Summary
Presentato qui è un protocollo per i test di fatica meccanica nel caso dei globuli rossi umani utilizzando un approccio di elettrodeformazione modulata in ampiezza. Questo approccio generale può essere utilizzato per misurare i cambiamenti sistematici nelle caratteristiche morfologiche e biomeccaniche delle cellule biologiche in una sospensione da deformazione ciclica.
Abstract
I globuli rossi (RBC) sono noti per la loro notevole deformabilità. Subiscono ripetutamente una notevole deformazione quando passano attraverso il microcircolo. La ridotta deformabilità è osservata nei globuli rossi fisiologicamente invecchiati. Le tecniche esistenti per misurare la deformabilità cellulare non possono essere facilmente utilizzate per misurare la fatica, la graduale degradazione nelle membrane cellulari causata da carichi ciclici. Presentiamo un protocollo per valutare la degradazione meccanica nei globuli rossi da sollecitazioni di taglio cicliche utilizzando l'elettrodeformazione basata sulla modulazione ASK (Amplitude Shift Keying) in un canale microfluidico. In breve, gli elettrodi interdigitati nel canale microfluidico sono eccitati con una corrente alternata a bassa tensione a frequenze radio utilizzando un generatore di segnale. I globuli rossi in sospensione rispondono al campo elettrico e mostrano una dielettroforesi positiva (DEP), che sposta le cellule verso i bordi degli elettrodi. Le cellule vengono quindi allungate a causa delle forze elettriche esercitate sulle due metà delle cellule, con conseguente allungamento uniassiale, noto come elettrodeformazione. Il livello di sollecitazione di taglio e la deformazione risultante possono essere facilmente regolati modificando l'ampiezza dell'onda di eccitazione. Ciò consente di quantificare la deformabilità non lineare dei globuli rossi in risposta a piccole e grandi deformazioni ad alta produttività. La modifica dell'onda di eccitazione con la strategia ASK induce elettrodeformazione ciclica con velocità di carico e frequenze programmabili. Ciò fornisce un modo conveniente per la caratterizzazione della fatica dei globuli rossi. Il nostro approccio di elettrodeformazione modulato ASK consente, per la prima volta, una misurazione diretta della fatica dei globuli rossi da carichi ciclici. Può essere utilizzato come strumento per test biomeccanici generali, per analisi della deformabilità cellulare e della fatica in altri tipi di cellule e condizioni patologiche, e può anche essere combinato con strategie per controllare il microambiente delle cellule, come la tensione dell'ossigeno e segnali biologici e chimici.
Introduction
I globuli rossi (RBC) sono le cellule più deformabili nel corpo umano1. La loro deformabilità è direttamente correlata alla loro funzionalità di trasporto dell'ossigeno. È stato riscontrato che una ridotta deformabilità nei globuli rossi è correlata alla patogenesi di diversi disturbi dei globuli rossi2. Le misurazioni della deformabilità ci hanno portato a una migliore comprensione delle malattie correlate ai globuli rossi3. La durata normale dei globuli rossi può variare da 70 a 140 giorni4. Pertanto, è importante misurare come la loro deformabilità diminuisce insieme al processo di invecchiamento, ad esempio, il loro comportamento a fatica a causa di sollecitazioni cicliche di taglio3.
La misurazione della deformabilità dei globuli rossi ad alta produttività è impegnativa a causa delle forze della scala di Piconewton (~10-12 N) che vengono applicate alle singole celle. Negli ultimi dieci anni, sono state sviluppate molte tecnologie per misurare la deformabilità cellulare5. Le misurazioni della deformazione dei globuli rossi a livello di singola cellula possono essere eseguite mediante aspirazione di pipette e pinzette ottiche, mentre le analisi di massa vengono eseguite mediante ektacitometria a gradiente osmotico. Le analisi ektacitometriche forniscono un'abbondanza di dati, che offre l'opportunità di diagnosticare disturbi del sangue 6,7. La deformabilità dei globuli rossi può anche essere analizzata utilizzando la teoria viscoelastica mediante microscopia a forza atomica con sonda colloidale. In questo metodo, l'analisi computazionale viene applicata per stimare il modulo elastico dei globuli rossi, considerando sia le risposte dipendenti dal tempo che quelle stazionarie. La deformabilità dei singoli globuli rossi può essere misurata utilizzando il metodo dell'array di microcamere a cella singola. Questo metodo analizza ogni cellula attraverso la membrana e i marcatori fluorescenti citosolici per fornire informazioni sulla deformabilità dei globuli rossi e sulla distribuzione delle caratteristiche cellulari in popolazioni complesse di RBC per rilevare disturbi ematologici8.
La fatica è un fattore chiave nella degradazione delle proprietà dei materiali ingegnerizzati e dei biomateriali. I test a fatica consentono un'analisi quantitativa dell'integrità e della longevità di una struttura sottoposta a carico ciclico. L'analisi della fatica nelle cellule biologiche è stata a lungo ostacolata dalla mancanza di un metodo generale, facilmente applicabile, ad alto rendimento e quantitativo per l'implementazione della deformazione ciclica nelle membrane cellulari. Ciò è possibile con l'utilizzo di modulazione del segnale elettrico e tecniche di elettrodeformazione implementate in un ambiente microfluidico. La tecnica ASK (Amplitude Shift Keying) come modulazione digitale viene applicata tramite la modulazione OOK (On-Off Keying) in questo articolo. Il concetto di keying si riferisce alla trasmissione di segnali digitali sul canale, che richiede un segnale portante sinusoidale per funzionare9. I tempi di accensione e spegnimento possono essere impostati uguali. Sotto ON-keying, i globuli rossi entrano in uno stato deformato mentre sono esposti a una forza di elettrodeformazione esterna (Fdep)10 creata dal campo elettrico non uniforme. Sotto OFF-keying, i globuli rossi sono nel loro stato rilassato. Osserviamo la fatica dei globuli rossi, ovvero un progressivo degrado della loro capacità di allungarsi con l'aumentare dei cicli di carico. La perdita di deformabilità indotta dalla fatica nei globuli rossi può fornire informazioni sul danno accumulato dalla membrana durante la circolazione sanguigna, permettendoci di studiare ulteriormente le connessioni tra affaticamento cellulare e stati patologici.
Qui forniamo procedure passo-passo su come la prova di fatica dei globuli rossi è implementata in un dispositivo microfluidico tramite elettrodeformazione modulata ASK e le impostazioni del sistema come il dispositivo microfluidico, il carico meccanico e l'immaginazione microscopica per la caratterizzazione della degradazione graduale nella deformabilità meccanica dei globuli rossi.
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Protocol
Il sangue intero umano non identificato è stato ottenuto commercialmente. Il lavoro che coinvolge i campioni di sangue è stato eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 utilizzando protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la biosicurezza presso la Florida Atlantic University.
1. Preparazione del dispositivo microfluidico
- Fissare con nastro adesivo il wafer di silicio master SU-8 per il design del canale microfluidico all'interno di una capsula di Petri di plastica da 14 cm e pulirla con gas N2 .
- Pesare 60 g di base di polidimetilsilossano (PDMS) e 6 g di agente polimerizzante PDMS in un bicchiere di carta. Mescolare le due parti usando una spatola di legno fino a quando il composto è di un colore bianco torbido.
- Versare la miscela PDMS nella capsula di Petri di plastica contenente il wafer di silicio. Posizionare la capsula di Petri in un essiccatore sottovuoto con un rubinetto a 3 vie. Ruotare la valvola del rubinetto di arresto per collegare il vuoto alla camera dell'essiccatore per rimuovere le bolle d'aria dal PDMS.
- Reintrodurre l'aria nella camera dell'essiccatore regolando la valvola del rubinetto di arresto per collegare la camera dell'essiccatore all'ambiente in cicli di circa 5 minuti. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse dalle caratteristiche dei canali.
- Posizionare la piastra di Petri all'interno di un forno a 70 °C per 4 ore. Una volta trascorso il tempo, rimuovere la capsula di Petri, lasciarla raffreddare a temperatura ambiente e posizionarla su un tappetino da taglio.
- Utilizzando un bisturi, ritagliare la porzione del PDMS sopra il wafer di silicio. Posizionare il PDMS ritagliato tra i due fogli di pellicola avvolgente da laboratorio. Lo spazio formato tra la rientranza del microcanale e il film semitrasparente facilita l'identificazione della posizione del canale microfluidico e della sua rispettiva entrata e uscita.
- Utilizzando una lametta da barba, ritagliare un singolo canale dal grande PDMS. Perforare un foro di ingresso da 3 mm e un foro di uscita da 1,5 mm utilizzando punzoni per biopsia rispettivamente alle due dimensioni (Figura 1A).
- Posizionare il canale perforato, con il lato del canale rivolto verso l'alto, su un vetrino pulito. Posizionare un substrato di vetro di 20 mm x 15 mm contenente elettrodi interdigitati con ossido di indio-stagno (ITO) a film sottile sullo stesso vetrino con gli elettrodi rivolti verso l'alto.
- Posizionare delicatamente il vetrino con PDMS e il substrato in un detergente al plasma. Chiudere la valvola del gas, accendere l'interruttore della pompa e attendere 2 minuti per ottenere una lettura del sensore di 600 - 800 mTorr.
- Accendere l'interruttore di alimentazione e attendere 30 secondi. Ruotare la manopola di alimentazione RF da bassa a alta e attendere 1 minuto.
- Quindi, invertire la sequenza ruotando la manopola RF su OFF, l'interruttore di alimentazione su OFF, l'interruttore della pompa su OFF e aprendo la valvola del gas.
- Immediatamente dopo aver aperto la camera del pulitore al plasma, sollevare e ruotare il PDMS in modo che il lato del canale sia rivolto verso il basso (180°). Posizionare il canale sulla parte superiore del substrato ITO. Il processo di incollaggio è iniziato.
- Utilizzando una pinzetta, premere delicatamente sugli angoli del PDMS per circa 3 s. Evitare di premere sul canale stesso.
NOTA: Il processo di incollaggio avviene spontaneamente al contatto fisico tra le due superfici trattate. - Caricare il mezzo di adescamento in una siringa da 1 mL con un ago da 23 G. Bagnare accuratamente il canale inserendo l'ago direttamente nel pozzetto di ingresso e quindi rilasciando il mezzo. Operare lentamente. Non introdurre bolle d'aria. Incubare per almeno 3 min.
- Rimuovere il mezzo principale utilizzando una punta della pipetta da 10 μL. Lavare il canale con DEP medium 3 volte inserendo il mezzo DEP nel canale. Mantenere il canale sempre bagnato.
2. Dispositivo di prova
NOTA: Il dispositivo di prova è progettato utilizzando un software CAD 3D e include un'unità di alloggiamento di base e un'unità superiore (Figura 1B). Quindi, viene prodotto utilizzando una fresatrice CNC a 3 assi con un limite di tolleranza standard di circa ± dimensione di 0,005 pollici del dispositivo di prova viene controllata utilizzando una pinza elettronica (non mostrata). La sterilità dell'apparecchio non è richiesta per i test biomeccanici in vitro.
- Fili di pre-saldatura nelle estremità della tazza di saldatura di due set di connettori a pistone a molla.
- Inserire i connettori del pistone a molla nell'unità superiore e creare un incollaggio permanente aggiungendo una goccia di colla epossidica.
3. Preparazione del tampone di lavoro per elettrodeformazione
- Per preparare il mezzo DEP, pesare 12,75 g di saccarosio e 0,45 g di destrosio utilizzando una bilancia.
- Sciogliere entrambe le polveri in un unico contenitore con 150 ml di acqua deionizzata (DI) e 3,5 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
- Utilizzando un tester di conducibilità a bassa gamma, misurare la conducibilità e assicurarsi che sia 0,04 S/m (Figura 2).
NOTA: è possibile utilizzare un valore di conducibilità diverso, che potrebbe modificare il segno e la grandezza della forza DEP risultante11. L'elettrodeformazione, tuttavia, richiede una forza DEP positiva. - Utilizzando un osmometro, confermare che l'osmolarità rientra nel range normale del plasma sanguigno, da 275 a 295 mOsm/kg di acqua (Figura 3). Conservare a 4 °C. Il mezzo DEP è ora pronto.
- In una provetta da 15 ml, sciogliere 0,5 g di albumina sierica bovina (BSA) in 10 mL del terreno DEP. Mescolare accuratamente. Il supporto principale del dispositivo è ora pronto.
4. Preparazione della sospensione cellulare
- Lavare 20 μL di sangue intero centrifugando il sangue con 1 mL di PBS a 268 x g per 3 minuti. Scartare il surnatante.
- Risospendere i globuli rossi in 1 mL di PBS. Pipettare delicatamente per mescolare. Lavare i globuli rossi per 3 minuti a 268 x g ed eliminare il surnatante.
- Estrarre 5 μL di pellet di globuli rossi utilizzando una punta di micropipetta da 10 μL ed erogare completamente in 1 mL di mezzo DEP. Lavare le celle centrifugando a 268 x g per 3 min.
- Eliminare il surnatante e risospendere i globuli rossi in 1 mL di terreno DEP. Pipettare delicatamente per mescolare.
- Lavare i globuli rossi per 3 minuti a 268 x g ed eliminare il surnatante. Pipettare 2 μL di pellet RBC in 500 μL di mezzo DEP. La sospensione cellulare viene ora preparata con una concentrazione compresa tra 62 e 104 cellule/μL12, che può essere confermata utilizzando un vetrino standard per il conteggio delle cellule.
5. Configurazione dell'elettrodeformazione e test di fatica
- Posizionare il dispositivo microfluidico nella parte inferiore del dispositivo di prova. Allineare la parte superiore del dispositivo al dispositivo e assemblare le due parti utilizzando due set di viti e dadi in nylon (Figura 4).
- Posizionare il dispositivo di prova sul palco del microscopio. Individuare un set desiderato di elettrodi al microscopio.
- Collegare la coppia corrispondente di fili dell'elettrodo che corrispondono all'elettrodo posizionato al terminale di uscita del generatore di funzioni (Figura 4).
- Rimuovere 5 μL del mezzo DEP dall'ingresso di 3 mm del canale microfluidico. Caricare lentamente 5 μL della sospensione della cella nell'ingresso utilizzando una punta per pipetta da 10 μL.
- Lasciare che le cellule si stabilizzino per 1 minuto. Se necessario, aggiungere un ulteriore mezzo DEP all'ingresso per spingere le celle nel canale.
- Osservare il canale con ingrandimento 20x. Utilizzare un filtro passa banda 414/46 nm per migliorare il contrasto dell'immagine.
- Premere il pulsante Sinusoidale e definire un'onda sinusoidale con ampiezza 2 VRMS alla frequenza di 3 MHz. Premere il pulsante Mod per abilitare la modulazione. Modificare la modalità onda in ASK premendo l'opzione Tipo .
- Impostare la frequenza di modulazione su 250 mHz, che corrisponde a un periodo di carico-scarico di 4 s (Figura 5A). Attivare l'uscita del generatore di funzioni.
- Registra un video di 1 minuto ogni 10 minuti a 30 fotogrammi per s (fps).
6. Caratterizzazione della deformazione dei globuli rossi
- Utilizzando un'applicazione di editing video, aprire .avi i file registrati nel passaggio precedente premendo CTRL+O. Utilizzare la timeline per scegliere un fotogramma di interesse e impostare i fotogrammi iniziali e finali della selezione in modo che siano identici premendo il tasto Home e quindi il tasto Fine sulla tastiera.
- Esportate la cornice dell'immagine. Selezionare il formato di output da JPEG e premere OK.
- Aprire l'applicazione ImageJ e caricare le immagini salvate nel passaggio precedente. Iniziare impostando le misure necessarie premendo Analizza > Imposta misure e assicurandosi che le caselle di controllo Area, Perimetro e Adatta ellisse siano selezionate. Premere OK.
- Quindi, converti l'immagine in scala di grigi scegliendo Immagine > Tipo > 8 bit.
- Quindi convertire l'immagine in binario utilizzando Image > Adjust > Thresholding. Nella finestra di dialogo Soglia, regolate i due dispositivi di scorrimento in base alle esigenze. Premere Applica e quindi chiudere la finestra di dialogo Soglia.
- Scegliere Analizza > Tools > Gestione ROI. In Gestione ROI, premere la casella di controllo Mostra tutto. Non chiudere questa casella.
- Selezionare lo strumento bacchetta (ricalco), selezionare una cella applicabile nell'immagine e premere T sulla tastiera. La cella selezionata verrà numerata. È possibile selezionare nuovamente una nuova cella. Selezionare tutte le celle applicabili da misurare. Le celle applicabili sono identificate come quelle isolate dalle altre cellule. Il numero di queste celle potrebbe variare da 50 a 200 in un singolo campo visivo.
- Tornare alla casella ROI Manager e premere Misura. Verrà visualizzata la casella Risultati. Le colonne etichettate Maggiore e Minore sono le lunghezze degli assi maggiore e minore dell'ellisse adattata (in pixel), rispettivamente. Scegliere File > Salva con nome per esportare le misurazioni come file in formato CSV.
- Utilizzando qualsiasi software di analisi computazionale appropriato, calcolare il quoziente di Maggiore e Minore.
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Representative Results
Quando la sospensione cellulare è stata caricata nel canale microfluidico, è stata osservata una distribuzione relativamente uniforme delle cellule. All'uscita del segnale (ad esempio, una semplice onda sinusoidale o una fase On-Keying di ASK) dal generatore di funzioni, gli elettrodi interdigitati a film sottile generavano un campo elettrico a corrente alternata non uniforme. Le cellule sospese hanno risposto spontaneamente a questa eccitazione elettrica e hanno mostrato un comportamento DEP positivo, cioè spostandosi verso i bordi degli elettrodi con maggiore intensità di campo. Di conseguenza, le celle sono state allineate lungo i bordi degli elettrodi e sono state allungate a causa dell'elettrodeformazione. Nella fase di On-Keying, i globuli rossi vengono allungati a causa dell'elettrodeformazione; nella fase di Off-Keying, i globuli rossi sono rilassati (Figura 5B). Mantenere la discrezione cellulare è importante in questo protocollo. Utilizzando il fattore di diluizione come indicato in questo protocollo, la sospensione cellulare dei globuli rossi normali era compresa tra 62 e 104 cellule/μL. A una concentrazione all'interno di questo intervallo, siamo stati in grado di ottenere un elevato throughput di misurazione delle cellule riducendo al minimo l'accumulo di cellule a causa dell'effetto DEP positivo.
Durante il monitoraggio dei singoli globuli rossi durante il test di fatica di 1 ora, abbiamo osservato una graduale diminuzione della deformazione cellulare (Figura 5C). La deformabilità è stata quantificata dal rapporto tra gli assi maggiore e minore di un'ellisse utilizzata per adattarsi ai singoli globuli rossi, utilizzando un software di imaging open source (Figura 6). Le immagini di interesse sono state aperte nel programma software. Non è stato necessario calibrare la dimensione dei pixel in una scala di lunghezza per la misurazione della deformabilità. I dati numerici possono essere ulteriormente analizzati e tracciati utilizzando un software.
In questo protocollo, i dati di deformazione dei globuli rossi sono stati raccolti nell'intervallo di tempo di 10 minuti durante l'1 h di carico meccanico ciclico utilizzando l'ASK a 250 mHz per modulare l'onda sinusoidale 2 VRMS-3 MHz. È stata osservata una graduale riduzione della deformabilità cellulare. La perdita totale di deformabilità per i globuli rossi in questa condizione di prova di fatica è risultata essere del 18% (Figura 7).
Figura 1: Dispositivo microfluidico per elettrodeformazione. (A) Schema del canale microfluidico con fori perforati per biopsia di 1,5 mm e 3 mm rispettivamente per l'uscita e l'ingresso del campione. (B) Vista esplosiva dell'assieme del dispositivo di prova. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Funzionamento del misuratore di conducibilità. Un conduttimetro è stato utilizzato per verificare che la conducibilità del mezzo DEP fosse di 0,04 S/m. Le sonde di rilevamento alla base del misuratore vengono immerse nel campione per ottenere una lettura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Funzionamento dell'osmometro. Un osmometro è stato utilizzato per verificare la concentrazione osmotica del mezzo DEP. Fase 1 - Inserire una punta del campione in posizione sul campionatore e caricare 20 μL di campione. Fase 2 - Appoggiare il campionatore all'interno della base operativa e sotto la parte superiore della base. Passaggio 3: spingere l'intera base operativa verso il basso fino a raggiungere un arresto positivo. Passo 4 - Lo strumento esegue il test per circa 1 minuto e visualizza il risultato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Connettività del generatore di funzioni. Immagine della configurazione sperimentale per le prove di fatica, compreso il gruppo del dispositivo di prova e un generatore di funzioni. I cuscinetti degli elettrodi ITO sono collegati al generatore di funzioni tramite cavo a clip BNC-alligatore tramite i fili pre-saldati nelle tazze Pogo pin premuti nell'unità superiore del dispositivo di prova. Il dispositivo microfluidico con due canali paralleli indipendenti si trova sull'unità inferiore del dispositivo di prova. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Risposta della cella alla digitazione on-off. (A) On-off keying onda sinusoidale modulata per 1 h prova di fatica: onda sinusoidale di ampiezza 2 VRMS a 3 MHz per azione di elettrodeformazione, frequenza di modulazione di 250 mHz con conseguente 2 s di allungamento e 2 s di rilassamento. (B) Nella fase di On-Keying, i globuli rossi sono allungati a causa dell'elettrodeformazione; nella fase di Off-Keying, i globuli rossi sono rilassati. (C) L'elettrodeformazione di una cellula rappresentativa mostra una graduale degradazione della deformazione della membrana durante 1 ora di allungamento ciclico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Caratterizzazione della deformabilità dei globuli rossi utilizzando ImageJ. Passo 1 - Importa l'immagine nel software di modifica delle immagini e convertila in scala di grigi a 8 bit. Passo 2 - Regola la soglia per convertire le immagini in binario. Passo 3 - Seleziona le celle con lo strumento bacchetta (ricalco) e gestisci le selezioni con il gestore ROI. Passo 4 - Selezionare le celle per ottenere le misurazioni per gli assi maggiore e minore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Riduzione della deformabilità cellulare. Degradazione graduale della deformabilità dei globuli rossi dovuta all'elettrodeformazione ciclica. La barra di errore mostra la deviazione standard (n = 69). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La modulazione ASK OOK di un'onda sinusoidale che induce forza DEP può essere utilizzata per testare la fatica meccanica dei globuli rossi per un lungo periodo di tempo. In questo protocollo, abbiamo limitato il test di fatica in vitro a 1 ora per prevenire i potenziali effetti metabolici avversi sulla deformabilità cellulare. Le condizioni complete di prova di fatica possono essere programmate utilizzando la tecnica di elettrodeformazione modulata ASK. È possibile programmare parametri come la frequenza di caricamento, l'ampiezza e la velocità di caricamento. La frequenza di carico può essere programmata a valori variabili per determinare la dipendenza della fatica dalla frequenza di carico e le differenze tra carico ciclico e carico statico13.
La grandezza di allungamento può essere facilmente regolata utilizzando un diverso livello di tensione per piccole o grandi deformazioni. Tuttavia, quando si utilizzano livelli di alta tensione per includere grandi deformazioni, si nota che l'elettrodeformazione si tradurrà in globuli rossi a forma di fiamma (Figura 6, fase 3). Ciò può introdurre errori durante l'adattamento delle forme delle celle con ellissi, che tagliano i bordi appuntiti delle celle. In questa circostanza, specialmente quando si utilizza l'elettrodeformazione per estrarre i parametri di viscoelasticità del taglio della membrana, è possibile utilizzare due strategie: (i) l'utilizzo di un modello computazionale di forme cellulari reali fornirà risultati più accurati rispetto al semplice modello analitico di forma ellittica; (ii) utilizzare un livello di tensione più piccolo per allungare le celle in modo che le forme delle celle possano essere ben adattate con ellissi.
Nel protocollo attuale, la conduttività media era di 0,04 S / m, che può essere regolata secondo necessità. Poiché lo stiramento cellulare indotto dall'elettrodeformazione è correlato ai valori reali del complesso fattore di Clausius Mossotti, la frequenza dell'onda sinusoidale può essere diversa dai 3 MHz selezionati. La chiave è ridurre al minimo la tensione per indurre l'elettrodeformazione mantenendo un effetto di riscaldamento Joule trascurabile. Un'eccitazione elettrica ottimale può essere determinata utilizzando la teoria DEP o utilizzando strumenti computazionali per la modellazione dielettrica delle cellule, come My DEP11.
Va notato che l'immobilizzazione cellulare non è richiesta in questo protocollo poiché le cellule sottoposte a elettrodeformazione mostrano intrinsecamente DEP positivo, che sposta spontaneamente le cellule verso i bordi dell'elettrodo. Questo ci permette di eseguire test su sospensioni cellulari e immobilizzare tutte le cellule che interagiscono con l'elettrodo e contemporaneamente allungano le cellule. Una volta eseguito il test, le celle possono essere facilmente rimosse dal dispositivo lavando il canale con il mezzo. La caratteristica dell'attuale protocollo che lo fa funzionare bene con le cellule sospese può limitare la sua applicazione per testare le cellule aderenti. Tuttavia, possiamo staccare le cellule aderenti dal substrato usando sostanze chimiche come l'acido etilendiamminotetraacetico. Poiché il test può essere progettato per essere completato in un tempo relativamente breve, da minuti a 1 ora, abbiamo abbastanza tempo per eseguire test di fatica meccanica prima che le celle si ancorino e si diffondano14.
Nel protocollo attuale, è stato utilizzato un chip ITO disponibile in commercio con elettrodi interdigitati in banda 100 μm. Il design degli elettrodi interdigitati è vantaggioso per misurare più celle alla volta per il rapporto lunghezza-area, poiché le celle sono allungate ai bordi degli elettrodi. Il throughput della misurazione dipende anche dal campo di osservazione, dove le dimensioni e la deformabilità della cella limitano lo spazio minimo degli elettrodi. La larghezza di banda degli elettrodi può essere ulteriormente ridotta per aumentare il numero di celle di osservazione per una maggiore produttività. I materiali degli elettrodi possono essere altri metalli, come il titanio o l'oro; Tuttavia, la trasparenza dei materiali degli elettrodi può essere una scelta migliore in quanto parte delle membrane cellulari può essere bloccata dagli elettrodi non trasparenti. Il test può ancora essere eseguito se un modello di forma matematica rilevante della cellula, come un ellissoide13, può essere utilizzato durante l'elaborazione dell'imaging.
Teoricamente, questa elettrodeformazione e le tecniche di elettrodeformazione modulata ASK possono funzionare su altri tipi di cellule, date le giuste condizioni, ad esempio la conduttività media e le eccitazioni elettriche. Una limitazione è la quantità di allungamento che possiamo osservare. RBC è un buon modello cellulare per la sua grande deformabilità e natura circolante. L'attuale protocollo è stato applicato per studiare i globuli rossi umani sia in salute che in malattia ed è prontamente dotato di un microambiente gassoso per studiare l'affaticamento ipossico13,15.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) e NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (# 1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M.
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
