Summary
Apresentamos aqui um protocolo para testes de fadiga mecânica no caso de hemácias humanas usando uma abordagem de eletrodeformação modulada por amplitude. Esta abordagem geral pode ser usada para medir as mudanças sistemáticas nas características morfológicas e biomecânicas de células biológicas em uma suspensão por deformação cíclica.
Abstract
As hemácias (hemácias) são conhecidas por sua notável deformabilidade. Eles sofrem repetidamente considerável deformação ao passar pela microcirculação. A deformabilidade reduzida é observada em hemácias fisiologicamente envelhecidas. As técnicas existentes para medir a deformabilidade celular não podem ser facilmente usadas para medir a fadiga, a degradação gradual nas membranas celulares causada por cargas cíclicas. Apresentamos um protocolo para avaliar a degradação mecânica em hemácias a partir de tensões cíclicas de cisalhamento usando eletrodeformação baseada em modulação de amplitude shift keying (ASK) em um canal microfluídico. Resumidamente, os eletrodos interdigitalizados no canal microfluídico são excitados com uma corrente alternada de baixa tensão em radiofrequências usando um gerador de sinais. As hemácias em suspensão respondem ao campo elétrico e exibem dieletroforese positiva (DEP), que move as células para as bordas do eletrodo. As células são então esticadas devido às forças elétricas exercidas sobre as duas metades celulares, resultando em estiramento uniaxial, conhecido como eletrodeformação. O nível de tensão de cisalhamento e a deformação resultante podem ser facilmente ajustados alterando a amplitude da onda de excitação. Isso permite quantificações da deformabilidade não linear das hemácias em resposta a pequenas e grandes deformações em alto rendimento. A modificação da onda de excitação com a estratégia ASK induz eletrodeformação cíclica com taxas de carregamento e frequências programáveis. Isso fornece uma maneira conveniente para a caracterização da fadiga eritrocitária. Nossa abordagem de eletrodeformação modulada por ASK permite, pela primeira vez, uma medição direta da fadiga das hemácias a partir de cargas cíclicas. Ele pode ser usado como uma ferramenta para testes biomecânicos gerais, para análises de deformabilidade e fadiga celular em outros tipos celulares e condições doentes, e também pode ser combinado com estratégias para controlar o microambiente das células, como tensão de oxigênio e pistas biológicas e químicas.
Introduction
As hemácias (hemácias) são as células mais deformáveis do corpo humano1. Sua deformabilidade está diretamente relacionada à sua funcionalidade de transporte de oxigênio. Descobriu-se que a deformabilidade reduzida nas hemácias se correlaciona com a patogênese de várias doenças eritrocitárias2. Medidas de deformabilidade nos levaram a um melhor entendimento das doenças relacionadas às hemácias3. A vida normal das hemácias pode variar de 70 a 140 dias4. Portanto, é importante medir como sua deformabilidade diminui com o processo de envelhecimento, por exemplo, seu comportamento de fadiga devido a tensões cíclicas de cisalhamento3.
Medir a deformabilidade das hemácias em alto rendimento é um desafio devido às forças da escala de piconewton (~10-12 N) que são aplicadas às células individuais. Na última década, muitas tecnologias foram desenvolvidas para medir a deformabilidade celular5. Medidas de deformação de hemácias em nível de célula única podem ser realizadas por aspiração por pipeta e pinça óptica, enquanto as análises em massa são feitas por ectaciometria de gradiente osmótico. As análises de ectacitometria fornecem uma abundância de dados, o que oferece uma oportunidade para diagnosticar distúrbios sanguíneos 6,7. A deformabilidade das hemácias também pode ser analisada pela teoria viscoelástica por microscopia de força atômica com sonda coloide. Neste método, a análise computacional é aplicada para estimar o módulo de elasticidade das hemácias, considerando tanto respostas dependentes do tempo quanto do estado estacionário. A deformabilidade de hemácias individuais pode ser medida usando o método de arranjo de microcâmaras de célula única. Este método analisa cada célula através da membrana e marcadores fluorescentes citosólicos para fornecer informações sobre a deformabilidade das hemácias e a distribuição das características celulares em populações complexas de hemácias para detectar distúrbioshematológicos8.
A fadiga é um fator-chave na degradação das propriedades de materiais de engenharia e biomateriais. O teste de fadiga permite uma análise quantitativa da integridade e longevidade de uma estrutura submetida a cargas cíclicas. A análise da fadiga em células biológicas tem sido dificultada pela falta de um método geral, prontamente aplicável, de alto rendimento e quantitativo para a implementação da deformação cíclica nas membranas celulares. Isso é possível com a utilização de técnicas de modulação de sinal elétrico e eletrodeformação implementadas em ambiente microfluídico. A técnica de chaveamento de deslocamento de amplitude (ASK) como uma modulação digital é aplicada através da modulação On-Off keying (OOK) neste artigo. O conceito de chaveamento refere-se à transmissão de sinais digitais pelo canal, que requer um sinal portador de onda senoidal para funcionar9. Os tempos ON e OFF podem ser definidos iguais. Sob chaveamento ON, as hemácias entram em um estado deformado enquanto expostas a uma força de eletrodeformação externa (Fdep)10 criada pelo campo elétrico não uniforme. Sob OFF-keying, as hemácias estão em seu estado relaxado. Observamos a fadiga das hemácias, ou seja, uma degradação progressiva em sua capacidade de alongamento com o aumento dos ciclos de carga. A perda de deformabilidade induzida por fadiga em hemácias pode fornecer informações sobre o dano acumulado na membrana durante a circulação sanguínea, permitindo-nos investigar melhor as conexões entre fadiga celular e estados de doença.
Aqui nós fornecemos procedimentos passo-a-passo sobre como o teste de fadiga de hemácias é implementado em um dispositivo microfluídico via eletrodeformação modulada por ASK e as configurações do sistema, como dispositivo microfluídico, carregamento mecânico e imaginação microscópica para a caracterização da degradação gradual na deformabilidade mecânica de hemácias.
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Protocol
Sangue total humano desidentificado foi obtido comercialmente. O trabalho envolvendo as amostras de sangue foi realizado em um laboratório de nível 2 de biossegurança, utilizando protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Florida Atlantic University.
1. Preparação do dispositivo microfluídico
- Tape o wafer de silício mestre SU-8 para o design do canal microfluídico no interior de uma placa de Petri de plástico de 14 cm e limpe-o com gás N2 .
- Pesar 60 g de base de polidimetilsiloxano (PDMS) e 6 g de agente de cura PDMS em um copo de papel. Misture as duas partes usando uma espátula de madeira até que a mistura fique com uma cor branca turva.
- Despeje a mistura de PDMS na placa de Petri plástica que contém o wafer de silício. Coloque a placa de Petri em um exsicador a vácuo com uma torneira de 3 vias. Gire a válvula da torneira para conectar o vácuo à câmara do exsicador para remover bolhas de ar do PDMS.
- Reintroduza o ar na câmara do exsicador ajustando a válvula da torneira para conectar a câmara do exsicador ao ambiente em ciclos de aproximadamente 5 minutos. Repita até que todas as bolhas de ar sejam removidas das características dos canais.
- Coloque a placa de Petri dentro de um forno a 70 °C por 4 h. Decorrido o tempo, retire a placa de Petri, deixe esfriar até a temperatura ambiente e coloque-a em uma esteira de corte.
- Usando um bisturi, corte a porção do PDMS acima do wafer de silício. Coloque o recorte PDMS entre as duas folhas de filme de embrulho de laboratório. O gap formado entre o recuo do microcanal e o filme semitransparente facilita a identificação da localização do canal microfluídico, bem como sua respectiva entrada e saída.
- Usando uma lâmina de barbear, corte um canal individual do PDMS grande. Perfurar um orifício de entrada de 3 mm e um orifício de saída de 1,5 mm com punções de biópsia respectivos aos dois tamanhos (Figura 1A).
- Coloque o canal perfurado, com o lado do canal voltado para cima, em uma lâmina de vidro limpa. Coloque um substrato de vidro de 20 mm x 15 mm contendo eletrodos interdigitados de óxido de índio estanho (ITO) de filme fino na mesma lâmina de vidro com eletrodos voltados para cima.
- Coloque delicadamente a lâmina de vidro com PDMS e substrato em um limpador de plasma. Feche a válvula de gás, ligue o interruptor da bomba e aguarde 2 minutos para obter uma leitura do sensor de 600 - 800 mTorr.
- Ligue o interruptor de alimentação e aguarde 30 s. Gire o botão de alimentação RF de baixo para alto e aguarde 1 min.
- Em seguida, inverta a sequência girando o botão de RF para baixo, interruptor de energia para OFF, interruptor da bomba para OFF e abrindo a válvula de gás.
- Imediatamente após abrir a câmara do limpador de plasma, levante e gire o PDMS de modo que o lado do canal fique voltado para baixo (180°). Coloque o canal na parte superior do substrato ITO. O processo de colagem já começou.
- Usando pinças, pressione suavemente os cantos do PDMS por cerca de 3 s. Evite pressionar o próprio canal.
OBS: O processo de colagem ocorre espontaneamente ao contato físico entre as duas superfícies tratadas. - Coloque o meio de escorvamento numa seringa de 1 ml com uma agulha de 23 G. Molhe cuidadosamente o canal, inserindo a agulha diretamente no poço de entrada e, em seguida, liberando o meio. Opere devagar. Não introduza bolhas de ar. Incubar por pelo menos 3 min.
- Retire o meio nobre usando uma ponteira de pipeta de 10 μL. Lave o canal com o meio DEP 3 vezes inserindo o meio DEP no canal. Mantenha o canal sempre molhado.
2. Dispositivo de teste
NOTA: O dispositivo de teste é projetado usando software CAD 3D e inclui uma unidade de alojamento de base e uma unidade superior (Figura 1B). Em seguida, ele é fabricado usando uma fresadora CNC de 3 eixos com um limite de tolerância padrão de cerca de ± dimensão de 0,005 polegadas do dispositivo de teste é verificada usando um paquímetro eletrônico (não mostrado). A esterilidade do acessório não é necessária para os testes biomecânicos in vitro.
- Pré-solda fios nas extremidades do copo de solda de dois conjuntos de conectores de pistão de mola.
- Insira os conectores de pistão de mola na unidade superior e crie uma ligação permanente adicionando uma gota de cola epóxi.
3. Preparação do tampão de trabalho da eletrodeformação
- Para preparar o meio DEP, pesar 12,75 g de sacarose e 0,45 g de dextrose em balança.
- Dissolver ambos os pós em um único recipiente com 150 mL de água deionizada (DI) e 3,5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Usando um testador de condutividade de baixo alcance, meça a condutividade e certifique-se de que ela seja de 0,04 S/m (Figura 2).
NOTA: Um valor de condutividade diferente pode ser usado, o que pode alterar o sinal e a magnitude da força DEP resultante11. A eletrodeformação, no entanto, requer uma força DEP positiva. - Por meio de um osmômetro, confirme se a osmolaridade está dentro da faixa normal do plasma sanguíneo, 275 a 295 mOsm/kg de água (Figura 3). Conservar a 4 °C. O meio DEP está agora preparado.
- Em um tubo de 15 mL, dissolver 0,5 g de albumina de soro bovino (BSA) em 10 mL do meio DEP. Homogeneizar. O principal meio do dispositivo já está preparado.
4. Preparação da suspensão celular
- Lavar 20 μL do sangue total centrifugando o sangue com 1 ml de PBS a 268 x g durante 3 minutos. Descarte o sobrenadante.
- Ressuspender as hemácias em 1 mL de PBS. Pipetar suavemente para misturar. Lave as hemácias por 3 min a 268 x g e descarte o sobrenadante.
- Extrair 5 μL de pastilha de RBC usando uma ponta de micropipeta de 10 μL e dispensar totalmente em 1 mL do meio DEP. Lave as células centrifugando a 268 x g por 3 min.
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender as hemácias em 1 mL de meio DEP. Pipetar suavemente para misturar.
- Lave as hemácias por 3 min a 268 x g e descarte o sobrenadante. Pipetar 2 μL de pastilha de hemácias em 500 μL de meio DEP. A suspensão celular é agora preparada com uma concentração dentro de uma faixa de 62 - 104 células/μL12, que pode ser confirmada usando uma lâmina de contagem de células padrão.
5. Configuração da eletrodeformação e teste de fadiga
- Coloque o dispositivo microfluídico na parte inferior do dispositivo de ensaio. Alinhe a parte superior do acessório ao dispositivo e monte as duas partes utilizando dois conjuntos de parafusos e porcas de nylon (Figura 4).
- Coloque o dispositivo de teste no palco do microscópio. Localize um conjunto desejado de eletrodos sob o microscópio.
- Conecte o par correspondente de fios de eletrodos que correspondem ao conjunto de eletrodos localizado ao terminal de saída do gerador de funções (Figura 4).
- Remover 5 μL do meio DEP da entrada de 3 mm do canal microfluídico. Coloque lentamente 5 μL da suspensão celular na entrada usando uma ponteira de pipeta de 10 μL.
- Deixe as células se acomodarem por 1 min. Se necessário, adicione um meio DEP adicional à entrada para empurrar as células para o canal.
- Observe o canal em aumento de 20x. Use um filtro passa-banda de 414/46 nm para melhorar o contraste da imagem.
- Pressione o botão senoidal e defina uma onda senoidal com uma amplitude de 2 VRMS na frequência de 3 MHz. Pressione o botão Mod para ativar a modulação. Altere o modo de onda para ASK pressionando a opção Tipo .
- Ajuste a frequência de modulação para 250 mHz, o que corresponde a um período de carga-descarga de 4 s (Figura 5A). Ligue a saída do gerador de funções.
- Grave um vídeo de 1 min a cada 10 min a 30 quadros por s (fps).
6. Caracterização da deformação eritrocitária
- Usando um aplicativo de edição de vídeo, abra .avi arquivos gravados na etapa anterior pressionando Ctrl+O. Use a linha do tempo para escolher um quadro de interesse e defina os quadros de início e fim da seleção como idênticos pressionando a tecla Home e, em seguida, a tecla End no teclado.
- Exporte o quadro da imagem. Selecione o formato de saída para ser JPEG e pressione OK.
- Abra o aplicativo ImageJ e carregue as imagens salvas na etapa anterior. Comece definindo as medidas necessárias pressionando Analisar > Definir Medidas e garantindo que as caixas de seleção de Área, Perímetro e Elipse de ajuste estejam marcadas. Pressione OK.
- Em seguida, converta a imagem em tons de cinza escolhendo Imagem > Tipo > 8 bits.
- Em seguida, converta a imagem em binária usando Image > Adjust > Thresholding. Na caixa de diálogo Limite, ajuste os dois controles deslizantes conforme necessário. Pressione Aplicar e feche a caixa de diálogo Limite.
- Escolha Analisar ferramentas > > ROI Manager. No Gerenciador de ROI, pressione a caixa de seleção Mostrar tudo. Não feche esta caixa.
- Selecione a Ferramenta Varinha (rastreamento), selecione uma célula aplicável na imagem e pressione T no teclado. A célula selecionada será numerada. Uma nova célula pode ser selecionada novamente. Selecione todas as células aplicáveis a serem medidas. As células aplicáveis são identificadas como aquelas que são isoladas de outras células. O número dessas células pode variar de 50 a 200 em um único campo de visão.
- Retorne à caixa Gerenciador de ROI e pressione Medir. Isso abre a caixa Resultados. As colunas denominadas Maior e Menor são os comprimentos dos eixos maiores e menores da elipse ajustada (em pixels), respectivamente. Escolha Arquivo > Salvar como para exportar as medidas como um arquivo formatado em CSV.
- Usando qualquer software de análise computacional apropriado, calcule o quociente de Maior e Menor.
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Representative Results
Quando a suspensão celular foi carregada no canal microfluídico, uma distribuição relativamente uniforme das células foi observada. Após a saída do sinal (por exemplo, uma onda senoidal simples ou fase On-Keying do ASK) do gerador de função, os eletrodos interdigitados de filme fino geraram um campo elétrico de corrente alternada não uniforme. As células em suspensão responderam espontaneamente a essa excitação elétrica e exibiram um comportamento DEP positivo, ou seja, movendo-se em direção às bordas dos eletrodos com maior força de campo. Consequentemente, as células foram alinhadas ao longo das bordas dos eletrodos e foram esticadas devido à eletrodeformação. Na fase On-Keying, as hemácias são esticadas devido à eletrodeformação; na fase Off-Keying, as hemácias são relaxadas (Figura 5B). A manutenção da discrição celular é importante nesse protocolo. Usando o fator de diluição como indicado neste protocolo, a suspensão celular de hemácias normais estava em uma faixa de 62 - 104 células/μL. Em uma concentração dentro desta faixa, conseguimos obter um alto rendimento de medição celular, minimizando o acúmulo de células devido ao efeito DEP positivo.
Ao rastrear hemácias individuais durante o teste de fadiga de 1 h, observamos uma diminuição gradual da deformação celular (Figura 5C). A deformabilidade foi quantificada pela razão dos eixos maior e menor de uma elipse que foi usada para ajustar as hemácias individuais, usando software de imagem de código aberto (Figura 6). As imagens de interesse foram abertas no software. Não foi necessário calibrar o tamanho do pixel em escala de comprimento para a medida da deformabilidade. Os dados numéricos podem ser posteriormente analisados e plotados usando software.
Neste protocolo, os dados de deformação das hemácias foram coletados no intervalo de tempo de 10 min durante a 1 h de carregamento mecânico cíclico usando o ASK de 250 mHz para modular a onda senoidal de 2 VRMS-3 MHz. Observou-se redução gradual da deformabilidade celular. A perda total de deformabilidade das hemácias nessa condição de teste de fadiga foi de 18% (Figura 7).
Figura 1: Dispositivo microfluídico para eletrodeformação. (A) Esquema do canal microfluídico com furos perfurados de biópsia de 1,5 mm e 3 mm para saída e entrada da amostra, respectivamente. (B) Vista explosiva do conjunto do dispositivo de ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Operação do condutivímetro. Um condutivímetro foi utilizado para verificar a condutividade do meio DEP em 0,04 S/m. As sondas de detecção na base do medidor são submersas na amostra para obter uma leitura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Funcionamento do osmômetro. Um osmômetro foi utilizado para verificar a concentração osmótica do meio DEP. Passo 1 - Encaixe uma ponta de amostra no local do amostrador e carregue 20 μL de amostra. Passo 2 - Coloque o amostrador dentro do suporte operacional e abaixo do topo do berço. Passo 3 - Empurre todo o suporte operacional para baixo até que ele atinja uma parada positiva. Passo 4 - O instrumento executa o teste por aproximadamente 1 min e exibe o resultado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Conectividade do gerador de funções. Imagem da configuração experimental para testes de fadiga, incluindo o conjunto do dispositivo de teste e um gerador de funções. As almofadas de eletrodos ITO são conectadas ao gerador de funções por cabo de clipe BNC-para-jacaré através dos fios pré-soldados nos copos de pino Pogo pressionados na unidade superior do dispositivo de teste. O dispositivo microfluídico com dois canais paralelos independentes fica na unidade inferior do dispositivo de teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resposta da célula ao chaveamento liga-desliga. (A) On-off keying modulado onda senoidal para 1 h teste de fadiga: onda senoidal de 2 VRMS de amplitude a 3 MHz para ação eletrodeformação, frequência de modulação de 250 mHz resultando em 2 s de alongamento e 2 s de relaxamento. (B) Na fase On-Keying, as hemácias são esticadas devido à eletrodeformação; na fase Off-Keying, as hemácias são relaxadas. (C) A eletrodeformação de uma célula representativa mostra degradação gradual na deformação da membrana durante 1 h de estiramento cíclico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Caracterização da deformabilidade das hemácias pelo ImageJ. Passo 1 - Importe a imagem para um software de edição de imagem e converta-a em escala de cinza de 8 bits. Passo 2 - Ajuste o limite para converter imagens em binário. Passo 3 - Selecione as células com a ferramenta de varinha (rastreamento) e gerencie as seleções com o gerenciador de ROI. Passo 4 - Selecione as células para obter medidas para eixos maiores e menores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Redução da deformabilidade celular. Degradação gradual na deformabilidade das hemácias devido à eletrodeformação cíclica. A barra de erro mostra o desvio padrão (n = 69). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A modulação ASK OOK de uma onda senoidal indutora de força DEP pode ser usada para testar a fadiga mecânica de hemácias por um longo período de tempo. Neste protocolo, limitamos o teste de fadiga in vitro a 1 hora para prevenir os potenciais efeitos metabólicos adversos sobre a deformabilidade celular. Condições abrangentes de teste de fadiga podem ser programadas usando a técnica de eletrodeformação modulada por ASK. Parâmetros como frequência de carregamento, amplitude e taxa de carregamento podem ser programados. A frequência de carregamento pode ser programada para valores variáveis para determinar a dependência da fadiga na frequência de carregamento, bem como diferenças entre carregamento cíclico e carregamento estático13.
A magnitude do alongamento pode ser facilmente ajustada usando um nível de tensão diferente para pequenas ou grandes deformações. No entanto, ao usar níveis de alta tensão para incluir grandes deformações, nota-se que a eletrodeformação resultará em hemácias em forma de chama (Figura 6, passo 3). Isso pode introduzir erros ao ajustar as formas das células com elipses, que cortam as bordas pontiagudas das células. Nesta circunstância, especialmente quando se utiliza a eletrodeformação para extrair parâmetros viscoelásticos de cisalhamento da membrana, duas estratégias podem ser utilizadas: (i) o uso de um modelo computacional de formas celulares verdadeiras fornecerá resultados mais precisos do que o modelo analítico simples de formas elípticas; (ii) usar um nível de tensão menor para esticar as células para que as formas das células possam ser bem ajustadas com elipses.
No protocolo atual, a condutividade média foi de 0,04 S/m, que pode ser ajustada conforme a necessidade. Como o estiramento celular induzido pela eletrodeformação está relacionado com os valores reais do complexo fator Clausius Mossotti, a frequência da onda senoidal pode ser diferente dos 3 MHz selecionados. A chave é minimizar a tensão para induzir a eletrodeformação, mantendo um efeito de aquecimento Joule insignificante. Uma excitação elétrica ótima pode ser determinada usando a teoria DEP ou usando ferramentas computacionais para modelagem dielétrica de células, como My DEP11.
Deve-se notar que a imobilização celular não é necessária neste protocolo, pois as células submetidas à eletrodeformação estão inerentemente exibindo DEP positiva, que move as células para as bordas do eletrodo espontaneamente. Isso nos permite realizar testes em suspensões celulares e imobilizar todas as células interagindo com o eletrodo e simultaneamente esticando as células. Uma vez que o teste é feito, as células podem ser facilmente removidas do dispositivo, lavando o canal com o meio. A característica do protocolo atual, que o faz funcionar bem com células em suspensão, pode limitar sua aplicação para testar células aderentes. No entanto, podemos separar células aderentes do substrato usando produtos químicos como o ácido etilenodiaminotetracético. Como o teste pode ser projetado para ser concluído em um tempo relativamente curto, de minutos a 1 h, temos tempo suficiente para realizar testes de fadiga mecânica antes que as células se ancorem e se espalhem14.
No protocolo atual, foi utilizado um chip ITO comercialmente disponível com eletrodos interdigitados de banda de 100 μm. O projeto de eletrodos interdigitados é vantajoso para medir várias células ao mesmo tempo para a relação comprimento-área, pois as células são esticadas nas bordas dos eletrodos. O rendimento da medição também é dependente do campo de observação, onde o tamanho da célula e a deformabilidade estabelecem limitações na folga mínima dos eletrodos. A largura de banda dos eletrodos pode ser ainda mais diminuída para aumentar o número de células de observação para maior rendimento. Os materiais dos eletrodos podem ser outros metais, como titânio ou ouro; no entanto, a transparência dos materiais dos eletrodos pode ser uma escolha melhor, pois parte das membranas celulares pode ser bloqueada pelos eletrodos não transparentes. O teste ainda pode ser realizado se um modelo matemático relevante da célula, como um elipsoide13, puder ser usado durante o processamento de imagens.
Teoricamente, essas técnicas de eletrodeformação e eletrodeformação modulada por ASK podem atuar em outros tipos celulares, dadas as condições certas, por exemplo, condutividade média e excitações elétricas. Uma limitação é a quantidade de alongamento que podemos observar. A hemácia é um bom modelo celular por sua grande deformabilidade e natureza circulante. O protocolo atual tem sido aplicado para estudar hemácias humanas tanto na saúde quanto na doença e é prontamente equipado com um microambiente gasoso para estudar a fadiga hipóxica13,15.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pela NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (#1941655) e NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
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