Summary
Aquí se presenta un protocolo para las pruebas de fatiga mecánica en el caso de glóbulos rojos humanos utilizando un enfoque de electrodeformación de amplitud modulada. Este enfoque general se puede utilizar para medir los cambios sistemáticos en las características morfológicas y biomecánicas de las células biológicas en una suspensión de deformación cíclica.
Abstract
Los glóbulos rojos (RBC) son conocidos por su notable deformabilidad. Sufren repetidamente una deformación considerable al pasar a través de la microcirculación. La deformabilidad reducida se observa en los glóbulos rojos fisiológicamente envejecidos. Las técnicas existentes para medir la deformabilidad celular no se pueden utilizar fácilmente para medir la fatiga, la degradación gradual de las membranas celulares causada por cargas cíclicas. Presentamos un protocolo para evaluar la degradación mecánica en glóbulos rojos a partir de esfuerzos cortantes cíclicos utilizando electrodeformación basada en modulación por desplazamiento de amplitud (ASK) en un canal microfluídico. Brevemente, los electrodos interdigitados en el canal microfluídico se excitan con una corriente alterna de bajo voltaje a frecuencias de radio utilizando un generador de señales. Los glóbulos rojos en suspensión responden al campo eléctrico y exhiben dielectroforesis positiva (DEP), que mueve las células a los bordes del electrodo. Luego, las celdas se estiran debido a las fuerzas eléctricas ejercidas sobre las dos mitades de la celda, lo que resulta en un estiramiento uniaxial, conocido como electrodeformación. El nivel de esfuerzo cortante y la deformación resultante se pueden ajustar fácilmente cambiando la amplitud de la onda de excitación. Esto permite cuantificar la deformabilidad no lineal de los glóbulos rojos en respuesta a deformaciones pequeñas y grandes con un alto rendimiento. La modificación de la onda de excitación con la estrategia ASK induce electrodeformación cíclica con velocidades y frecuencias de carga programables. Esto proporciona una forma conveniente para la caracterización de la fatiga de los glóbulos rojos. Nuestro enfoque de electrodeformación modulada por ASK permite, por primera vez, una medición directa de la fatiga de los glóbulos rojos a partir de cargas cíclicas. Se puede utilizar como una herramienta para pruebas biomecánicas generales, para análisis de deformabilidad celular y fatiga en otros tipos de células y condiciones enfermas, y también se puede combinar con estrategias para controlar el microambiente de las células, como la tensión de oxígeno y las señales biológicas y químicas.
Introduction
Los glóbulos rojos (RBC) son las células más deformablesdel cuerpo humano. Su deformabilidad está directamente relacionada con su funcionalidad de transporte de oxígeno. Se ha encontrado que la deformabilidad reducida en los glóbulos rojos se correlaciona con la patogénesis de varios trastornos de los glóbulos rojos2. Las mediciones de deformabilidad nos han llevado a una mejor comprensión de las enfermedades relacionadas con los glóbulos rojos3. La vida útil normal de los glóbulos rojos puede variar de 70 a 140 días4. Por lo tanto, es importante medir cómo disminuye su deformabilidad junto con el proceso de envejecimiento, por ejemplo, su comportamiento a fatiga debido a los esfuerzos de cizallamiento cíclico3.
La medición de la deformabilidad de los glóbulos rojos con un alto rendimiento es un desafío debido a las fuerzas de escala de piconewton (~ 10-12 N) que se aplican a las celdas individuales. Durante la última década, se han desarrollado muchas tecnologías para medir la deformabilidad celular5. Las mediciones de deformación de los glóbulos rojos a nivel de una sola célula se pueden realizar mediante aspiración con pipeta y pinzas ópticas, mientras que los análisis a granel se realizan mediante ektacitometría de gradiente osmótico. Los análisis de ektacitometría proporcionan una gran cantidad de datos, lo que brinda la oportunidad de diagnosticar trastornos sanguíneos 6,7. La deformabilidad de los glóbulos rojos también se puede analizar utilizando la teoría viscoelástica mediante microscopía de fuerza atómica de sonda coloidal. En este método, se aplica el análisis computacional para estimar el módulo elástico de los glóbulos rojos, considerando tanto las respuestas dependientes del tiempo como las de estado estacionario. La deformabilidad de los glóbulos rojos individuales se puede medir utilizando el método de matriz de microcámaras de una sola célula. Este método analiza cada célula a través de la membrana y los marcadores fluorescentes citosólicos para proporcionar información sobre la deformabilidad de los glóbulos rojos y la distribución de las características celulares en poblaciones complejas de glóbulos rojos para detectar trastornos hematológicos8.
La fatiga es un factor clave en la degradación de las propiedades de los materiales de ingeniería y los biomateriales. Las pruebas de fatiga permiten un análisis cuantitativo de la integridad y longevidad de una estructura sometida a cargas cíclicas. El análisis de la fatiga en las células biológicas se ha visto obstaculizado durante mucho tiempo por la falta de un método general, fácilmente aplicable, de alto rendimiento y cuantitativo para la implementación de la deformación cíclica en las membranas celulares. Esto es posible con la utilización de técnicas de modulación de señales eléctricas y electrodeformación implementadas en un entorno microfluídico. La técnica de modulación por desplazamiento de amplitud (ASK) como modulación digital se aplica a través de la modulación de modulación On-Off (OOK) en este artículo. El concepto de modulación se refiere a la transmisión de señales digitales a través del canal, que requiere una señal portadora de onda sinusoidal para funcionar9. Los tiempos de encendido y apagado se pueden igualar. Bajo la codificación ON, los glóbulos rojos entran en un estado deformado mientras se exponen a una fuerza de electrodeformación externa (Fdep)10 creada por el campo eléctrico no uniforme. Bajo el OFF-keying, los glóbulos rojos están en su estado relajado. Observamos la fatiga de los glóbulos rojos, es decir, una degradación progresiva de su capacidad de estiramiento con el aumento de los ciclos de carga. La pérdida de deformabilidad inducida por la fatiga en los glóbulos rojos puede proporcionar información sobre el daño acumulado en la membrana durante la circulación sanguínea, lo que nos permite investigar más a fondo las conexiones entre la fatiga celular y los estados de enfermedad.
Aquí proporcionamos procedimientos paso a paso sobre cómo se implementan las pruebas de fatiga de los glóbulos rojos en un dispositivo microfluídico a través de la electrodeformación modulada por ASK y la configuración del sistema, como el dispositivo microfluídico, la carga mecánica y la obtención de imágenes microscópicas para la caracterización de la degradación gradual en la deformabilidad mecánica de los glóbulos rojos.
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Protocol
La sangre entera humana no identificada se obtuvo comercialmente. El trabajo con las muestras de sangre se realizó en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad utilizando protocolos aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad Atlántica de Florida.
1. Preparación del dispositivo microfluídico
- Pega con cinta adhesiva la oblea maestra de silicio SU-8 para el diseño del canal microfluídico en el interior de una placa de Petri de plástico de 14 cm y límpiala con gas N2 .
- Pesar 60 g de base de polidimetilsiloxano (PDMS) y 6 g de agente de curado PDMS en un vaso de papel. Mezcle las dos partes con una espátula de madera hasta que la mezcla tenga un color blanco turbio.
- Vierta la mezcla de PDMS en la placa de Petri de plástico que contiene la oblea de silicio. Coloque la placa de Petri en un desecador al vacío con una llave de paso de 3 vías. Gire la válvula de la llave de paso para conectar el vacío a la cámara del desecador para eliminar las burbujas de aire del PDMS.
- Vuelva a introducir aire en la cámara del desecador ajustando la válvula de llave de paso para conectar la cámara del desecador al ambiente en ciclos de aproximadamente 5 minutos. Repita hasta que se eliminen todas las burbujas de aire de las características de los canales.
- Coloque la placa de Petri dentro de un horno a 70 °C durante 4 h. Una vez transcurrido el tiempo, retire la placa de Petri, deje que se enfríe a temperatura ambiente y colóquela sobre un tapete de corte.
- Con un bisturí, corte la parte del PDMS que está por encima de la oblea de silicona. Coloque el PDMS recortado entre las dos hojas de película de envoltura de laboratorio. El espacio formado entre la hendidura del microcanal y la película semitransparente facilita la identificación de la ubicación del canal microfluídico, así como su respectiva entrada y salida.
- Con una cuchilla de afeitar, corte un canal individual del PDMS grande. Perfore un orificio de entrada de 3 mm y un orificio de salida de 1,5 mm con punzones de biopsia correspondientes a los dos tamaños (Figura 1A).
- Coloque el canal perforado, con el lado del canal hacia arriba, en un portaobjetos de vidrio limpio. Coloque un sustrato de vidrio de 20 mm x 15 mm que contenga electrodos interdigitados de óxido de indio y estaño (ITO) de película delgada en el mismo portaobjetos de vidrio con los electrodos hacia arriba.
- Coloque suavemente el portaobjetos de vidrio con PDMS y sustrato en un limpiador de plasma. Cierre la válvula de gas, encienda el interruptor de la bomba y espere 2 minutos para obtener una lectura del sensor de 600 a 800 mTorr.
- Encienda el interruptor de encendido y espere 30 segundos. Gire la perilla de alimentación de RF de baja a alta y espere 1 minuto.
- Luego, invierta la secuencia girando la perilla de RF a la posición baja, el interruptor de encendido a OFF, el interruptor de la bomba a OFF y abriendo la válvula de gas.
- Inmediatamente después de abrir la cámara del limpiador de plasma, levante y gire el PDMS de modo que el lado del canal quede hacia abajo (180°). Coloque el canal en la parte superior del sustrato ITO. El proceso de vinculación ha comenzado.
- Con unas pinzas, presione suavemente las esquinas del PDMS durante unos 3 s. Evite presionar sobre el canal en sí.
NOTA: El proceso de unión ocurre espontáneamente al entrar en contacto físico entre las dos superficies tratadas. - Cargue el medio de cebado en una jeringa de 1 ml con una aguja de 23 G. Humedece con cuidado el canal insertando la aguja directamente en el pocillo de entrada y luego soltando el medio. Opere lentamente. No introduzca burbujas de aire. Incubar durante al menos 3 min.
- Retire el medio primario con una punta de pipeta de 10 μL. Lave el canal con medio DEP 3 veces insertando el medio DEP en el canal. Mantenga el canal húmedo en todo momento.
2. Accesorio de prueba
NOTA: El accesorio de prueba está diseñado con software CAD 3D e incluye una unidad de carcasa base y una unidad superior (Figura 1B). Luego, se fabrica utilizando una fresadora CNC de 3 ejes con un límite de tolerancia estándar de alrededor de ± dimensión de 0.005 pulgadas del accesorio de prueba se verifica con un calibrador electrónico (no se muestra). No se requiere esterilidad del accesorio para las pruebas biomecánicas in vitro.
- Cables de soldadura previa en los extremos de la copa de soldadura de dos juegos de conectores de pistón de resorte.
- Inserte los conectores del pistón de resorte en la unidad superior y cree una unión permanente agregando una gota de pegamento epoxi.
3. Preparación del tampón de trabajo de electrodeformación
- Para preparar el medio DEP, pesar 12,75 g de sacarosa y 0,45 g de dextrosa con una báscula.
- Disuelva ambos polvos en un solo recipiente con 150 ml de agua desionizada (DI) y 3,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Con un probador de conductividad de rango bajo, mida la conductividad y asegúrese de que sea de 0,04 S/m (Figura 2).
NOTA: Se puede utilizar un valor de conductividad diferente, lo que podría cambiar el signo y la magnitud de la fuerza DEP resultante11. La electrodeformación, sin embargo, requiere una fuerza DEP positiva. - Con un osmómetro, confirme que la osmolaridad está dentro del rango normal del plasma sanguíneo, de 275 a 295 mOsm/kg de agua (Figura 3). Conservar a 4 °C. El medio DEP ya está preparado.
- En un tubo de 15 ml, disolver 0,5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en 10 ml del medio DEP. Homogeneizar. El medio principal del dispositivo ya está preparado.
4. Preparación de la suspensión celular
- Lavar 20 μL de sangre entera centrifugando la sangre con 1 mL de PBS a 268 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender los glóbulos rojos en 1 ml de PBS. Pipetear suavemente para mezclar. Lavar los glóbulos rojos durante 3 min a 268 x g y desechar el sobrenadante.
- Extraiga 5 μl de gránulo de glóbulos rojos con una punta de micropipeta de 10 μl y dispense completamente en 1 ml del medio DEP. Lavar las células centrifugando a 268 x g durante 3 min.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los glóbulos rojos en 1 mL de medio DEP. Pipetear suavemente para mezclar.
- Lavar los glóbulos rojos durante 3 min a 268 x g y desechar el sobrenadante. Pipetear 2 μL de gránulo de RBC en 500 μL de medio DEP. La suspensión celular se prepara ahora con una concentración dentro de un rango de 62 - 104 células/μL12, que puede confirmarse utilizando un portaobjetos de recuento celular estándar.
5. Configuración de electrodeformación y pruebas de fatiga
- Coloque el dispositivo microfluídico en la parte inferior del dispositivo de prueba. Alinee la parte superior del accesorio con el dispositivo y ensamble las dos partes con dos juegos de tornillos y tuercas de nailon (Figura 4).
- Coloque el dispositivo de prueba en la platina del microscopio. Localice un conjunto deseado de electrodos bajo el microscopio.
- Conecte el par correspondiente de cables de electrodos que coincidan con el conjunto de electrodos ubicado al terminal de salida del generador de funciones (Figura 4).
- Retire 5 μL del medio DEP de la entrada de 3 mm del canal microfluídico. Cargue lentamente 5 μL de la suspensión celular en la entrada con una punta de pipeta de 10 μL.
- Deje que las células se asienten durante 1 minuto. Si es necesario, agregue un medio DEP adicional a la entrada para empujar las celdas hacia el canal.
- Observe el canal con un aumento de 20x. Utilice un filtro de paso de banda de 414/46 nm para mejorar el contraste de las imágenes.
- Presione el botón Sinusoidal y defina una onda sinusoidal con una amplitudRMS de 2 V a una frecuencia de 3 MHz. Presione el botón Mod para habilitar la modulación. Cambie el modo de onda a ASK pulsando la opción Tipo .
- Ajuste la frecuencia de modulación a 250 mHz, que corresponde a un período de carga-descarga de 4 s (Figura 5A). Encienda la salida del generador de funciones.
- Graba un vídeo de 1 minuto cada 10 minutos a 30 fotogramas por segundo (fps).
6. Caracterización de la deformación de los glóbulos rojos
- Usando una aplicación de edición de video, abra archivos .avi grabados en el paso anterior presionando Ctrl + O. Utilice la línea de tiempo para elegir un fotograma de interés y establezca los fotogramas inicial y final de la selección para que sean idénticos pulsando la tecla Inicio y, a continuación, la tecla Fin del teclado.
- Exporte el marco de la imagen. Seleccione el formato de salida que será JPEG y presione OK.
- Abra la aplicación ImageJ y cargue las imágenes guardadas en el paso anterior. Comience por establecer las medidas necesarias pulsando Analizar > Establecer medidas y asegurándose de que las casillas de verificación de Área, Perímetro y Elipse de ajuste estén marcadas. Presione OK.
- A continuación, convierta la imagen a escala de grises eligiendo Imagen > Tipo > 8 bits.
- A continuación, convierta la imagen a binaria utilizando Imagen > Ajustar > Umbral. En el cuadro de diálogo Umbral, ajuste los dos controles deslizantes según sea necesario. Presione Aplicar y, a continuación, cierre el cuadro de diálogo Umbral.
- Elija Analizar > herramientas > Administrador de ROI. En el Administrador de ROI, presione la casilla de verificación Mostrar todo. No cierre esta casilla.
- Seleccione la herramienta Varita (calco), seleccione una celda aplicable en la imagen y presione T en el teclado. La celda seleccionada estará numerada. Se puede volver a seleccionar una nueva celda. Seleccione todas las celdas aplicables que se van a medir. Las células aplicables se identifican como aquellas que están aisladas de otras células. El número de estas células podría oscilar entre 50 y 200 en un solo campo de visión.
- Regrese al cuadro Administrador de ROI y presione Medir. Se abrirá el cuadro Resultados. Las columnas etiquetadas como Mayor y Menor son las longitudes de los ejes mayor y menor de la elipse ajustada (en píxeles), respectivamente. Elija Archivo > Guardar como para exportar las medidas como un archivo con formato CSV.
- Utilizando cualquier software de análisis computacional adecuado, calcule el cociente de Mayor y Menor.
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Representative Results
Cuando la suspensión celular se cargó en el canal microfluídico, se observó una distribución relativamente uniforme de las células. Tras la salida de la señal (por ejemplo, una onda sinusoidal simple o una fase de enclave de ASK) del generador de funciones, los electrodos interdigitados de película delgada generaron un campo eléctrico de corriente alterna no uniforme. Las células suspendidas respondieron espontáneamente a esta excitación eléctrica y exhibieron un comportamiento DEP positivo, es decir, se movieron hacia los bordes de los electrodos con mayor intensidad de campo. En consecuencia, las celdas se alinearon a lo largo de los bordes de los electrodos y se estiraron debido a la electrodeformación. En la fase de enclavedo, los glóbulos rojos se estiran debido a la electrodeformación; en la fase de descodificación, los glóbulos rojos se relajan (Figura 5B). Mantener la discreción celular es importante en este protocolo. Utilizando el factor de dilución como se indica en este protocolo, la suspensión celular de los eritrocitos normales se situó en un rango de 62 a 104 células/μL. A una concentración dentro de este rango, pudimos obtener un alto rendimiento de medición celular al tiempo que minimizamos la acumulación de células debido al efecto DEP positivo.
Al realizar un seguimiento de los glóbulos rojos individuales durante la prueba de fatiga de 1 h, observamos una disminución gradual de la deformación celular (Figura 5C). La deformabilidad se cuantificó mediante la relación de los ejes mayor y menor de una elipse que se utilizó para ajustar los glóbulos rojos individuales, utilizando un software de imágenes de código abierto (Figura 6). Se abrieron imágenes de interés en el programa de software. No fue necesario calibrar el tamaño de píxel en la escala de longitud para la medición de la deformabilidad. Los datos numéricos se pueden analizar y trazar con un software.
En este protocolo, los datos de deformación de los glóbulos rojos se recogieron en un intervalo de tiempo de 10 min durante 1 h de carga mecánica cíclica utilizando el ASK de 250 mHz para modular la onda sinusoidal de 2 VRMS-3 MHz. Se observó una reducción gradual de la deformabilidad celular. Se encontró que la pérdida total de deformabilidad para los glóbulos rojos en esta condición de prueba de fatiga fue del 18% (Figura 7).
Figura 1: Dispositivo microfluídico para electrodeformación. (A) Esquema del canal microfluídico con orificios perforados de biopsia de 1,5 mm y 3 mm para salida y entrada de muestra, respectivamente. (B) Vista de despiece del conjunto del dispositivo de prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Funcionamiento del medidor de conductividad. Se utilizó un medidor de conductividad para verificar que la conductividad del medio DEP era de 0,04 S/m. Las sondas de detección en la base del medidor se sumergen en la muestra para obtener una lectura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Funcionamiento del osmómetro. Se utilizó un osmómetro para verificar la concentración osmótica del medio DEP. Paso 1 - Coloque una punta de muestra en su lugar en el muestreador y cargue 20 μL de muestra. Paso 2 - Coloque el muestreador dentro de la base de operación y debajo de la parte superior de la base. Paso 3 - Empuje toda la base de operación hacia abajo hasta que alcance una parada positiva. Paso 4 - El instrumento ejecuta la prueba durante aproximadamente 1 minuto y muestra el resultado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Conectividad del generador de funciones. Imagen de la configuración experimental para las pruebas de fatiga, incluido el conjunto del dispositivo de prueba y un generador de funciones. Las almohadillas de electrodos ITO se conectan al generador de funciones mediante un cable de pinza BNC a cocodrilo a través de los cables presoldados en las copas de clavijas Pogo presionadas en la unidad superior del accesorio de prueba. El dispositivo microfluídico con dos canales paralelos independientes se encuentra en la unidad inferior del dispositivo de prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Respuesta de la célula a la modulación on-off. (A) Onda sinusoidal modulada on-off keying para pruebas de fatiga de 1 h: onda sinusoidal de 2 VRMS de amplitud a 3 MHz para la acción de electrodeformación, frecuencia de modulación de 250 mHz que da como resultado 2 s de estiramiento y 2 s de relajación. (B) En la fase de enclave, los glóbulos rojos se estiran debido a la electrodeformación; en la fase Off-Keying, los glóbulos rojos se relajan. (C) La electrodeformación de una célula representativa muestra una degradación gradual en la deformación de la membrana durante 1 h de estiramiento cíclico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Caracterización de la deformabilidad de los glóbulos rojos mediante ImageJ. Paso 1 - Importa la imagen a un software de edición de imágenes y conviértela en escala de grises de 8 bits. Paso 2 - Ajusta el umbral para convertir las imágenes a binarias. Paso 3 - Seleccione las celdas con la herramienta de varita (trazado) y gestione las selecciones con el gestor de ROI. Paso 4 - Seleccione las celdas para obtener las medidas de los ejes mayor y menor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Reducción de la deformabilidad celular. Degradación gradual de la deformabilidad de los glóbulos rojos debido a la electrodeformación cíclica. La barra de error muestra la desviación estándar (n = 69). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La modulación ASK OOK de una onda sinusoidal inductora de fuerza DEP se puede utilizar para probar la fatiga mecánica de los glóbulos rojos durante un largo período de tiempo. En este protocolo, limitamos las pruebas de fatiga in vitro a 1 hora para prevenir los posibles efectos metabólicos adversos sobre la deformabilidad celular. Se pueden programar condiciones completas de prueba de fatiga utilizando la técnica de electrodeformación modulada por ASK. Se pueden programar parámetros como la frecuencia de carga, la amplitud y la velocidad de carga. La frecuencia de carga se puede programar a valores variables para determinar la dependencia de la fatiga con la frecuencia de carga, así como las diferencias entre la carga cíclica y la carga estática13.
La magnitud de estiramiento se puede ajustar fácilmente utilizando un nivel de voltaje diferente para deformaciones pequeñas o grandes. Sin embargo, cuando se utilizan niveles de alto voltaje para incluir una gran deformación, se observa que la electrodeformación dará como resultado glóbulos rojos con forma de llama (Figura 6, paso 3). Esto puede introducir errores al ajustar las formas de celda con elipses, lo que corta los bordes puntiagudos de las celdas. En esta circunstancia, especialmente cuando se utiliza la electrodeformación para extraer los parámetros de viscoelasticidad del cizallamiento de la membrana, se pueden utilizar dos estrategias: (i) el uso de un modelo computacional de formas celulares verdaderas proporcionará resultados más precisos que el modelo analítico simple de forma elíptica; (ii) usar un nivel de voltaje más pequeño para estirar las celdas de modo que las formas de las celdas puedan ajustarse bien con elipses.
En el protocolo actual, la conductividad del medio fue de 0,04 S/m, que se puede ajustar según sea necesario. Como el estiramiento celular inducido por electrodeformación está relacionado con los valores reales del factor complejo de Clausius Mossotti, la frecuencia de onda sinusoidal puede ser diferente de los 3 MHz seleccionados. La clave es minimizar el voltaje para inducir la electrodeformación mientras se mantiene un efecto de calentamiento Joule insignificante. Se puede determinar una excitación eléctrica óptima utilizando la teoría DEP o utilizando herramientas computacionales para el modelado dieléctrico de células, como My DEP11.
Cabe señalar que la inmovilización celular no es necesaria en este protocolo, ya que las células que se someten a electrodeformación exhiben inherentemente DEP positivo, que mueve las células a los bordes del electrodo de forma espontánea. Esto nos permite realizar pruebas en suspensiones celulares e inmovilizar todas las celdas que interactúan con el electrodo y simultáneamente estirar las celdas. Una vez realizada la prueba, las células se pueden eliminar fácilmente del dispositivo enjuagando el canal con el medio. La característica del protocolo actual, que hace que funcione bien con células en suspensión, puede limitar su aplicación para probar células adherentes. Sin embargo, podemos separar las células adherentes del sustrato utilizando productos químicos como el ácido etilendiaminotetraacético. Dado que la prueba puede diseñarse para completarse en un tiempo relativamente corto, de minutos a 1 h, tenemos tiempo suficiente para realizar pruebas de fatiga mecánica antes de que las células se anclean y se extiendan14.
En el protocolo actual, se utilizó un chip ITO disponible comercialmente con electrodos interdigitados de banda de 100 μm. El diseño de electrodos interdigitados es ventajoso para medir varias celdas a la vez para la relación longitud-área, ya que las celdas se estiran en los bordes de los electrodos. El rendimiento de la medición también depende del campo de observación, donde el tamaño de la celda y la deformabilidad establecen limitaciones en el espacio mínimo de los electrodos. El ancho de banda de los electrodos se puede reducir aún más para aumentar el número de celdas de observación para un mayor rendimiento. Los materiales de los electrodos pueden ser otros metales, como el titanio o el oro; Sin embargo, la transparencia de los materiales de los electrodos puede ser una mejor opción, ya que parte de las membranas celulares pueden ser bloqueadas por los electrodos no transparentes. La prueba aún se puede realizar si se puede usar un modelo matemático de forma relevante de la célula, como un elipsoide13, durante el procesamiento de imágenes.
Teóricamente, estas técnicas de electrodeformación y electrodeformación modulada por ASK pueden funcionar en otros tipos de células, dadas las condiciones adecuadas, por ejemplo, conductividad media y excitaciones eléctricas. Una limitación es la cantidad de elongación que podemos observar. Los glóbulos rojos son un buen modelo celular por su gran deformabilidad y naturaleza circulante. El protocolo actual se ha aplicado para estudiar los glóbulos rojos humanos tanto en la salud como en la enfermedad y está fácilmente equipado con un microambiente gaseoso para estudiar la fatiga hipóxica13,15.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido financiada por NSF/CMMI Mecanobiología de Portadores Artificiales de Oxígeno Basados en Hemoglobina (#1941655) y NSF/CMMI Análisis Dinámico y de Fatiga de Glóbulos Rojos Sanos y Enfermos (#1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
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