Summary
Burada, genlik modülasyonlu bir elektrodeformasyon yaklaşımı kullanan insan kırmızı kan hücreleri durumunda mekanik yorulma testi için bir protokol sunulmaktadır. Bu genel yaklaşım, döngüsel deformasyondan kaynaklanan bir süspansiyondaki biyolojik hücrelerin morfolojik ve biyomekanik özelliklerindeki sistematik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Kırmızı kan hücreleri (RBC'ler) olağanüstü deforme olabilirlikleri ile bilinir. Mikro sirkülasyondan geçerken tekrar tekrar önemli deformasyona uğrarlar. Fizyolojik olarak yaşlanmış eritrositlerde azalmış deformabilite görülür. Hücre deformasyonunu ölçmek için mevcut teknikler, döngüsel yüklerin neden olduğu hücre zarlarındaki kademeli bozulma olan yorgunluğu ölçmek için kolayca kullanılamaz. Mikroakışkan bir kanalda genlik kaydırmalı anahtarlama (ASK) modülasyonu tabanlı elektrodeformasyon kullanarak döngüsel kesme gerilmelerinden kaynaklanan RBC'lerdeki mekanik bozunmayı değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Kısaca, mikroakışkan kanaldaki sayısallaştırılmış elektrotlar, bir sinyal üreteci kullanılarak radyo frekanslarında düşük voltajlı bir alternatif akımla uyarılır. Süspansiyondaki RBC'ler elektrik alanına tepki verir ve hücreleri elektrot kenarlarına hareket ettiren pozitif dielektroforez (DEP) sergiler. Hücreler daha sonra iki hücre yarısına uygulanan elektriksel kuvvetler nedeniyle gerilir ve elektrodeformasyon olarak bilinen tek eksenli gerilmeye neden olur. Kesme gerilimi seviyesi ve ortaya çıkan deformasyon, uyarma dalgasının genliği değiştirilerek kolayca ayarlanabilir. Bu, yüksek verimde küçük ve büyük deformasyonlara yanıt olarak RBC'lerin doğrusal olmayan deforme olabilirliğinin ölçülmesini sağlar. Uyarma dalgasının ASK stratejisi ile değiştirilmesi, programlanabilir yükleme hızları ve frekansları ile döngüsel elektrodeformasyonu indükler. Bu, RBC yorgunluğunun karakterizasyonu için uygun bir yol sağlar. ASK modülasyonlu elektrodeformasyon yaklaşımımız, ilk kez, döngüsel yüklerden kaynaklanan RBC yorgunluğunun doğrudan ölçülmesini sağlar. Genel biyomekanik testler için, diğer hücre tiplerinde ve hastalıklı durumlarda hücre deforme olabilirliği ve yorgunluğunun analizi için bir araç olarak kullanılabilir ve ayrıca oksijen gerilimi ve biyolojik ve kimyasal ipuçları gibi hücrelerin mikro çevresini kontrol etme stratejileri ile birleştirilebilir.
Introduction
Kırmızı kan hücreleri (RBC'ler) insan vücudundaki en çok deforme olabilen hücrelerdir1. Deforme olmaları, oksijen taşıma işlevleriyle doğrudan ilişkilidir. RBC'lerde azalmış deformabilitenin çeşitli RBC bozukluklarının patogenezi ile ilişkili olduğu bulunmuştur2. Deformabilite ölçümleri, RBC ile ilişkili hastalıkları daha iyi anlamamızı sağlamıştır3. RBC'lerin normal ömrü 70 ila 140 günarasında değişebilir 4. Bu nedenle, yaşlanma süreciyle birlikte deforme olabilirliklerinin nasıl azaldığını, örneğin döngüsel kayma gerilmelerinden kaynaklanan yorulma davranışlarınıölçmek önemlidir 3.
RBC'nin yüksek verimde deforme olabilirliğini ölçmek, tek tek hücrelere uygulanan pikonewton ölçek kuvvetleri (~ 10-12 N) nedeniyle zordur. Son on yılda, hücre deformabilitesini ölçmek için birçok teknoloji geliştirilmiştir5. RBC'lerin tek hücre seviyesindeki deformasyon ölçümleri pipet aspirasyonu ve optik cımbız ile yapılabilirken, toplu analizler ozmotik gradyan ektasitometri ile yapılır. Ektasitometri analizleri, kan bozukluklarını teşhis etme fırsatı sağlayan bol miktarda veri sağlar 6,7. RBC'lerin deforme olabilirliği, kolloid prob atomik kuvvet mikroskobu ile viskoelastik teori kullanılarak da analiz edilebilir. Bu yöntemde, hem zamana bağlı hem de kararlı durum tepkileri dikkate alınarak RBC'lerin elastik modülünü tahmin etmek için hesaplamalı analiz uygulanır. Bireysel RBC'lerin deforme olabilirliği, tek hücreli mikro odacıklı dizi yöntemi kullanılarak ölçülebilir. Bu yöntem, hematolojik bozuklukları tespit etmek için RBC deformabilitesi ve karmaşık RBC popülasyonlarındaki hücresel özelliklerin dağılımı hakkında bilgi sağlamak için her hücreyi membran ve sitozolik floresan belirteçler aracılığıyla analiz eder8.
Yorulma, mühendislik malzemelerinin ve biyomalzemelerin özelliklerinin bozulmasında önemli bir faktördür. Yorulma testi, döngüsel yüklemeye maruz kalan bir yapının bütünlüğünün ve uzun ömürlülüğünün nicel bir analizini sağlar. Biyolojik hücrelerde yorgunluğun analizi, hücre zarlarında döngüsel deformasyonun uygulanması için genel, kolayca uygulanabilir, yüksek verim ve kantitatif bir yöntemin olmaması nedeniyle uzun süredir engellenmiştir. Bu, mikroakışkan bir ortamda uygulanan elektrik sinyali modülasyonu ve elektrodeformasyon tekniklerinin kullanılmasıyla mümkündür. Dijital modülasyon olarak genlik kaydırmalı anahtarlama (ASK) tekniği, bu makalede On-Off anahtarlama (OOK) modülasyonu ile uygulanmaktadır. Anahtarlama kavramı,9 işlevi için bir sinüs dalgası taşıyıcı sinyali gerektiren kanal üzerinden dijital sinyallerin iletimini ifade eder. AÇIK ve KAPALI süreleri eşit olarak ayarlanabilir. AÇMA AÇMA altında, RBC'ler, düzgün olmayan elektrik alanı tarafından oluşturulan harici bir elektrodeformasyon kuvvetine (Fdep)10 maruz kaldıklarında deforme bir duruma girerler. OFF-key altında, RBC'ler rahat durumdadır. RBC'lerin yorgunluğunu, yani artan yükleme döngüleri ile esneme yeteneklerinde aşamalı bir bozulma gözlemliyoruz. RBC'lerde yorgunluğa bağlı deformabilite kaybı, kan dolaşımı sırasında biriken membran hasarı hakkında fikir verebilir ve hücre yorgunluğu ile hastalık durumları arasındaki bağlantıları daha fazla araştırmamızı sağlar.
Burada, ASK modülasyonlu elektrodeformasyon yoluyla bir mikroakışkan cihazda RBC'lerin yorulma testinin nasıl uygulandığına ve RBC'lerin mekanik deformasyonundaki kademeli bozunmanın karakterizasyonu için mikroakışkan cihaz, mekanik yükleme ve mikroskobik görüntüleme gibi sistem ayarlarına ilişkin adım adım prosedürler sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kimliği belirsiz insan tam kanı ticari olarak elde edildi. Kan örneklerini içeren çalışma, Florida Atlantic Üniversitesi'ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak bir biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuvarında gerçekleştirildi.
1. Mikroakışkan cihaz hazırlığı
- Mikroakışkan kanal tasarımı için SU-8 ana silikon gofreti 14 cm'lik plastik bir Petri kabının içine bantlayın veN2 gazıyla temizleyin.
- Bir kağıt kapta 60 g polidimetilsiloksan (PDMS) bazı ve 6 g PDMS kürleme maddesi tartın. Karışım bulanık beyaz bir renk alana kadar tahta bir spatula kullanarak iki parçayı karıştırın.
- PDMS karışımını silikon gofret içeren plastik Petri kabına dökün. Petri kabını 3 bir musluklu vakumlu bir desikatöre yerleştirin. PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için vakumu kurutucu odasına bağlamak için vananın valfini çevirin.
- Desikatör haznesini yaklaşık 5 dakikalık döngülerde ortama bağlamak için vana valfini ayarlayarak desikatör haznesine yeniden hava verin. Kanalların özelliklerinden tüm hava kabarcıkları çıkana kadar tekrarlayın.
- Petri kabını 70 °C'de 4 saat fırına koyun. Zaman geçtikten sonra Petri kabını çıkarın, oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve bir kesme matının üzerine koyun.
- Bir neşter kullanarak, PDMS'nin silikon gofretin üzerindeki kısmını kesin. Kesik PDMS'yi iki laboratuvar sarma filmi tabakası arasına yerleştirin. Mikrokanalın girintisi ile yarı saydam film arasında oluşan boşluk, mikroakışkan kanalın konumunun yanı sıra ilgili giriş ve çıkışının tanımlanmasını kolaylaştırır.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak, büyük PDMS'den ayrı bir kanal kesin. İki boyuta göre biyopsi zımbaları kullanarak 3 mm'lik bir giriş deliği ve 1.5 mm'lik bir çıkış deliği açın (Şekil 1A).
- Delikli kanalı, kanal tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir cam kızak üzerine yerleştirin. İnce film İndiyum Kalay Oksit (ITO) interdigitated elektrotlar içeren 20 mm x 15 mm'lik bir cam alt tabakayı, elektrotlar yukarı bakacak şekilde aynı cam slayt üzerine yerleştirin.
- PDMS ve alt tabaka ile cam sürgüyü yavaşça bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Gaz vanasını kapatın, pompa anahtarını AÇIN ve 600 - 800 mTorr'luk bir sensör okuması elde etmek için 2 dakika bekleyin.
- Güç anahtarını AÇIN ve 30 saniye bekleyin. RF güç düğmesini düşükten yükseğe çevirin ve 1 dakika bekleyin.
- Ardından, RF düğmesini düşük, güç anahtarını KAPALI, pompa anahtarını KAPALI konuma getirerek ve gaz vanasını açarak sırayı tersine çevirin.
- Plazma temizleyicinin haznesini açtıktan hemen sonra, PDMS'yi kanal tarafı aşağı bakacak şekilde (180°) kaldırın ve döndürün. Kanalı ITO alt tabakasının üstüne yerleştirin. Yapıştırma işlemi başladı.
- Cımbız kullanarak, PDMS'nin köşelerine yaklaşık 3 saniye boyunca hafifçe bastırın. Kanalın kendisine bastırmaktan kaçının.
NOT: Yapıştırma işlemi, işlem görmüş iki yüzey arasındaki fiziksel temas üzerine kendiliğinden gerçekleşir. - Hazırlama ortamını 23 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin. İğneyi doğrudan girişe sokarak ve ardından ortamı serbest bırakarak kanalı dikkatlice ıslatın. Yavaş çalıştırın. Hava kabarcıkları sokmayın. En az 3 dakika inkübe edin.
- 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak ana ortamı çıkarın. DEP ortamını kanala sokarak kanalı DEP ortamıyla 3 kez yıkayın. Kanalı her zaman ıslak tutun.
2. Test fikstürü
NOT: Test fikstürü, 3D CAD yazılımı kullanılarak tasarlanmıştır ve bir taban muhafaza ünitesi ve bir üst ünite içerir (Şekil 1B). Daha sonra, standart tolerans sınırı yaklaşık ± olan 3 eksenli bir CNC freze makinesi kullanılarak üretilir test fikstürünün boyutu elektronik bir kumpas (gösterilmemiştir) kullanılarak kontrol edilir. İn vitro biyomekanik test için fikstürün sterilitesi gerekli değildir.
- Telleri iki set yaylı piston konektörünün lehim kabı uçlarına önceden lehimleyin.
- Yaylı piston konektörlerini üst üniteye yerleştirin ve bir damla epoksi yapıştırıcı ekleyerek kalıcı bir yapıştırma oluşturun.
3. Elektrodeformasyon çalışma tamponunun hazırlanması
- DEP ortamını hazırlamak için, bir ölçek kullanarak 12.75 g sakaroz ve 0.45 g dekstroz tartın.
- Her iki tozu da 150 mL deiyonize (DI) su ve 3.5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren tek bir kapta çözün.
- Düşük aralıklı bir iletkenlik test cihazı kullanarak iletkenliği ölçün ve 0,04 S/m olduğundan emin olun (Şekil 2).
NOT: Ortaya çıkan DEP kuvvetinin11 işaretini ve büyüklüğünü değiştirebilecek farklı bir iletkenlik değeri kullanılabilir. Bununla birlikte, elektrodeformasyon, pozitif bir DEP kuvveti gerektirir. - Bir ozmolik kullanarak, ozmolaritenin kan plazmasının normal aralığında, 275 ila 295 mOsm/kg su içinde olduğunu doğrulayın (Şekil 3). 4 °C'de saklayın. DEP ortamı artık hazırlanmıştır.
- 15 mL'lik bir tüpte, 0.5 g sığır serum albüminini (BSA) 10 mL DEP ortamında çözün. İyice karıştırın. Cihazın ana ortamı şimdi hazırlanmıştır.
4. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
- Kanı 1 mL PBS ile 268 x g'da 3 dakika santrifüj ederek 20 μL tam kanı yıkayın. Süpernatanı atın.
- RBC'leri 1 mL PBS'de yeniden askıya alın. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin. RBC'leri 268 x g'da 3 dakika yıkayın ve süpernatanı atın.
- 10 μL'lik bir mikropipet ucu kullanarak 5 μL RBC peletini çıkarın ve 1 mL DEP ortamına tamamen dağıtın. Hücreleri 268 x g'da santrifüjleyerek 3 dakika yıkayın.
- Süpernatanı atın ve RBC'leri 1 mL DEP ortamında yeniden süspanse edin. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin.
- RBC'leri 268 x g'da 3 dakika yıkayın ve süpernatanı atın. 2 μL RBC peletini 500 μL DEP ortamına pipetleyin. Hücre süspansiyonu şimdi 62 - 104 hücre/μL12 aralığında bir konsantrasyonla hazırlanır ve bu konsantrasyon standart bir hücre sayım slaytı kullanılarak doğrulanabilir.
5. Elektrodeformasyon kurulumu ve yorulma testi
- Mikroakışkan cihazı test fikstürünün alt kısmına yerleştirin. Armatürün üst kısmını cihaza hizalayın ve iki set naylon vida ve somun kullanarak iki parçayı birleştirin (Şekil 4).
- Test fikstürünü mikroskop tablasına yerleştirin. Mikroskop altında istediğiniz bir elektrot setini bulun.
- Bulunan elektrot setiyle eşleşen ilgili elektrot kablosu çiftini fonksiyon üretecinin çıkış terminaline bağlayın (Şekil 4).
- Mikroakışkan kanalın 5 mm girişinden 3 μL DEP ortamını çıkarın. 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 5 μL hücre süspansiyonunu yavaşça girişe yükleyin.
- Hücrelerin 1 dakika oturmasına izin verin. Gerekirse, hücreleri kanala itmek için girişe ek bir DEP ortamı ekleyin.
- Kanalı 20x büyütme altında gözlemleyin. Görüntülemenin kontrastını artırmak için 414/46 nm bant geçiren filtre kullanın.
- Sinüs düğmesine basın ve 2 MHz frekansında 3 VRMS genliğine sahip bir sinüs dalgası tanımlayın. Modülasyonu etkinleştirmek için Mod düğmesine basın. Tip seçeneğine basarak dalga modunu ASK olarak değiştirin.
- Modülasyon frekansını, 250 s'lik bir yükleme-boşaltma süresine karşılık gelen 4 mHz'e ayarlayın (Şekil 5A). Fonksiyon üretecinin çıkışını AÇIN.
- Her 10 dakikada bir saniyede 30 kare (fps) hızında 1 dakikalık bir video kaydedin.
6. RBC deformasyonunun karakterizasyonu
- Bir video düzenleme uygulaması kullanarak, önceki adımda kaydedilen .avi dosyalarını Ctrl+O tuşlarına basarak açın. İlgilendiğiniz bir kareyi seçmek için zaman çizelgesini kullanın ve Ana Ekran tuşuna ve ardından klavyede Bitir tuşuna basarak seçimin başlangıç ve bitiş karelerini aynı olacak şekilde ayarlayın.
- Görüntü çerçevesini dışa aktarın. JPEG olacak çıktı formatını seçin ve OK tuşuna basın.
- ImageJ uygulamasını açın ve önceki adımda kaydedilen görüntüleri yükleyin. Analyze > Set Measurement'a basarak ve Area, Perimeter (Çevre ) ve Fit Elips (Elips'e Sığdır ) onay kutularının işaretli olduğundan emin olarak gerekli ölçümleri ayarlayarak başlayın. Tamam'a basın.
- Ardından, Görüntü > Türü > 8 bit'i seçerek görüntüyü gri tonlamaya dönüştürün.
- Ardından, Görüntü > Eşik Ayarlama'yı kullanarak görüntüyü ikiliye dönüştürün >. Eşik iletişim kutusunda, iki kaydırıcıyı gerektiği gibi ayarlayın. Apply (Uygula ) düğmesine basın ve ardından Threshold (Eşik) iletişim kutusunu kapatın.
- ROI Yöneticisi> Analiz > Araçları'nı seçin. ROI Yöneticisi'nde, Tümünü Göster etiketli onay kutusuna basın. Bu kutuyu kapatmayın.
- Değnek (izleme) Aracı'nı seçin, görüntüde uygun bir hücre seçin ve klavyede T tuşuna basın. Seçilen hücre numaralandırılacaktır. Yeni bir hücre tekrar seçilebilir. Ölçülecek tüm uygun hücreleri seçin. Uygulanabilir hücreler, diğer hücrelerden izole edilenler olarak tanımlanır. Bu hücrelerin sayısı tek bir görüş alanında 50 ila 200 arasında değişebilir.
- ROI Yöneticisi kutusuna dönün ve Ölç'e basın. Bu, Sonuçlar kutusunu açar. Major (Büyük) ve Minor (Minör) etiketli sütunlar, sırasıyla elips, majör ve minör eksenlerin uzunluklarıdır (piksel cinsinden). Ölçümleri CSV formatlı bir dosya olarak dışa aktarmak için Dosya > Farklı Kaydet'i seçin.
- Herhangi bir uygun hesaplamalı analiz yazılımını kullanarak, Majör ve Minör bölümünü hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroakışkan kanala hücre süspansiyonu yüklendiğinde, nispeten düzgün bir hücre dağılımı gözlendi. Fonksiyon üretecinden gelen sinyal çıkışı (örneğin, basit bir sinüs dalgası veya ASK'nin Anahtarlama fazı) üzerine, ince film sayısallaştırılmış elektrotlar düzgün olmayan bir alternatif akım elektrik alanı üretti. Asılı hücreler bu elektriksel uyarıma kendiliğinden tepki verdiler ve pozitif bir DEP davranışı sergilediler, yani daha yüksek alan kuvvetine sahip elektrotların kenarlarına doğru hareket ettiler. Sonuç olarak, hücreler elektrotların kenarları boyunca hizalandı ve elektrodeformasyon nedeniyle gerildi. Açma aşamasında, RBC'ler elektrodeformasyon nedeniyle gerilir; Off-Key aşamasında, RBC'ler gevşetilir (Şekil 5B). Bu protokolde hücre ayrıklığını korumak önemlidir. Bu protokolde belirtildiği gibi seyreltme faktörü kullanılarak, normal RBC'lerin hücre süspansiyonu 62 - 104 hücre / μL aralığındaydı. Bu aralıktaki bir konsantrasyonda, pozitif DEP etkisi nedeniyle hücre birikimini en aza indirirken yüksek bir hücre ölçümü verimi elde edebildik.
1 saatlik yorulma testi sırasında bireysel RBC'leri izlerken, hücresel deformasyonda kademeli bir azalma gözlemledik (Şekil 5C). Deformasyon, açık kaynaklı görüntüleme yazılımı kullanılarak tek tek RBC'lere uyması için kullanılan bir elipsin ana ve küçük eksenlerinin oranı ile ölçüldü (Şekil 6). Yazılım programında ilgi çekici görüntüler açıldı. Deformasyon ölçümü için piksel boyutunu uzunluk ölçeğine kalibre etmek gerekli değildi. Sayısal veriler, yazılım kullanılarak daha fazla analiz edilebilir ve çizilebilir.
Bu protokolde, 2 V RMS-3 MHz sinüs dalgasını modüle etmek için 250 mHz ASK kullanılarak 1 saatlik döngüsel mekanik yükleme sırasında 10 dakikalık zaman aralığındaRBC'lerin deformasyon verileri toplanmıştır. Hücre deformabilitesinde kademeli bir azalma gözlendi. Bu yorulma testi koşulu altında RBC'ler için toplam deforme olabilirlik kaybı %18 olarak bulunmuştur (Şekil 7).
Şekil 1: Elektrodeformasyon için mikroakışkan cihaz. (A) Numune çıkışı ve girişi için sırasıyla 1,5 mm ve 3 mm'lik biyopsi delikli mikroakışkan kanalın şeması. (B) Test fikstürü düzeneğinin patlayan görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İletkenlik ölçerin çalışması. DEP ortamının iletkenliğinin 0,04 S/m olduğunu doğrulamak için bir iletkenlik ölçer kullanıldı. Ölçüm cihazının tabanındaki algılama probları, bir okuma elde etmek için numuneye daldırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ozmometre çalışması. DEP ortamının ozmotik konsantrasyonunu doğrulamak için bir ozmometre kullanıldı. Adım 1 - Bir numune ucunu numune alıcıya yerleştirin ve 20 μL numune yükleyin. Adım 2 - Örnekleyiciyi çalıştırma kızağının içine ve kızağın üst kısmının altına yerleştirin. Adım 3 - Tüm çalıştırma kızağını pozitif bir duruşa ulaşana kadar aşağı doğru itin. Adım 4 - Cihaz testi yaklaşık 1 dakika çalıştırır ve sonucu görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fonksiyon üreteci bağlantısı. Test fikstürü düzeneği ve bir fonksiyon üreteci dahil olmak üzere yorulma testi için deney düzeneğinin resmi. ITO elektrot pedleri, test fikstürünün üst ünitesine bastırılan Pogo pin kaplarına önceden lehimlenmiş teller aracılığıyla BNC-timsah klipsi kablosu ile fonksiyon üretecine bağlanır. İki bağımsız paralel kanallı mikroakışkan cihaz, test fikstürünün alt ünitesine oturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hücrenin açma-kapama anahtarlamasına tepkisi. (A) 1 saat yorulma testi için açma-kapama anahtarlama modülasyonlu sinüs dalgası: elektrodeformasyon etkisi için 3 MHz'de 2 VRMS genlikli sinüs dalgası, 250 mHz modülasyon frekansı 2 s esneme ve 2 s gevşeme ile sonuçlanır. (B) Açma aşamasında, RBC'ler elektrodeformasyon nedeniyle gerilir; Anahtar Kapatma aşamasında, RBC'ler gevşetilir. (C) Temsili bir hücrenin elektrodeformasyonu, 1 saatlik döngüsel gerilme sırasında membran deformasyonunda kademeli bozulma gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ImageJ kullanılarak RBC deforme olabilirliğinin karakterizasyonu. Adım 1 - Görüntüyü görüntü düzenleme yazılımına aktarın ve 8 bit gri tonlamaya dönüştürün. Adım 2 - Görüntüleri ikiliye dönüştürmek için eşiği ayarlayın. Adım 3 - Değnek (izleme) aracıyla hücreleri seçin ve ROI yöneticisi ile seçimleri yönetin. Adım 4 - Büyük ve küçük eksenler için ölçümler elde etmek için hücreleri seçin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Hücre deforme olabilirliğinde azalma. Döngüsel elektrodeformasyon nedeniyle RBC deformasyonunda kademeli bozulma. Hata çubuğu standart sapmayı gösterir (n = 69). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir DEP kuvveti indükleyen sinüs dalgasının ASK OOK modülasyonu, RBC'lerin mekanik yorgunluğunu uzun bir süre boyunca test etmek için kullanılabilir. Bu protokolde, hücre deformabilitesi üzerindeki olası olumsuz metabolik etkileri önlemek için in vitro yorgunluk testini 1 saat ile sınırladık. Kapsamlı yorulma testi koşulları, ASK modülasyonlu elektrodeformasyon tekniği kullanılarak programlanabilir. Yükleme frekansı, genlik ve yükleme hızı gibi parametrelerin tümü programlanabilir. Yükleme frekansı, yorgunluğun yükleme frekansına bağımlılığını ve döngüsel yükleme ile statik yükleme arasındaki farkları belirlemek için değişen değerlere programlanabilir13.
Esneme büyüklüğü, küçük veya büyük deformasyonlar için farklı bir voltaj seviyesi kullanılarak kolayca ayarlanabilir. Bununla birlikte, büyük deformasyonu dahil etmek için yüksek voltaj seviyeleri kullanıldığında, elektrodeformasyonun alev benzeri şekilli RBC'lerle sonuçlanacağı not edilir (Şekil 6, adım 3). Bu, hücre şekillerini hücrelerin sivri kenarlarını kesen elipslerle uydururken hatalara neden olabilir. Bu durumda, özellikle membran kesme viskoelastisite parametrelerini çıkarmak için elektrodeformasyon kullanılırken, iki strateji kullanılabilir: (i) gerçek hücre şekillerinin hesaplamalı bir modelini kullanmak, basit analitik eliptik şekil modelinden daha doğru sonuçlar sağlayacaktır; (ii) hücreleri germek için daha küçük bir voltaj seviyesi kullanmak, böylece hücre şekilleri elipslerle iyi bir şekilde donatılabilir.
Mevcut protokolde, ortam iletkenliği 0,04 S/m idi ve bu da ihtiyaca göre ayarlanabiliyordu. Elektrodeformasyon kaynaklı hücresel gerilme, karmaşık Clausius Mossotti faktörünün gerçek değerleri ile ilişkili olduğundan, sinüs dalgası frekansı seçilen 3 MHz'den farklı olabilir. Anahtar, ihmal edilebilir bir Joule ısıtma etkisini korurken elektrodeformasyonu indüklemek için voltajı en aza indirmektir. Optimum elektriksel uyarım, DEP teorisi kullanılarak veya My DEP11 gibi hücrelerin dielektrik modellemesi için hesaplama araçları kullanılarak belirlenebilir.
Elektrodeformasyona uğrayan hücreler doğal olarak hücreleri elektrot kenarlarına kendiliğinden hareket ettiren pozitif DEP sergilediğinden, bu protokolde hücre immobilizasyonunun gerekli olmadığına dikkat edilmelidir. Bu, hücre süspansiyonları üzerinde test yapmamıza ve elektrotla etkileşime giren ve aynı anda hücreleri geren tüm hücreleri hareketsiz hale getirmemize olanak tanır. Test yapıldıktan sonra, kanal ortamla yıkanarak hücreler cihazdan kolayca çıkarılabilir. Mevcut protokolün süspansiyon hücreleri ile iyi çalışmasını sağlayan özelliği, yapışık hücreleri test etmek için uygulanmasını sınırlayabilir. Bununla birlikte, etilendiamintetraasetik asit gibi kimyasallar kullanarak yapışık hücreleri substrattan ayırabiliriz. Test, dakikalardan 1 saate kadar nispeten kısa bir sürede tamamlanacak şekilde tasarlanabildiğinden, hücreler sabitlenmeden ve yayılmadan önce mekanik yorulma testi yapmak için yeterli zamanımız var14.
Mevcut protokolde, 100 μm bant interdigitated elektrotlara sahip ticari olarak temin edilebilen bir ITO çipi kullanıldı. Sayısallaştırılmış elektrot tasarımı, hücreler elektrotların kenarlarında gerildiğinden, uzunluk-alan oranı için aynı anda birden fazla hücreyi ölçmek için avantajlıdır. Ölçümün verimi, hücre boyutunun ve deforme olabilirliğin elektrotların minimum boşluğuna sınırlamalar getirdiği gözlem alanına da bağlıdır. Elektrotların bant genişliği, daha yüksek verim için gözlem hücrelerinin sayısını artırmak için daha da azaltılabilir. Elektrot malzemeleri, titanyum veya altın gibi diğer metaller olabilir; Bununla birlikte, hücre zarlarının bir kısmı şeffaf olmayan elektrotlar tarafından bloke edilebildiğinden, elektrot malzemelerinin şeffaflığı daha iyi bir seçim olabilir. Görüntüleme işlemi sırasında hücrenin elipsoid13 gibi ilgili bir matematiksel şekil modeli kullanılabiliyorsa, test yine de gerçekleştirilebilir.
Teorik olarak, bu elektrodeformasyon ve ASK modülasyonlu elektrodeformasyon teknikleri, doğru koşullar göz önüne alındığında, örneğin ortam iletkenliği ve elektriksel uyarımlar gibi diğer hücre tipleri üzerinde çalışabilir. Bir sınırlama, ne kadar uzama gözlemleyebildiğimizdir. RBC, büyük deforme olabilirliği ve dolaşımdaki doğası için iyi bir hücre modelidir. Mevcut protokol, hem sağlık hem de hastalıkta insan eritrositlerini incelemek için uygulanmıştır ve hipoksik yorgunluğu incelemek için bir gaz mikro ortamı ile kolayca donatılmıştır13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, NSF / CMMI Hemoglobin Bazlı Yapay Oksijen Taşıyıcılarının Mekanobiyolojisi (#1941655) ve NSF / CMMI Sağlıklı ve Hastalıklı Kırmızı Kan Hücrelerinin Dinamik ve Yorgunluk Analizi (#1635312) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M.
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
