304136 | 木质压舌板 NS 6" |
参考文献
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al.
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重印与许可
