Summary
यहां प्रस्तुत एक आयाम-मॉड्यूलेटेड इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन दृष्टिकोण का उपयोग करके मानव लाल रक्त कोशिकाओं के मामले में यांत्रिक थकान परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल है। इस सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग चक्रीय विरूपण से निलंबन में जैविक कोशिकाओं की रूपात्मक और बायोमैकेनिकल विशेषताओं में व्यवस्थित परिवर्तनों को मापने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) को उनकी उल्लेखनीय विकृति के लिए जाना जाता है। माइक्रोसर्कुलेशन से गुजरते समय वे बार-बार काफी विकृति से गुजरते हैं। शारीरिक रूप से वृद्ध आरबीसी में कम विकृति देखी जाती है। सेल विकृति को मापने के लिए मौजूदा तकनीकों का उपयोग आसानी से थकान को मापने के लिए नहीं किया जा सकता है, चक्रीय भार के कारण कोशिका झिल्ली में क्रमिक गिरावट। हम एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में आयाम शिफ्ट कीइंग (एएसके) मॉड्यूलेशन-आधारित इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन का उपयोग करके चक्रीय कतरनी तनाव से आरबीसी में यांत्रिक गिरावट का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। संक्षेप में, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड सिग्नल जनरेटर का उपयोग करके रेडियो आवृत्तियों पर कम वोल्टेज वैकल्पिक प्रवाह के साथ उत्तेजित होते हैं। निलंबन में आरबीसी विद्युत क्षेत्र का जवाब देते हैं और सकारात्मक वैद्युतकणसंचलन (डीईपी) प्रदर्शित करते हैं, जो कोशिकाओं को इलेक्ट्रोड किनारों पर ले जाता है। कोशिकाओं को तब दो सेल हिस्सों पर लगाए गए विद्युत बलों के कारण फैलाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एकअक्षीय खिंचाव होता है, जिसे इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन के रूप में जाना जाता है। कतरनी तनाव का स्तर और परिणामी विरूपण को उत्तेजना तरंग के आयाम को बदलकर आसानी से समायोजित किया जा सकता है। यह उच्च थ्रूपुट पर छोटे और बड़े विरूपण के जवाब में आरबीसी की गैर-रेखीय विकृति की मात्रा का परिमाणीकरण करने में सक्षम बनाता है। एएसके रणनीति के साथ उत्तेजना तरंग को संशोधित करना प्रोग्राम करने योग्य लोडिंग दरों और आवृत्तियों के साथ चक्रीय इलेक्ट्रोडविरूपण को प्रेरित करता है। यह आरबीसी थकान के लक्षण वर्णन के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है। हमारा एएसके-मॉड्यूलेटेड इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन दृष्टिकोण पहली बार, चक्रीय भार से आरबीसी थकान का प्रत्यक्ष माप सक्षम करता है। इसका उपयोग सामान्य बायोमैकेनिकल परीक्षण के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है, अन्य सेल प्रकारों और रोगग्रस्त स्थितियों में सेल विकृति और थकान के विश्लेषण के लिए, और कोशिकाओं के माइक्रोएन्वायरमेंट को नियंत्रित करने के लिए रणनीतियों के साथ भी जोड़ा जा सकता है, जैसे ऑक्सीजन तनाव और जैविक और रासायनिक संकेत।
Introduction
लाल रक्त कोशिकाएं (आरबीसी)मानव शरीर में सबसे विकृत कोशिकाएं हैं। उनकी विकृति सीधे उनकी ऑक्सीजन-वहन कार्यक्षमता से संबंधित है। आरबीसी में कम विकृति को कई आरबीसी विकारों के रोगजनन के साथ सहसंबंधित पाया गयाहै। विकृति माप ने हमें आरबीसी से संबंधित बीमारियों की बेहतर समझ के लिए प्रेरित कियाहै। आरबीसी का सामान्य जीवनकाल 70 से 140 दिन 4 तक भिन्न हो सकताहै। इसलिए, यह मापना महत्वपूर्ण है कि उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के साथ उनकी विकृति कैसे कम हो जाती है, उदाहरण के लिए, चक्रीय कतरनी तनाव के कारण उनका थकान व्यवहार3।
उच्च थ्रूपुट पर आरबीसी विकृति को मापना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि पिकोनेवटन स्केल बल (~ 10-12 एन) जो व्यक्तिगत कोशिकाओं पर लागू होते हैं। पिछले एक दशक में, सेल विकृतिको मापने के लिए कई प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं। एकल-कोशिका स्तर पर आरबीसी के विरूपण माप पिपेट एस्पिरेशन और ऑप्टिकल ट्वीज़र्स द्वारा किए जा सकते हैं, जबकि थोक विश्लेषण आसमाटिक ग्रेडिएंट एकतासाइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। एकतासाइटोमेट्री विश्लेषण डेटा की एक बहुतायत प्रदान करता है, जो रक्त विकारों 6,7 का निदान करने का अवसर प्रदान करता है। कोलाइड प्रोब परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा विस्कोस्टिक सिद्धांत का उपयोग करके आरबीसी की विकृति का भी विश्लेषण किया जा सकता है। इस विधि में, समय-निर्भर और स्थिर-राज्य प्रतिक्रियाओं दोनों पर विचार करते हुए, आरबीसी के लोचदार मापांक का अनुमान लगाने के लिए कम्प्यूटेशनल विश्लेषण लागू किया जाता है। एकल-सेल माइक्रोचैंबर सरणी विधि का उपयोग करके व्यक्तिगत आरबीसी की विकृति को मापा जा सकता है। यह विधि झिल्ली और साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट मार्करों के माध्यम से प्रत्येक कोशिका का विश्लेषण करती है ताकि आरबीसी विकृति और हेमेटोलॉजिकविकारों का पता लगाने के लिए जटिल आरबीसी आबादी में सेलुलर विशेषताओं के वितरण के लिए जानकारी प्रदान की जा सके।
इंजीनियर सामग्री और बायोमैटेरियल्स के गुणों के क्षरण में थकान एक महत्वपूर्ण कारक है। थकान परीक्षण चक्रीय लोडिंग के अधीन संरचना की अखंडता और दीर्घायु का मात्रात्मक विश्लेषण सक्षम बनाता है। जैविक कोशिकाओं में थकान का विश्लेषण लंबे समय से कोशिका झिल्ली में चक्रीय विरूपण के कार्यान्वयन के लिए एक सामान्य, आसानी से लागू, उच्च थ्रूपुट और मात्रात्मक विधि की कमी से बाधित हुआ है। यह एक माइक्रोफ्लुइडिक सेटिंग में लागू विद्युत संकेत मॉड्यूलेशन और इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन तकनीकों के उपयोग के साथ संभव है। डिजिटल मॉड्यूलेशन के रूप में आयाम शिफ्ट कीइंग (एएसके) तकनीक इस लेख में ऑन-ऑफ कीइंग (ओओके) मॉड्यूलेशन के माध्यम से लागू की जाती है। कीइंग की अवधारणा चैनल पर डिजिटल संकेतों के प्रसारण को संदर्भित करती है, जिसे फ़ंक्शन9 के लिए साइन वेव कैरियर सिग्नल की आवश्यकता होती है। चालू और बंद समय समान सेट किया जा सकता है। ऑन-कीइंग के तहत, आरबीसी एक विकृत स्थिति में प्रवेश करते हैं, जबकि गैर-समान विद्युत क्षेत्र द्वारा बनाए गए बाहरी इलेक्ट्रोडविरूपण बल (एफडेप) 10 के संपर्क में आते हैं। ऑफ-कीइंग के तहत, आरबीसी अपनी आराम की स्थिति में हैं। हम आरबीसी की थकान का निरीक्षण करते हैं, अर्थात् बढ़ते लोडिंग चक्रों के साथ खिंचाव करने की उनकी क्षमता में प्रगतिशील गिरावट। आरबीसी में थकान से प्रेरित विकृति हानि रक्त परिसंचरण के दौरान संचित झिल्ली क्षति में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, जिससे हमें सेल थकान और रोग की स्थिति के बीच संबंधों की जांच करने में सक्षम बनाया जा सकता है।
यहां हम चरण-दर-चरण प्रक्रियाएं प्रदान करते हैं कि एएसके-मॉड्यूलेटेड इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन के माध्यम से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में आरबीसी के थकान परीक्षण को कैसे लागू किया जाता है और आरबीसी की यांत्रिक विकृति में क्रमिक गिरावट के लक्षण वर्णन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस, मैकेनिकल लोडिंग और माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग जैसे सिस्टम सेटिंग्स।
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Protocol
अज्ञात मानव पूरे रक्त को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था। फ्लोरिडा अटलांटिक विश्वविद्यालय में संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में रक्त के नमूनों से जुड़े काम किए गए थे।
1. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की तैयारी
- प्लास्टिक 14 सेमी पेट्री डिश के अंदर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल डिजाइन के लिए एसयू -8 मास्टर सिलिकॉन वेफर को टेप करें और इसे एन2 गैस से साफ करें।
- एक पेपर कप में 60 ग्राम पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) बेस और 6 ग्राम पीडीएमएस इलाज एजेंट का वजन करें। लकड़ी के स्पैटुला का उपयोग करके दो भागों को मिलाएं जब तक कि मिश्रण एक बादल सफेद रंग का न हो जाए।
- सिलिकॉन वेफर युक्त प्लास्टिक पेट्री डिश में पीडीएमएस मिश्रण डालें। पेट्री डिश को 3-तरफा स्टॉपकॉक के साथ वैक्यूम डेसिकेटर में रखें। पीडीएमएस से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए वैक्यूम को डेसिकेटर कक्ष से जोड़ने के लिए स्टॉपकॉक के वाल्व को चालू करें।
- लगभग 5 मिनट के चक्र ों में डेसिकेटर कक्ष को परिवेश से जोड़ने के लिए स्टॉपकॉक वाल्व को समायोजित करके डेसिकेटर कक्ष में हवा को फिर से पेश करें। तब तक दोहराएं जब तक कि चैनलों की विशेषताओं से सभी हवा के बुलबुले हटा न दिए जाएं।
- पेट्री डिश को 4 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन के अंदर रखें। एक बार समय बीत जाने के बाद, पेट्री डिश को हटा दें, इसे कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें, और इसे काटने वाली चटाई पर रखें।
- स्केलपेल का उपयोग करके, सिलिकॉन वेफर के ऊपर पीडीएमएस के हिस्से को काट लें। लैब-रैपिंग फिल्म की दो शीटों के बीच कटआउट पीडीएमएस रखें। माइक्रोचैनल और अर्ध-पारदर्शी फिल्म के इंडेंट के बीच बनने वाला अंतर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के स्थान के साथ-साथ इसके संबंधित इनलेट और आउटलेट की पहचान की सुविधा प्रदान करता है।
- रेजर ब्लेड का उपयोग करके, बड़े पीडीएमएस से एक अलग चैनल काट लें। दो आकारों (चित्रा 1 ए) के लिए बायोप्सी पंच का उपयोग करके 3 मिमी इनलेट छेद और 1.5 मिमी आउटलेट छेद को पंच करें।
- होल-पंच चैनल को एक साफ ग्लास स्लाइड पर रखें, जिसमें चैनल साइड ऊपर की ओर हो। एक 20 मिमी x 15 मिमी ग्लास सब्सट्रेट रखें जिसमें पतली-फिल्म इंडियम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड होते हैं, जिसमें इलेक्ट्रोड ऊपर की ओर होते हैं।
- धीरे से पीडीएमएस और सब्सट्रेट के साथ ग्लास स्लाइड को प्लाज्मा क्लीनर में रखें। गैस वाल्व बंद करें, पंप स्विच चालू करें, और 600 - 800 mTorr की सेंसर रीडिंग प्राप्त करने के लिए 2 मिनट प्रतीक्षा करें।
- पावर स्विच चालू करें और 30 सेकंड तक प्रतीक्षा करें। आरएफ पावर नॉब को कम से उच्च में बदलें और 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- फिर, आरएफ नॉब को कम पर चालू करके, पावर स्विच को बंद करके, पंप स्विच को बंद करके और गैस वाल्व खोलकर अनुक्रम को उलट दें।
- प्लाज्मा क्लीनर के कक्ष को खोलने के तुरंत बाद, पीडीएमएस को उठाएं और घुमाएं ताकि चैनल साइड नीचे (180 डिग्री) हो। चैनल को आईटीओ सब्सट्रेट के शीर्ष पर रखें। बॉन्डिंग की प्रक्रिया शुरू हो गई है।
- चिमटी का उपयोग करके, पीडीएमएस के कोनों पर लगभग 3 सेकंड के लिए धीरे से दबाएं। चैनल पर ही दबाव डालने से बचें।
नोट: संबंध प्रक्रिया दो उपचारित सतहों के बीच शारीरिक संपर्क पर अनायास होती है। - प्राइमिंग माध्यम को 23 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज में लोड करें। सुई को सीधे इनलेट कुएं में डालकर और फिर माध्यम को जारी करके चैनल को सावधानी पूर्वक गीला करें। धीरे-धीरे काम करें। हवा के बुलबुले पेश न करें। कम से कम 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- 10 μL पिपेट टिप का उपयोग करके प्रमुख माध्यम को हटा दें। चैनल में DEP माध्यम डालकर चैनल को 3 बार DEP माध्यम से धोएं। चैनल को हर समय गीला रखें।
2. टेस्ट फिक्स्चर
नोट: परीक्षण फिक्स्चर 3 डी सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया है और इसमें एक बेस हाउसिंग यूनिट और एक शीर्ष इकाई (चित्रा 1 बी) शामिल है। फिर, यह एक 3-अक्ष सीएनसी मिलिंग मशीन का उपयोग करके निर्मित किया जाता है, जिसमें परीक्षण फिक्स्चर के लगभग ± 0.005-इंच आयाम की मानक सहिष्णुता सीमा होती है, जिसे इलेक्ट्रॉनिक कैलिपर (दिखाया नहीं गया) का उपयोग करके जांचा जाता है। इन विट्रो बायोमैकेनिकल परीक्षण के लिए फिक्स्चर की बाँझपन की आवश्यकता नहीं है।
- स्प्रिंग पिस्टन कनेक्टर के दो सेटों के सोल्डर कप सिरों में प्री-सोल्डर तार।
- स्प्रिंग पिस्टन कनेक्टर को शीर्ष इकाई में डालें और एपॉक्सी गोंद की एक बूंद जोड़कर एक स्थायी संबंध बनाएं।
3. इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन वर्किंग बफर की तैयारी
- डीईपी माध्यम तैयार करने के लिए, एक पैमाने का उपयोग करके 12.75 ग्राम सुक्रोज और 0.45 ग्राम डेक्सट्रोज का वजन करें।
- दोनों पाउडर को 150 मिलीलीटर विआयनीकृत (डीआई) पानी और 3.5 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ एक कंटेनर में घोलें।
- एक कम दूरी की चालकता परीक्षक का उपयोग करके, चालकता को मापें और सुनिश्चित करें कि यह 0.04 एस / एम है (चित्रा 2)।
नोट: एक अलग चालकता मान का उपयोग किया जा सकता है, जो परिणामी डीईपी बल11 के संकेत और परिमाण को बदल सकता है। इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन, हालांकि, एक सकारात्मक डीईपी बल की आवश्यकता होती है। - एक ऑस्मोमीटर का उपयोग करके, रक्त प्लाज्मा, 275 से 295 mOsm / kg पानी की सामान्य सीमा के भीतर परासरण ता की पुष्टि करें (चित्रा 3)। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। डीईपी माध्यम अब तैयार है।
- 15 एमएल ट्यूब में, डीईपी माध्यम के 10 एमएल में 0.5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) घोलें। अच्छी तरह मिलाएं। डिवाइस का प्रमुख माध्यम अब तैयार है।
4. सेल निलंबन की तैयारी
- 3 मिनट के लिए 268 x g पर 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ रक्त को सेंट्रीफ्यूज करके पूरे रक्त के 20 μL को धोएं। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
- पीबीएस के 1 एमएल में आरबीसी को फिर से निलंबित करें। मिश्रण करने के लिए धीरे से पिपेट। आरबीसी को 268 x g पर 3 मिनट के लिए धोएं और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
- 10 μL माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके आरबीसी गोली के 5 μL निकालें और डीईपी माध्यम के 1 एमएल में पूरी तरह से वितरित करें। 3 मिनट के लिए 268 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके कोशिकाओं को धो लें।
- सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और डीईपी माध्यम के 1 एमएल में आरबीसी को फिर से निलंबित करें। मिश्रण करने के लिए धीरे से पिपेट।
- आरबीसी को 268 x g पर 3 मिनट के लिए धोएं और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। आरबीसी गोली के पिपेट 2 μL को डीईपी माध्यम के 500 μL में बदल दें। सेल निलंबन अब 62 - 104 कोशिकाओं / μL12 की सीमा के भीतर एकाग्रता के साथ तैयार किया जाता है, जिसे मानक सेल गिनती स्लाइड का उपयोग करके पुष्टि की जा सकती है।
5. इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन सेटअप और थकान परीक्षण
- माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को परीक्षण फिक्स्चर के निचले भाग में रखें। फिक्स्चर के शीर्ष भाग को डिवाइस में संरेखित करें और नायलॉन स्क्रू और नट्स के दो सेटों का उपयोग करके दो भागों को इकट्ठा करें (चित्रा 4)।
- माइक्रोस्कोप मंच पर परीक्षण फिक्स्चर रखें। माइक्रोस्कोप के तहत इलेक्ट्रोड के एक वांछित सेट का पता लगाएं।
- इलेक्ट्रोड तारों की संबंधित जोड़ी को कनेक्ट करें जो फ़ंक्शन जनरेटर के आउटपुट टर्मिनल से स्थित इलेक्ट्रोड सेट से मेल खाते हैं (चित्रा 4)।
- माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के 3 मिमी इनलेट से डीईपी माध्यम के 5 μL निकालें। धीरे-धीरे 10 μL पिपेट टिप का उपयोग करके इनलेट में सेल निलंबन के 5 μL लोड करें।
- कोशिकाओं को 1 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें। यदि आवश्यक हो, तो कक्षों को चैनल में धकेलने के लिए इनलेट में एक अतिरिक्त डीईपी माध्यम जोड़ें।
- 20x आवर्धन के तहत चैनल का निरीक्षण करें। इमेजिंग के कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए 414/46 एनएम बैंडपास फिल्टर का उपयोग करें।
- साइन बटन दबाएं और 3 मेगाहर्ट्ज आवृत्ति पर 2 वीआरएमएस आयाम के साथ एक साइन तरंग परिभाषित करें। मॉड्यूलेशन सक्षम करने के लिए मॉड बटन दबाएं। टाइप विकल्प दबाकर वेव मोड को एएसके में बदलें।
- मॉड्यूलेशन आवृत्ति को 250 mHz पर सेट करें, जो 4 s लोडिंग-अनलोडिंग अवधि (चित्रा 5A) से मेल खाती है। फ़ंक्शन जनरेटर का आउटपुट चालू करें।
- 30 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) पर हर 10 मिनट में 1 मिनट का वीडियो रिकॉर्ड करें।
6. आरबीसी विरूपण का लक्षण वर्णन
- वीडियो संपादन अनुप्रयोग का उपयोग करके, Ctrl +O दबाकर पिछले चरण में रिकॉर्ड की गई .avi फ़ाइलें खोलें. रुचि का फ्रेम चुनने के लिए टाइमलाइन का उपयोग करें और होम कुंजी और फिर कीबोर्ड पर अंतिम कुंजी दबाकर चयन प्रारंभ और अंत फ्रेम को समान रूप से सेट करें।
- छवि फ़्रेम निर्यात करें। JPEG होने के लिए आउटपुट स्वरूप का चयन करें और OK दबाएँ.
- ImageJ अनुप्रयोग खोलें और पिछले चरण में सहेजी गई छवियों को लोड करें। विश्लेषण > सेट माप दबाकर आवश्यक माप सेट करके शुरू करें और यह सुनिश्चित करें कि क्षेत्र, परिधि और फिट एलिप्स के लिए चेक बॉक्स चेक किए गए हैं। OK दबाएँ.
- इसके बाद, छवि > टाइप > 8-बिट चुनकर छवि को ग्रेस्केल में परिवर्तित करें।
- फिर छवि का उपयोग करके छवि को बाइनरी में परिवर्तित करें > थ्रेशोल्डिंग > समायोजित करें। थ्रेशोल्ड संवाद बॉक्स में, आवश्यकतानुसार दो स्लाइडर समायोजित करें। लागू करें दबाएँ, और उसके बाद थ्रेशोल्ड संवाद बॉक्स बंद करें ।
- ROI प्रबंधक > > उपकरण का विश्लेषण करें चुनें. ROI प्रबंधक में, सभी दिखाएँ लेबल वाला चेकबॉक्स दबाएँ. इस बॉक्स को बंद न करें।
- वांड (अनुरेखण) उपकरण का चयन करें, छवि में एक लागू कक्ष का चयन करें, और कीबोर्ड पर टी दबाएं। चयनित कक्ष क्रमांकित किया जाएगा. एक नया कक्ष पुन: चयनित किया जा सकता है. मापित किए जाने वाले सभी लागू कक्षों का चयन करें. लागू कोशिकाओं को उन लोगों के रूप में पहचाना जाता है जो अन्य कोशिकाओं से अलग होते हैं। इन कोशिकाओं की संख्या एक ही क्षेत्र में 50 से 200 तक हो सकती है।
- ROI प्रबंधक बॉक्स पर लौटें और माप दबाएँ. यह परिणाम बॉक्स खोलता है। मेजर और माइनर लेबल वाले कॉलम क्रमशः फिट किए गए दीर्घवृत्त प्रमुख और छोटे अक्षों (पिक्सेल में) की लंबाई हैं। माप को CSV स्वरूपित फ़ाइल के रूप में निर्यात करने के लिए फ़ाइल > इस रूप में सहेजें चुनें.
- किसी भी उपयुक्त कम्प्यूटेशनल विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, मेजर और माइनर के भागफल की गणना करें।
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Representative Results
जब सेल निलंबन को माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में लोड किया गया था, तो कोशिकाओं का अपेक्षाकृत समान वितरण देखा गया था। फ़ंक्शन जनरेटर से सिग्नल आउटपुट (जैसे, एएसके का एक साधारण साइन वेव या ऑन-कीइंग चरण) पर, पतली-फिल्म इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड ने एक गैर-समान वैकल्पिक वर्तमान विद्युत क्षेत्र उत्पन्न किया। निलंबित कोशिकाओं ने अनायास इस विद्युत उत्तेजना का जवाब दिया और एक सकारात्मक डीईपी व्यवहार का प्रदर्शन किया, अर्थात् उच्च क्षेत्र शक्ति वाले इलेक्ट्रोड के किनारों की ओर बढ़ना। नतीजतन, कोशिकाओं को इलेक्ट्रोड के किनारों के साथ संरेखित किया गया था और इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन के कारण फैलाया गया था। ऑन-कीइंग चरण के तहत, इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन के कारण आरबीसी को बढ़ाया जाता है; ऑफ-कीइंग चरण के तहत, आरबीसी को शिथिल किया जाता है (चित्रा 5 बी)। इस प्रोटोकॉल में सेल असततता बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में बताए गए कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग करते हुए, सामान्य आरबीसी का सेल निलंबन 62 - 104 कोशिकाओं / μL की सीमा में था। इस सीमा के भीतर एक एकाग्रता पर, हम सकारात्मक डीईपी प्रभाव के कारण कोशिकाओं के संचय को कम करते हुए सेल माप का एक उच्च थ्रूपुट प्राप्त करने में सक्षम थे।
1 घंटे की थकान परीक्षण के दौरान अलग-अलग आरबीसी को ट्रैक करते समय, हमने सेलुलर विरूपण (चित्रा 5 सी) में क्रमिक कमी देखी। ओपन-सोर्स इमेजिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 6) का उपयोग करके व्यक्तिगत आरबीसी को फिट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दीर्घवृत्त के प्रमुख और मामूली अक्षों के अनुपात से विकृति की मात्रा निर्धारित की गई थी। सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में रुचि की छवियां खोली गईं। विकृति माप के लिए पिक्सेल आकार को लंबाई पैमाने में कैलिब्रेट करना आवश्यक नहीं था। संख्यात्मक डेटा को सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आगे विश्लेषण और प्लॉट किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, आरबीसी के विरूपण डेटा को 250 मेगाहर्ट्ज एएसके का उपयोग करके चक्रीय यांत्रिक लोडिंग के 1 घंटे के दौरान 10 मिनट के समय अंतराल में एकत्र किया गया था ताकि 2 वीआरएमएस -3 मेगाहर्ट्ज साइन तरंग को संशोधित किया जा सके। कोशिका विकृति में क्रमिक कमी देखी गई। इस थकान परीक्षण स्थिति के तहत आरबीसी के लिए कुल विकृति हानि 18% पाई गई (चित्रा 7)।
चित्रा 1: इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस। (ए) नमूना आउटलेट और इनलेट के लिए क्रमशः 1.5 मिमी और 3 मिमी के बायोप्सी छिद्र के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल का योजनाबद्ध। (बी) टेस्ट फिक्स्चर असेंबली का विस्फोटक दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: चालकता मीटर ऑपरेशन। डीईपी माध्यम की चालकता को सत्यापित करने के लिए एक चालकता मीटर का उपयोग 0.04 एस / एम किया गया था। मीटर के आधार पर सेंसिंग जांच को रीडिंग प्राप्त करने के लिए नमूने में डुबोया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: ऑस्मोमीटर ऑपरेशन। डीईपी माध्यम की आसमाटिक एकाग्रता को सत्यापित करने के लिए एक ऑस्मोमीटर का उपयोग किया गया था। चरण 1 - नमूना पर जगह में एक नमूना टिप स्नैप करें और नमूना के 20 μL लोड करें। चरण 2 - नमूने को ऑपरेटिंग क्रैडल के भीतर और क्रैडल टॉप के नीचे आराम दें। चरण 3 - पूरे ऑपरेटिंग क्रैडल को नीचे धकेलें जब तक कि यह एक सकारात्मक स्टॉप तक न पहुंच जाए। चरण 4 - उपकरण लगभग 1 मिनट के लिए परीक्षण चलाता है और परिणाम प्रदर्शित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: फ़ंक्शन जनरेटर कनेक्टिविटी। थकान परीक्षण के लिए प्रयोगात्मक सेटअप की तस्वीर, जिसमें परीक्षण फिक्स्चर असेंबली और एक फ़ंक्शन जनरेटर शामिल है। आईटीओ इलेक्ट्रोड पैड को बीएनसी-टू-एलिगेटर क्लिप केबल द्वारा फ़ंक्शन जनरेटर से जोड़ा जाता है, जो परीक्षण फिक्स्चर की शीर्ष इकाई में दबाए गए पोगो पिन कप में पहले से सोल्ड किए गए तारों के माध्यम से होता है। दो स्वतंत्र समानांतर चैनलों के साथ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस परीक्षण फिक्स्चर की निचली इकाई पर बैठता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: ऑन-ऑफ कीपिंग के लिए सेल की प्रतिक्रिया। (ए) 1 घंटे थकान परीक्षण के लिए ऑन-ऑफ कीइंग मॉड्यूलेटेड साइन वेव: इलेक्ट्रोविरूपण क्रिया के लिए 3 मेगाहर्ट्ज पर 2 वीआरएमएस आयाम की साइन वेव, 250 मेगाहर्ट्ज की मॉड्यूलेशन आवृत्ति जिसके परिणामस्वरूप 2 एस स्ट्रेचिंग और 2 एस विश्राम होता है। (बी) ऑन-कीइंग चरण के तहत, इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन के कारण आरबीसी को बढ़ाया जाता है; ऑफ-कीइंग चरण के तहत, आरबीसी को शिथिल किया जाता है। (सी) एक प्रतिनिधि सेल का इलेक्ट्रोविरूपण चक्रीय खिंचाव के 1 घंटे के दौरान झिल्ली विरूपण में क्रमिक गिरावट दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: इमेजजे का उपयोग करके आरबीसी विकृति का लक्षण वर्णन। चरण 1 - छवि को छवि संपादन सॉफ्टवेयर में आयात करें और इसे 8-बिट ग्रेस्केल में परिवर्तित करें। चरण 2 - छवियों को बाइनरी में बदलने के लिए दहलीज समायोजित करें। चरण 3 - छड़ी (अनुरेखण) उपकरण के साथ कक्षों का चयन करें और आरओआई प्रबंधक के साथ चयन प्रबंधित करें। चरण 4 - प्रमुख और छोटे अक्षों के लिए माप प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं का चयन करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: सेल विकृति में कमी। चक्रीय इलेक्ट्रोडविरूपण के कारण आरबीसी विकृति में क्रमिक गिरावट। त्रुटि पट्टी मानक विचलन (n = 69) दिखाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
डीईपी बल-उत्प्रेरण साइन तरंग के एएसके ओओके मॉड्यूलेशन का उपयोग लंबे समय तक आरबीसी की यांत्रिक थकान का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने सेल विकृति पर संभावित प्रतिकूल चयापचय प्रभावों को रोकने के लिए इन विट्रो थकान परीक्षण को 1 घंटे तक सीमित कर दिया। एएसके-मॉड्यूलेटेड इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन तकनीक का उपयोग करके व्यापक थकान परीक्षण स्थितियों को प्रोग्राम किया जा सकता है। लोडिंग आवृत्ति, आयाम और लोडिंग दर जैसे पैरामीटर सभी प्रोग्राम किए जा सकते हैं। लोडिंग आवृत्ति पर थकान की निर्भरता के साथ-साथ चक्रीय लोडिंग और स्थैतिक लोडिंग13 के बीच अंतर निर्धारित करने के लिए लोडिंग आवृत्ति को अलग-अलग मूल्यों पर प्रोग्राम किया जा सकता है।
छोटे या बड़े विरूपण के लिए एक अलग वोल्टेज स्तर का उपयोग करके स्ट्रेचिंग परिमाण को आसानी से समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, बड़े विरूपण को शामिल करने के लिए उच्च वोल्टेज स्तरों का उपयोग करते समय, यह ध्यान दिया जाता है कि इलेक्ट्रोडविरूपण के परिणामस्वरूप लौ जैसे आकार के आरबीसी होंगे (चित्रा 6, चरण 3)। यह दीर्घवृत्त के साथ सेल आकृतियों को फिट करते समय त्रुटियों का परिचय दे सकता है, जो कोशिकाओं के नुकीले किनारों को काट देता है। इस परिस्थिति में, विशेष रूप से जब झिल्ली कतरनी विस्कोस्टिकिटी मापदंडों को निकालने के लिए इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन का उपयोग किया जाता है, तो दो रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है: (i) सच्चे सेल आकृतियों के कम्प्यूटेशनल मॉडल का उपयोग सरल विश्लेषणात्मक अण्डाकार आकार मॉडल की तुलना में अधिक सटीक परिणाम प्रदान करेगा; (ii) कोशिकाओं को फैलाने के लिए एक छोटे वोल्टेज स्तर का उपयोग करना ताकि सेल आकृतियों को दीर्घवृत्त के साथ अच्छी तरह से फिट किया जा सके।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, मध्यम चालकता 0.04 एस / एम थी, जिसे आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है। चूंकि इलेक्ट्रोडिमोशन-प्रेरित सेलुलर स्ट्रेचिंग जटिल क्लॉसियस मोसोट्टी कारक के वास्तविक मूल्यों से संबंधित है, साइन वेव आवृत्ति चयनित 3 मेगाहर्ट्ज से अलग हो सकती है। कुंजी एक नगण्य जूल हीटिंग प्रभाव को बनाए रखते हुए इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन को प्रेरित करने के लिए वोल्टेज को कम करना है। एक इष्टतम विद्युत उत्तेजना डीईपी सिद्धांत का उपयोग करके या कोशिकाओं के ढांकता हुआ मॉडलिंग के लिए कम्प्यूटेशनल टूल का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है, जैसे कि माई डीईपी11।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल में सेल स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है क्योंकि इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन से गुजरने वाली कोशिकाएं स्वाभाविक रूप से सकारात्मक डीईपी का प्रदर्शन कर रही हैं, जो कोशिकाओं को अनायास इलेक्ट्रोड किनारों पर ले जाती हैं। यह हमें सेल निलंबन पर परीक्षण करने और इलेक्ट्रोड के साथ बातचीत करने वाली सभी कोशिकाओं को गतिहीन करने और साथ ही कोशिकाओं को खींचने की अनुमति देता है। एक बार परीक्षण हो जाने के बाद, माध्यम के साथ चैनल को फ्लश करके डिवाइस से कोशिकाओं को आसानी से हटाया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल की विशेषता जो इसे निलंबित कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से काम करती है, अनुयायी कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए इसके आवेदन को सीमित कर सकती है। हालांकि, हम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड जैसे रसायनों का उपयोग करके सब्सट्रेट से अनुयायी कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं। चूंकि परीक्षण को अपेक्षाकृत कम समय में पूरा करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, मिनट से 1 घंटे तक, हमारे पास कोशिकाओं के लंगर डालनेऔर फैलने से पहले यांत्रिक थकान परीक्षण करने के लिए पर्याप्त समय है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, 100 μm बैंड इंटरडिजिटाइज्ड इलेक्ट्रोड के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईटीओ चिप का उपयोग किया गया था। लंबाई-से-क्षेत्र अनुपात के लिए एक समय में कई कोशिकाओं को मापने के लिए इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड डिज़ाइन फायदेमंद है, क्योंकि कोशिकाएं इलेक्ट्रोड के किनारों पर फैली हुई हैं। माप का थ्रूपुट अवलोकन के क्षेत्र पर भी निर्भर है, जहां सेल आकार और विकृति इलेक्ट्रोड के न्यूनतम अंतर पर सीमाएं निर्धारित करती है। उच्च थ्रूपुट के लिए अवलोकन की कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने के लिए इलेक्ट्रोड की बैंडविड्थ को और कम किया जा सकता है। इलेक्ट्रोड सामग्री अन्य धातुएं हो सकती हैं, जैसे टाइटेनियम या सोना; हालांकि, इलेक्ट्रोड सामग्री की पारदर्शिता एक बेहतर विकल्प हो सकती है क्योंकि कोशिका झिल्ली के हिस्से को गैर-पारदर्शी इलेक्ट्रोड द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है। परीक्षण अभी भी किया जा सकता है यदि सेल का एक प्रासंगिक गणितीय आकार मॉडल, जैसे कि दीर्घवृत्त13, इमेजिंग प्रसंस्करण के दौरान उपयोग किया जा सकता है।
सैद्धांतिक रूप से, यह इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन और एएसके-मॉड्यूलेटेड इलेक्ट्रोडफॉर्मेशन तकनीक अन्य सेल प्रकारों पर काम कर सकती है, सही परिस्थितियों को देखते हुए, जैसे, मध्यम चालकता और विद्युत उत्तेजना। एक सीमा यह है कि हम कितना बढ़ाव देख सकते हैं। आरबीसी अपनी बड़ी विकृति और परिसंचारी प्रकृति के लिए एक अच्छा सेल मॉडल है। वर्तमान प्रोटोकॉल स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में मानव आरबीसी का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है और हाइपोक्सिक थकान13,15 का अध्ययन करने के लिए गैस माइक्रोएन्वायरमेंट से आसानी से सुसज्जित है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को हीमोग्लोबिन-आधारित कृत्रिम ऑक्सीजन वाहक (# 1941655) और स्वस्थ और रोगग्रस्त लाल रक्त कोशिकाओं के एनएसएफ / सीएमएमआई गतिशील और थकान विश्लेषण (# 1635312) के एनएसएफ / सीएमएमआई मेकेनोबायोलॉजी द्वारा वित्त पोषित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
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