Summary
Her præsenteres en protokol for mekanisk træthedstest i tilfælde af humane røde blodlegemer ved hjælp af en amplitudemoduleret elektrodeformationsmetode. Denne generelle tilgang kan bruges til at måle de systematiske ændringer i morfologiske og biomekaniske egenskaber ved biologiske celler i en suspension fra cyklisk deformation.
Abstract
Røde blodlegemer (RBC'er) er kendt for deres bemærkelsesværdige deformerbarhed. De gennemgår gentagne gange betydelig deformation, når de passerer gennem mikrocirkulationen. Reduceret deformerbarhed ses i fysiologisk ældede RBC'er. Eksisterende teknikker til måling af celledeformerbarhed kan ikke let bruges til måling af træthed, den gradvise nedbrydning i cellemembraner forårsaget af cykliske belastninger. Vi præsenterer en protokol til evaluering af mekanisk nedbrydning i RBC'er fra cykliske forskydningsspændinger ved hjælp af amplitude shift keying (ASK) modulationsbaseret elektrodeformation i en mikrofluidisk kanal. Kort fortalt er de interdigiterede elektroder i den mikrofluidiske kanal spændt med en lavspændingsvekselstrøm ved radiofrekvenser ved hjælp af en signalgenerator. RBC'er i suspension reagerer på det elektriske felt og udviser positiv dielektroforese (DEP), som bevæger celler til elektrodekanterne. Celler strækkes derefter på grund af de elektriske kræfter, der udøves på de to cellehalvdele, hvilket resulterer i uniaxial strækning, kendt som elektrodeformation. Niveauet af forskydningsspænding og den resulterende deformation kan let justeres ved at ændre excitationsbølgens amplitude. Dette muliggør kvantificeringer af ikke-lineær deformerbarhed af RBC'er som reaktion på små og store deformationer ved høj gennemstrømning. Ændring af excitationsbølgen med ASK-strategien inducerer cyklisk elektrodeformation med programmerbare belastningshastigheder og frekvenser. Dette giver en bekvem måde til karakterisering af RBC træthed. Vores ASK-modulerede elektrodeformationsmetode muliggør for første gang en direkte måling af RBC-træthed fra cykliske belastninger. Det kan bruges som et værktøj til generel biomekanisk testning, til analyser af celledeformerbarhed og træthed i andre celletyper og syge tilstande og kan også kombineres med strategier til at kontrollere cellernes mikromiljø, såsom iltspænding og biologiske og kemiske signaler.
Introduction
Røde blodlegemer (RBC'er) er de mest deformerbare celler i menneskekroppen1. Deres deformerbarhed er direkte relateret til deres iltbærende funktionalitet. Reduceret deformerbarhed i RBC'er har vist sig at korrelere med patogenesen af flere RBC-lidelser2. Deformerbarhedsmålinger har ført os til en bedre forståelse af RBC-relaterede sygdomme3. Den normale levetid for RBC'er kan variere fra 70 til 140 dag4. Derfor er det vigtigt at måle, hvordan deres deformerbarhed falder sammen med aldringsprocessen, f.eks. deres træthedsadfærd på grund af cykliske forskydningsspændinger3.
Måling af RBC-deformerbarhed ved høj gennemstrømning er udfordrende på grund af piconewtonskalakræfterne (~ 10-12 N), der påføres de enkelte celler. I løbet af det sidste årti er der udviklet mange teknologier til måling af celledeformerbarhed5. Deformationsmålinger af RBC'er på enkeltcelleniveau kan udføres ved pipetteaspiration og optisk pincet, mens bulkanalyser udføres ved osmotisk gradientektacytometri. Ektacytometrianalyser giver en overflod af data, som giver mulighed for at diagnosticere blodsygdomme 6,7. Deformerbarheden af RBC'er kan også analyseres ved anvendelse af den viskoelastiske teori ved kolloid sonde atomkraftmikroskopi. I denne metode anvendes beregningsanalyse til at estimere det elastiske modul af RBC'er under hensyntagen til både tidsafhængige og steady-state-reaktioner. Deformerbarheden af individuelle RBC'er kan måles ved hjælp af enkeltcelle mikrokammerarray-metoden. Denne metode analyserer hver celle gennem membranen og cytosoliske fluorescerende markører for at give information om RBC-deformerbarhed og fordelingen af cellulære egenskaber i komplekse RBC-populationer for at detektere hæmatologiske lidelser8.
Træthed er en nøglefaktor i nedbrydningen af egenskaber af konstruerede materialer og biomaterialer. Udmattelsestest muliggør en kvantitativ analyse af integriteten og levetiden af en struktur, der udsættes for cyklisk belastning. Analyse af træthed i biologiske celler har længe været hæmmet af manglen på en generel, let anvendelig, høj gennemstrømning og kvantitativ metode til implementering af cyklisk deformation i cellemembraner. Dette er muligt ved anvendelse af elektrisk signalmodulation og elektrodeformationsteknikker implementeret i en mikrofluidisk indstilling. ASK-teknikken (amplitude shift keying) som en digital modulation anvendes via OOK-modulation (On-Off keying) i denne artikel. Begrebet keying refererer til transmission af digitale signaler over kanalen, hvilket kræver et sinusbølgebærersignal for at fungere9. ON- og OFF-tiderne kan indstilles ens. Under ON-keying går RBC'er ind i en deformeret tilstand, mens de udsættes for en ekstern elektrodeformationskraft (Fdep)10 skabt af det uensartede elektriske felt. Under OFF-keying er RBC'er i deres afslappede tilstand. Vi observerer træthed af RBC'er, nemlig en progressiv nedbrydning i deres evne til at strække sig med stigende belastningscyklusser. Det træthedsinducerede deformerbarhedstab i RBC'er kan give indsigt i den akkumulerede membranskade under blodcirkulationen, så vi yderligere kan undersøge forbindelserne mellem celletræthed og sygdomstilstande.
Her leverer vi trinvise procedurer for, hvordan træthedstest af RBC'er implementeres i en mikrofluidisk enhed via ASK-moduleret elektrodeformation og systemindstillingerne såsom mikrofluidisk enhed, mekanisk belastning og mikroskopisk forestilling til karakterisering af den gradvise nedbrydning i mekanisk deformerbarhed af RBC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deidentificeret humant fuldblod blev opnået kommercielt. Arbejdet med blodprøverne blev udført i et laboratorium for biosikkerhedsniveau 2 ved hjælp af protokoller godkendt af Institutional Biosafety Committee ved Florida Atlantic University.
1. Forberedelse af mikrofluidisk enhed
- Tape SU-8 master siliciumskiven ned til det mikrofluidiske kanaldesign på indersiden af en plastik 14 cm petriskål og rengør den med N2 gas.
- 60 g polydimethylsiloxan (PDMS) base og 6 g PDMS-hærdningsmiddel afvejes i en papirkop. Bland de to dele ved hjælp af en træspatel, indtil blandingen er en overskyet hvid farve.
- Hæld PDMS-blandingen i petriskålen af plast, der indeholder siliciumskiven. Læg petriskålen i en vakuumekssikkator med en 3-vejs stophane. Drej stophanens ventil for at forbinde vakuumet til ekssikkatorkammeret for at fjerne luftbobler fra PDMS.
- Genindfør luft i ekssikkatorkammeret ved at justere stophaneventilen for at forbinde ekssikkatorkammeret til omgivelserne i ca. 5 minutters cyklusser. Gentag, indtil alle luftbobler er fjernet fra kanalernes funktioner.
- Anbring petrifadet i en ovn ved 70 °C i 4 timer. Når tiden er gået, fjernes petriskålen, lad den køle af til stuetemperatur og læg den på en skæremåtte.
- Brug en skalpel til at skære den del af PDMS ud over siliciumskiven. Placer udskærings-PDMS mellem de to ark laboratorieindpakningsfilm. Afstanden mellem mikrokanalens indrykning og den halvgennemsigtige film letter identifikationen af placeringen af den mikrofluidiske kanal såvel som dens respektive indløb og udløb.
- Brug et barberblad til at skære en individuel kanal ud af det store PDMS. Stans et 3 mm indløbshul og 1,5 mm udløbshul ved hjælp af biopsistans, der er respektive for de to størrelser (figur 1A).
- Placer den hullede kanal med kanalsiden opad på en ren glasrutsjebane. Et 20 mm x 15 mm glassubstrat indeholdende tyndfilm Indium Tin Oxide (ITO) interdigiterede elektroder anbringes på den samme glasplade med elektroderne opad.
- Placer forsigtigt glasglasset med PDMS og substrat i en plasmarenser. Luk gasventilen, tænd pumpekontakten, og vent 2 min for at opnå en sensoraflæsning på 600 - 800 mTorr.
- Tænd for afbryderen, og vent i 30 sekunder. Drej RF-tænd/sluk-knappen fra lav til høj, og vent i 1 min.
- Vend derefter sekvensen ved at dreje RF-knappen til lav, afbryderen til OFF, pumpekontakten til OFF og åbne gasventilen.
- Umiddelbart efter åbning af plasmarenserens kammer løftes og drejes PDMS, så kanalsiden vender nedad (180°). Placer kanalen på toppen af ITO-substratet. Limningsprocessen er begyndt.
- Brug pincet til forsigtigt at trykke ned på hjørnerne af PDMS i ca. 3 sekunder. Undgå at trykke på selve kanalen.
BEMÆRK: Limningsprocessen sker spontant ved fysisk kontakt mellem de to behandlede overflader. - Læg primemediet i en 1 ml sprøjte med en 23 G kanyle. Fugt forsigtigt kanalen ved at stikke nålen direkte ind i indløbsbrønden og derefter frigive mediet. Betjen langsomt. Indfør ikke luftbobler. Inkuber i mindst 3 min.
- Fjern primmediet ved hjælp af en 10 μL pipettespids. Vask kanalen med DEP-mediet 3 gange ved at indsætte DEP-mediet i kanalen. Hold kanalen våd hele tiden.
2. Testarmatur
BEMÆRK: Testarmaturet er designet ved hjælp af 3D CAD-software og inkluderer en basishusenhed og en topenhed (figur 1B). Derefter fremstilles den ved hjælp af en 3-akset CNC-fræsemaskine med en standardtolerancegrænse på ca. ± 0,005 tommer dimension af testarmaturet kontrolleres ved hjælp af en elektronisk tykkelse (ikke vist). Sterilitet af armaturet er ikke påkrævet til in vitro biomekanisk testning.
- Forloddetråde ind i loddekopenderne på to sæt fjederstempelstik.
- Indsæt fjederstempelstikkene i topenheden, og opret en permanent binding ved at tilføje en dråbe epoxylim.
3. Fremstilling af elektrodeformation arbejdsbuffer
- For at forberede DEP-mediet vejes 12,75 g saccharose og 0,45 g dextrose ved hjælp af en skala.
- Begge pulvere opløses i en enkelt beholder med 150 ml deioniseret (DI) vand og 3,5 ml fosfatbufret saltvand (PBS).
- Brug en ledningsevnetester med lavt interval til at måle ledningsevnen og sikre, at den er 0,04 S / m (figur 2).
BEMÆRK: Der kan anvendes en anden ledningsevneværdi, som kan ændre fortegnet og størrelsen af den resulterende DEP-kraft11. Elektrodeformation kræver imidlertid en positiv DEP-kraft. - Brug et osmometer til at bekræfte, at osmolariteten ligger inden for blodplasmaets normalområde, 275 til 295 mOsm/kg vand (figur 3). Opbevares ved 4 °C. DEP-mediet er nu forberedt.
- I et 15 ml glas opløses 0,5 g bovin serumalbumin (BSA) i 10 ml DEP-medium. Bland grundigt. Enhedens primære medium er nu forberedt.
4. Fremstilling af cellesuspension
- 20 μL fuldblod vaskes ved centrifugering med 1 ml PBS ved 268 x g i 3 minutter. Supernatanten kasseres.
- Resuspender RBC'erne i 1 ml PBS. Pipette forsigtigt for at blande. RBC vaskes i 3 minutter ved 268 x g , og supernatanten kasseres.
- Der ekstraheres 5 μL RBC-pellet ved hjælp af en 10 μL mikropipettespids, og der hældes helt i 1 ml DEP-medium. Cellerne vaskes ved centrifugering ved 268 x g i 3 min.
- Supernatanten kasseres, og RBC'erne resuspenderes i 1 ml DEP-medium. Pipette forsigtigt for at blande.
- RBC vaskes i 3 minutter ved 268 x g , og supernatanten kasseres. Der pipetteres 2 μL RBC-pellet til 500 μL DEP-medium. Cellesuspensionen fremstilles nu med en koncentration inden for et interval på 62 - 104 celler/μL12, hvilket kan bekræftes ved hjælp af et standard celletællingsobjektglas.
5. Opsætning af elektrodeformation og træthedstest
- Anbring den mikrofluidiske enhed i den nederste del af testarmaturet. Juster den øverste del af armaturet til enheden, og saml de to dele ved hjælp af to sæt nylonskruer og møtrikker (figur 4).
- Placer testarmaturet på mikroskoptrinnet. Find et ønsket sæt elektroder under mikroskopet.
- Tilslut det tilsvarende par elektrodetråd, der matcher det placerede elektrodesæt, til funktionsgeneratorens udgangsterminal (figur 4).
- 5 μL af DEP-mediet fjernes fra den mikrofluidiske kanals 3 mm indgang. Læg langsomt 5 μL af cellesuspensionen i indløbet ved hjælp af en 10 μL pipettespids.
- Lad cellerne slå sig ned i 1 min. Tilføj om nødvendigt et ekstra DEP-medium til indløbet for at skubbe celler ind i kanalen.
- Overhold kanalen under 20x forstørrelse. Brug et 414/46 nm båndpasfilter til at forbedre kontrasten i billeddannelsen.
- Tryk på knappen Sine , og definer en sinusbølge med en 2 VRMS-amplitude ved 3 MHz frekvens. Tryk på Mod-knappen for at aktivere modulering. Skift bølgetilstand til ASK ved at trykke på Type mulighed.
- Indstil modulationsfrekvensen til 250 mHz, hvilket svarer til en 4 s laste-losseperiode (figur 5A). Tænd for funktionsgeneratorens udgang.
- Optag en video på 1 minut hvert 10. minut med 30 billeder pr. sekund (fps).
6. Karakterisering af RBC-deformation
- Brug et videoredigeringsprogram til at åbne .avi filer, der er optaget i det forrige trin, ved at trykke på Ctrl + O. Brug tidslinjen til at vælge en ramme af interesse, og indstil markeringens start- og slutrammer til at være identiske ved at trykke på Home-tasten og derefter End-tasten på tastaturet.
- Eksporter billedrammen. Vælg det outputformat, der skal JPEG, og tryk på OK.
- Åbn ImageJ-applikationen, og indlæs de billeder, der er gemt i det forrige trin. Start med at indstille de nødvendige målinger ved at trykke på Analysér > Indstil målinger og sikre, at afkrydsningsfelterne for Areal, Omkreds og Tilpas ellipse er markeret. Tryk på OK.
- Konverter derefter billedet til gråtoner ved at vælge Billede > Type > 8-bit.
- Konverter derefter billedet til binært ved hjælp af Image > Juster > Thresholding. I dialogboksen Tærskel skal du justere de to skydere efter behov. Tryk på Anvend , og luk derefter dialogboksen Tærskel.
- Vælg Analysér > værktøjer > ROI Manager. I ROI Manager skal du trykke på afkrydsningsfeltet Vis alle. Luk ikke denne boks.
- Vælg værktøjet Tryllestav (sporing), vælg en relevant celle i billedet, og tryk på T på tastaturet. Den valgte celle nummereres. En ny celle kan markeres igen. Vælg alle relevante celler, der skal måles. De relevante celler identificeres som dem, der er isoleret fra andre celler. Antallet af disse celler kan variere fra 50 til 200 i et enkelt synsfelt.
- Gå tilbage til feltet ROI Manager, og tryk på Mål. Dette åbner feltet Resultater. Kolonner mærket Major og Minor er længderne af henholdsvis den monterede ellipse major og minor akser (i pixels). Vælg Filer > Gem som for at eksportere målingerne som en CSV-formateret fil.
- Brug enhver passende beregningsanalysesoftware til at beregne kvotienten mellem Major og Minor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når cellesuspension blev indlæst i den mikrofluidiske kanal, blev der observeret en relativt ensartet fordeling af celler. Ved signaludgangen (f.eks. en simpel sinusbølge eller On-Keying-fase af ASK) fra funktionsgeneratoren genererede de tyndfilmede interdigiterede elektroder et uensartet vekselstrømselektrisk felt. De suspenderede celler reagerede spontant på denne elektriske excitation og udviste en positiv DEP-adfærd, nemlig at bevæge sig mod kanterne af elektroder med højere feltstyrke. Følgelig blev celler justeret langs elektrodernes kanter og blev strakt på grund af elektrodeformation. Under On-Keying-fasen strækkes RBC'er på grund af elektrodeformation; under off-keying-fasen lempes RBC'erne (figur 5B). Opretholdelse af cellediskrethed er vigtig i denne protokol. Ved anvendelse af fortyndingsfaktoren som angivet i denne protokol var cellesuspension af normale RBC'er i et interval på 62 - 104 celler/μL. Ved en koncentration inden for dette område var vi i stand til at opnå en høj gennemstrømning af cellemåling, samtidig med at vi minimerede akkumuleringen af celler på grund af den positive DEP-effekt.
Ved sporing af individuelle RBC'er under 1 timers træthedstest observerede vi et gradvist fald i cellulær deformation (figur 5C). Deformerbarheden blev kvantificeret ved forholdet mellem de store og mindre akser i en ellipse, der blev brugt til at passe til de enkelte RBC'er ved hjælp af open source-billedbehandlingssoftware (figur 6). Billeder af interesse blev åbnet i softwareprogrammet. Det var ikke nødvendigt at kalibrere pixelstørrelsen til længdeskalaen til deformerbarhedsmålingen. Numeriske data kan analyseres og plottes yderligere ved hjælp af software.
I denne protokol blev deformationsdata for RBC'er indsamlet i tidsintervallet 10 min under 1 times cyklisk mekanisk belastning ved hjælp af 250 mHz ASK for at modulere 2 VRMS-3 MHz sinusbølgen. Der blev observeret en gradvis reduktion i celledeformerbarhed. Det samlede deformerbarhedstab for RBC'er under denne træthedstesttilstand viste sig at være 18% (figur 7).
Figur 1: Mikrofluidisk anordning til elektrodeformation. (A) Skematisk over den mikrofluidiske kanal med biopsiudstansede huller på henholdsvis 1,5 mm og 3 mm for prøveudløb og -indtag. B) Eksploderende billede af prøvearmaturenheden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ledningsevnemålerens drift. En ledningsevnemåler blev brugt til at verificere DEP-mediets ledningsevne til at være 0,04 S/m. Sensorsonderne i bunden af måleren er nedsænket i prøven for at opnå en aflæsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Osmometerdrift. Et osmometer blev brugt til at verificere den osmotiske koncentration af DEP-mediet. Trin 1 - Klik en prøvespids på plads på prøveudtageren, og læg 20 μL prøve. Trin 2 - Placer prøveudtageren inden i betjeningsholderen og under holderens top. Trin 3 - Skub hele betjeningsholderen ned, indtil den når et positivt stop. Trin 4 - Instrumentet kører testen i ca. 1 min og viser resultatet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tilslutning af funktionsgenerator. Billede af den eksperimentelle opsætning til træthedstest, herunder testarmaturenheden og en funktionsgenerator. ITO-elektrodepuder er forbundet til funktionsgeneratoren ved hjælp af BNC-til-alligator-klemmekabel via ledningerne, der er loddet ind i Pogo-stiftkopperne, presset ind i den øverste enhed på testarmaturet. Den mikrofluidiske enhed med to uafhængige parallelle kanaler sidder på testarmaturets nederste enhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Cellens reaktion på on-off-nøglering. (A) On-off keying moduleret sinusbølge til 1 times træthedstest: sinusbølge på 2 VRMS-amplitude ved 3 MHz til elektrodeformationsvirkning, modulationsfrekvens på 250 mHz, hvilket resulterer i 2 s strækning og 2 s afslapning. b) Under on-keying-fasen strækkes RBC'er på grund af elektrodeformation; under Off-Keying-fasen er RBC'er afslappet. (C) Elektrodeformation af en repræsentativ celle viser gradvis nedbrydning i membrandeformation i løbet af 1 times cyklisk strækning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Karakterisering af RBC-deformerbarhed ved hjælp af ImageJ. Trin 1 - Importer billedet til billedredigeringssoftware og konverter det til 8-bit gråtoner. Trin 2 - Juster tærsklen for at konvertere billeder til binær. Trin 3 - Vælg celler med tryllestavsværktøjet (sporing), og administrer valg med ROI-manageren. Trin 4 - Vælg cellerne for at få målinger for større og mindre akser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Reduktion i celledeformerbarhed. Gradvis nedbrydning i RBC-deformerbarhed på grund af cyklisk elektrodeformation. Fejllinjen viser standardafvigelsen (n = 69). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ASK OOK-modulationen af en DEP-kraftinducerende sinusbølge kan bruges til at teste den mekaniske træthed af RBC'er over en lang periode. I denne protokol begrænsede vi in vitro-træthedstesten til 1 time for at forhindre de potentielle negative metaboliske virkninger på celledeformerbarheden. Omfattende udmattelsestestbetingelser kan programmeres ved hjælp af ASK-moduleret elektrodeformationsteknik. Parametre som belastningsfrekvens, amplitude og belastningshastighed kan alle programmeres. Belastningsfrekvensen kan programmeres til forskellige værdier for at bestemme træthedens afhængighed af belastningsfrekvensen samt forskelle mellem cyklisk belastning og statisk belastning13.
Strækningsstørrelsen kan let justeres ved at bruge et andet spændingsniveau til små eller store deformationer. Når man bruger højspændingsniveauer til at inkludere stor deformation, bemærkes det imidlertid, at elektrodeformation vil resultere i flammelignende formede RBC'er (figur 6, trin 3). Dette kan medføre fejl ved tilpasning af celleformer med ellipser, som afskærer cellernes spidse kanter. Under denne omstændighed, især når elektrodeformationen anvendes til at ekstrahere membranforskydningsviskoelasticitetsparametre, kan to strategier anvendes: (i) ved hjælp af en beregningsmodel af ægte celleformer vil give mere nøjagtige resultater end den enkle analytiske elliptiske formmodel; (ii) Brug af et mindre spændingsniveau til at strække celler, så celleformerne kan udstyres godt med ellipser.
I den nuværende protokol var medium ledningsevne 0,04 S / m, som kan justeres efter behov. Da elektrodeformationsinduceret cellulær strækning er relateret til de reelle værdier af den komplekse Clausius Mossotti-faktor, kan sinusbølgefrekvensen være forskellig fra den valgte 3 MHz. Nøglen er at minimere spændingen for at inducere elektrodeformation, samtidig med at der opretholdes en ubetydelig Joule-opvarmningseffekt. En optimal elektrisk excitation kan bestemmes ved hjælp af DEP-teori eller ved hjælp af beregningsværktøjer til dielektrisk modellering af celler, såsom My DEP11.
Det skal bemærkes, at celleimmobilisering ikke er påkrævet i denne protokol, da celler, der gennemgår elektrodeformation, i sagens natur udviser positiv DEP, som spontant bevæger celler til elektrodekanterne. Dette giver os mulighed for at udføre test på cellesuspensioner og immobilisere alle celler, interagere med elektroden og samtidig strække cellerne. Når testen er udført, kan celler let fjernes fra enheden ved at skylle kanalen med mediet. Karakteristikken ved den nuværende protokol, der får den til at fungere godt med suspenderende celler, kan begrænse dens anvendelse til at teste klæbende celler. Vi kan dog løsne klæbende celler fra substratet ved hjælp af kemikalier som ethylendiamintetraeddikesyre. Da testen kan designes til at blive afsluttet på relativt kort tid, fra minutter til 1 time, har vi tid nok til at udføre mekanisk træthedstest, før cellerne forankrer og spreder14.
I den nuværende protokol blev der anvendt en kommercielt tilgængelig ITO-chip med 100 μm bånds interdigiterede elektroder. Interdigiteret elektrodedesign er fordelagtigt til måling af flere celler ad gangen for længde-til-areal-forholdet, da cellerne strækkes ved kanterne af elektroder. Målingens gennemstrømning afhænger også af observationsfeltet, hvor cellestørrelse og deformerbarhed sætter begrænsninger for elektrodernes minimale mellemrum. Elektrodernes båndbredde kan reduceres yderligere for at øge antallet af observationsceller for højere gennemstrømning. Elektrodematerialerne kan være andre metaller, såsom titanium eller guld; Imidlertid kan elektrodematerialernes gennemsigtighed være et bedre valg, da en del af cellemembraner kan blokeres af de uigennemsigtige elektroder. Testen kan stadig udføres, hvis en relevant matematisk formmodel af cellen, såsom en ellipsoid13, kan bruges under billedbehandling.
Teoretisk set kan denne elektrodeformation og ASK-modulerede elektrodeformationsteknikker arbejde på andre celletyper under de rette betingelser, f.eks. medium ledningsevne og elektriske excitationer. En begrænsning er, hvor meget forlængelse vi kan observere. RBC er en god cellemodel for sin store deformerbarhed og cirkulerende natur. Den nuværende protokol er blevet anvendt til at studere humane RBC'er i både sundhed og sygdom og er let udstyret med et gasmikromiljø til undersøgelse af hypoxisk træthed13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning er finansieret af NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) og NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (# 1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M.
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
