Summary
En procedur för att extrahera cellfritt DNA från glaskropp och kammarvatten för att utföra molekylära studier för diagnos av vitreoretinalt lymfom etableras här. Metoden ger möjlighet att samtidigt extrahera DNA från den cellulära komponenten i provet eller att reservera det för kompletterande testning.
Abstract
Vitreoretinalt lymfom (VRL) representerar ett aggressivt lymfom, ofta kategoriserat som primärt diffust storcelligt B-cellslymfom i centrala nervsystemet. För att diagnostisera VRL samlas prover som glaskroppshumor och, på senare tid, kammarvatten in. Diagnostisk testning för VRL på dessa prover inkluderar cytologi, flödescytometri och molekylär testning. Men både cytopatologi och flödescytometri, tillsammans med molekylär testning med cellulärt DNA, kräver intakta hela celler. Utmaningen ligger i det faktum att glasaktig och vattenhaltig humor vanligtvis har låg cellularitet, och många celler förstörs under insamling, lagring och bearbetning. Dessutom utgör dessa prover ytterligare svårigheter för molekylär testning på grund av den höga viskositeten hos glaskroppen och den låga volymen av både glaskropp och vatten. Denna studie föreslår en metod för att extrahera cellfritt DNA från glasaktiga och vattenhaltiga prover. Detta tillvägagångssätt kompletterar extraktionen av cellulärt DNA eller gör att den cellulära komponenten i dessa prover kan användas för andra diagnostiska metoder, inklusive cytologi och flödescytometri.
Introduction
Vitreoretinalt lymfom (VRL) är ett aggressivt lymfom associerat med primärt diffust storcelligt B-cellslymfomi centrala nervsystemet 1,2,3. VRL är vanligtvis dödligt på grund av dess engagemang i det centrala nervsystemet 1,2. Även om det är sällsynt1,4 uppvisar VRL ofta symtom som liknar bakre uveit och andra vitreoretinala sjukdomar 4,5. Följaktligen kräver patienter som uppvisar uveitsymtom en diagnos för att antingen bekräfta eller utesluta VRL.
Nyligen publicerades konsensuskriterier för diagnostisering av VRL, som innebär en kombination av klinisk undersökning och laboratoriefynd6. Prover som vanligtvis används för att diagnostisera VRL inkluderar glaskroppshumor och, på senare tid, kammarvatten7. Glaskroppshumor erhålls genom ett kirurgiskt ingrepp som kallas pars plana vitrektomi, vilket ger tillgång till ögats bakre segment8.
I det presenterade protokollet samlades både kammarvatten och glaskroppsprover in för cellulär och cfDNA-extraktion. Efter att ha sövt patienterna och placerat troakarna ca 4 mm från hornhinnans limbus, erhölls ett kammarvattenprov på ca 100-200 μL med hjälp av en 1 ml tuberkulinspruta vid hornhinnans limbus. För pseudofakiska patienter erhölls outspädd glaskropp genom att steril luft tillfördes infusionen, vilket möjliggjorde uppsamling av en större mängd outspädd glaskropp (upp till 3,5 ml). Hos fakiska patienter avlägsnades cirka 500 till 1000 μl outspädd glaskropp innan en infusion av balanserad saltlösning sattes på. I vissa fall samlades sekundärt utspädd glaskropp (500 till 2 000 μL) upp genom att infusionen omvandlades till vätska och vitrektorn placerades i glaskroppen för att få detta prov. Den mest utspädda glaskroppsfraktionen samlades in genom att bevara kassettpåsen (kompletterande figur 1) i slutet av operationen. När denna påse nådde patologiavdelningen erhölls utspädd glaskropp genom att dränera vätska ur denna påse till koniska rör för efterföljande DNA-extraktion.
Cytopatologi av glaskroppsvätska anses ofta vara guldstandarden9. Flera studier har dock visat begränsad känslighet på grund av bearbetning och minimal cellularitet10,11,12. Flödescytometri kan hjälpa till att identifiera klonala B-celler men kan också begränsas av låg cellularitet och bräcklighet hos stora lymfomceller13,14,15. Både cytopatologi och flödescytometri kräver intakta hela celler. Många av dessa celler förstörs under insamling, lagring och bearbetning. När molekylär testning utförs med hjälp av DNA extraherat från intakta celler (cellulärt DNA), lider det av samma begränsning. Att dela upp det begränsade glaskroppen för alla dessa tester minskar dessutom mängden material som är tillgängligt för varje test.
Cellfritt DNA (cfDNA) är en annan DNA-källa som inte kräver intakta celler. cfDNA från glaskroppsprover har använts för detektion av VRL 16,17 samt uvealt melanom18. I detta protokoll extraheras cellulärt och cellfritt DNA från glasaktig och vattenhaltig vätska för att detektera VRL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna för mänsklig vård och med godkännande av den institutionella granskningsnämnden (IRB) vid University of Michigan. Ett avstående från informerat samtycke erhölls för detta från IRB. Det finns inga relevanta inklusions- eller exklusionskriterier för de inblandade patienterna.
1. Separering av cellulära och cellfria komponenter
OBS: Tre typer av samples kan tas emot för VRL-diagnostisk testning: glaskropp (outspädd; vätska från vitrektomi som samlats in innan infusionen påbörjas), utspädd glaskropp i en kassettpåse (figur 1) och vattenhaltig humor (vätska från ögats främre kammare).
- För outspädd glaskroppsvätska, som är mycket trögflytande, späd med 3-5 ml PBS för att underlätta pipettering.
- För utspädd glaskropp i kassettpåsen (kompletterande figur 1), dränera vätskan i 50 ml koniska rör (en för varje 45 ml vätska).
- Vattenhaltig humor har mycket låg volym (<200 μL). För att säkerställa maximal återvinning av celler, överför sample till ett 1.5 ml rör, skölj det ursprungliga 500 μL mikrocentrifugröret som sample samlades in med en lika stor volym PBS och tillsätt till 1.5 ml röret.
- Centrifugera glas- eller vattenhaltig vätska vid 3 000 x g i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett, var försiktig så att du inte stör de pelleterade cellerna.
2. DNA-extraktion från den cellulära komponenten
- Tillsätt en lämplig mängd celllyslösning (300 μL för liten pellet, 1 ml eller mer för större pellet) (se materialtabell). Blanda genom att pipettera upp och ner.
- När den är fullständigt lyserad, tillsätt 1/3 av den totala volymen proteinfällningslösning (100 μL för 300 μL lysat) (se materialtabellen).
- Virvla kraftigt i 20-30 s. Centrifugera i 3 minuter vid 3 000 x g i rumstemperatur.
- Pipettera 300 μL isopropanol i ett rent mikrocentrifugrör. Pipettera försiktigt supernatanten från föregående steg till isopropanolröret.
- Tillsätt 1,5 μL 20 mg/ml glykogen (för 300 μL lys) (se Materialförteckning).
- Blanda väl genom att vända upp och ner och placera sedan provet i en frys på -20 °C i 1 timme till över natten för att underlätta DNA-utfällningen.
- Centrifugera 1,5 ml röret i 5 minuter vid 3 000 x g vid rumstemperatur. Pipettera bort isopropanolen.
- Tillsätt 0,5 ml 70 % etanol och vänd röret för att tvätta pelleten.
- Centrifugera i 1 minut vid 3 000 x g i rumstemperatur och dekantera etanolen. Upprepa etanoltvätten en gång.
- Vänd röret på ren gasväv för att tömma lösningen och torka pelleten eller dekanteringen. Snurra snabbt DNA:t i en mikrocentrifug och pipettera den återstående droppen etanol med en pipettspets med fin spets (när ingen kvarvarande etanol finns kvar i röret bör DNA:t vara torrt och redo att hydreras på 5-10 minuter).
- Tillsätt 45 μl DNA-hydratiseringslösning (se materialtabell) till den torkade DNA-pelleten.
- Placera röret i ett värmeblock vid 50 °C och låt det solubilisera i 1-2 timmar. Pipettera DNA:t upp och ner för att påskynda hydreringsprocessen.
OBS: Tillsätt mer DNA-hydratiseringslösning om sample verkar för trögflytande.
3. Cellfri DNA-extraktion
- Mängden supernatant från steg 1,5 varierar. Tillsätt 70 μl konditioneringsbuffert (se materialtabell) för varje milliliter supernatant.
- Blanda rensningspärlor väl genom att virvla. Tillsätt 10 μL rensningspärlor vid bearbetning <14 ml cellfri supernatant, 20 μL vid bearbetning av 14-40 ml.
- Blanda provet/pärlblandningen väl genom att virvla. Centrifugera vid 3 000 x g i 15 minuter i rumstemperatur.
- Utan att störa pelleten, pipettera ut supernatanten och lämna efter sig 100 μL om 10 μL rensningspärlor används och 200 μL om 20 μL rensningspärlor används.
- Tillsätt en lika stor volym buffert för uppslutning av urinpellets (se materialtabell) till pelleten och återsuspendera pelletbrunnen genom vortexing eller pipettering.
- Tillsätt proteinas K (5 % (volym/volym)) till den återsuspenderade pelleten (tillsätt t.ex. 10 μl proteinas K till 200 μL blandning) och blanda väl genom försiktig virvning.
- Inkubera pelletsblandningen vid 55 °C i 30 min.
- Tillsätt en volym genomisk lysbuffert (se materialtabell) till uppslutningsblandningen (t.ex. 210 μl genomisk lysbuffert till 210 μl digestionsblandning) och blanda genom virvling.
- Överför den kommersiellt tillgängliga centrifugkolonnen (se materialförteckning) till ett nytt uppsamlingsrör.
- Tillsätt 200 μl Urine DNA Prep-buffert till centrifugeringskolonnen, centrifugera vid ≥16 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur och kassera genomflödet.
- Tillsätt 700 μl urin-DNA-tvättbuffert till kolonnen, centrifugera vid ≥16 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur och kassera genomflödet.
- Upprepa steget med 200 μL urin-DNA-tvättbuffert.
- Överför spinnkolonnen till ett DNase/RNase-fritt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt lämplig volym DNA-elueringsbuffert (baserat på de molekylära tester som ska utföras) direkt på kolonnmatrisen och låt den stå i 3-5 minuter vid rumstemperatur.
Anm.: 30 μL elueringsbuffert användes i exemplen. Mer elueringsbuffert används om ytterligare testning krävs. - Centrifugera vid ≥16 000 x g vid rumstemperatur i 1 minut för att erhålla det cellfria DNA:t.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa extraktionsmetoder utfördes på ett begränsat antal fall för att säkerställa adekvat utbyte och amplifierbarhet av cellfritt DNA i jämförelse med cellulärt DNA från glaskroppen (fyra) och vattenproverna (fyra). Från dessa prover är DNA-utbytet från den cellfria komponenten i dessa vätskor liknande det från den cellulära komponenten (tabell 1). Cellulärt DNA och cfDNA från dessa prover utvärderades också med hjälp av molekylära tester, till exempel för den VRL-associerade mutationen MYD88 L265P. En allelspecifik realtids-PCR för MYD88 L265P (Figur 1) illustrerar detektionen av denna VRL-associerade mutation i både cellulärt DNA och cfDNA. I detta exempel verkar sjukdomsbördan vara högre i den cellfria komponenten, vilket illustreras av en lägre (cykeltröskel (Ct). Dessa data illustrerar att cfDNA extraherat från glasaktig och vattenhaltig humor med hjälp av denna metod resulterar i en DNA-källa som också kan tillämpas på diagnostisk molekylär testning.
Figur 1: MYD88 L265P allelspecifik realtids-PCR. Representativ amplifieringskurva som visar MYD88 L265P allelspecifik realtids-PCR för cellulärt och cellfritt DNA (varje PCR-reaktion utförs i duplikat). Tröskelvärdet för cykeltröskeln (Ct) indikeras av den gröna linjen. De punkter där amplifiering av cfDNA (blå och bruna spår) och cellulärt DNA (röda och gröna spår) - var och en utförd i duplikat - når tröskelvärdet är märkta. Bakgrundsfluorescens finns nära 1.00e-003. En högre mutationsbörda finns i den cellfria komponenten, vilket demonstreras av en lägre Ct. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Mobil | Fri från celler | |
| Glaskropp 1 | 130.5 | 67.5 |
| Glaskropp 2 | 337.5 | 105 |
| Glaskropp 3 | 150 | 168 |
| Glaskropp 4 | 1816 | 654 |
| Vattenlösning 1 | 58.5 | 40.5 |
| Vattenlösning 2 | 153 | 225 |
| Vattenlösning 3 | 117 | 454.5 |
| Vattenlösning 4 | TL | 27 |
Tabell 1: Cellulära och cellfria DNA-extraktionsutbyten. DNA-utbyte (i ng) för fyra outspädda glaskropps- och fyra vattenhaltiga vätskor (främre kammare) från fyra olika individer baserat på fluorometrisk DNA-kvantifiering. TL = för låg för att kvantifiera.
Kompletterande bild 1: Glaskroppskassettpåse. Exempel på glaskroppsfärgad kassettpåse som innehåller utspädd glaskroppsvätska. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitreoretinalt lymfom (VRL) är ett aggressivt storcelligt B-cellslymfom 1,2,3 vars symtom kan efterlikna andra vitreoretinala sjukdomar 4,5. Molekylär testning av glaskropps- och på senare tid kammarvatten har blivit en kritisk metod för att ställa diagnosen VRL eller utesluta det. Dessa vätskor är dock mycket låga i volym och har ofta låg cellularitet. Många av cellerna i dessa vätskor kan också skadas under insamling, lagring och bearbetning13,14,15. Som ett resultat av detta är DNA-utbytet från dessa prover ofta lågt. Dessutom måste cellerna från dessa vätskor delas med andra diagnostiska metoder, inklusive cytopatologi och flödescytometri. Cellfritt DNA (cfDNA) i dessa vätskor ger en annan DNA-källa som inte kräver intakta celler.
Detta protokoll separerar de cellulära och cellfria komponenterna i glasaktig eller vattenhaltig vätska. Glasvätska späds med PBS för att möjliggöra pipettering på grund av dess viskositet. Vattenhaltig vätska hanteras för att säkerställa maximal återvinning av denna vätska med mycket låg volym.
En jämförelse av DNA-utbytet av dessa två komponenter illustrerar att betydande ytterligare nukleinsyra kan härledas från den cellfria komponenten. Molekylär testning av cfDNA, såsom MYD88 L265P allelspecifik realtids-PCR, visar att VRL kan detekteras i den cellfria komponenten av glaskropp och kammarvatten samt i den cellulära komponenten. I många fall är den relativa mängden VRL högre i den cellfria komponenten än i cellulär (Figur 1).
Extraktion av den cellfria komponenten i glas- och vattenhaltig vätska möjliggör molekylär utvärdering av en komponent i dessa vätskor som annars skulle kasseras. Eftersom VRL representeras i cellulära och cellfria komponenter, kan cellulärt DNA och cfDNA kombineras för att maximera det tillgängliga DNA:t från dessa begränsade prover. Alternativt kan den cellfria komponenten i dessa vätskor användas för molekylär testning, och den cellulära komponenten kan användas för testning som kräver intakta celler, dvs cytopatologi och flödescytometri. På så sätt skulle man kunna undvika att separata alikvoter av dessa vätskor tilldelas varje test, vilket kan äventyra känsligheten hos varje test för detektion av VRL. Med tanke på framgången med denna metod i glasaktiga och vattenhaltiga prover, kan denna metod också vara användbar i andra begränsade vätskor för att öka mängden DNA som är tillgängligt för molekylär testning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS och Helmut Weigelin, MLS(ASCP) var avgörande för att etablera denna extraktionsmetod i vårt laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
- Coupland, S. E., Damato, B.
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A.
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P.
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
