Summary
En prosedyre for å trekke ut cellefritt DNA fra glasslegemet og vandig humor for å utføre molekylære studier for diagnostisering av vitreoretinal lymfom er etablert her. Metoden gir muligheten til samtidig å trekke ut DNA fra den cellulære komponenten i prøven eller reservere den for tilleggstesting.
Abstract
Vitreoretinal lymfom (VRL) representerer et aggressivt lymfom, ofte kategorisert som primært sentralnervesystemet diffust storcellet B-celle lymfom. For å diagnostisere VRL samles prøver som glassaktig humor og nylig vandig humor. Diagnostisk testing for VRL på disse prøvene inkluderer cytologi, flowcytometri og molekylær testing. Imidlertid krever både cytopatologi og flowcytometri, sammen med molekylær testing ved hjelp av cellulært DNA, intakte hele celler. Utfordringen ligger i det faktum at glassaktig og vandig humor vanligvis har lav cellularitet, og mange celler blir ødelagt under innsamling, lagring og behandling. Dessuten utgjør disse prøvene ytterligere vanskeligheter for molekylær testing på grunn av den høye viskositeten til glassaktig humor og det lave volumet av både glassaktig og vandig humor. Denne studien foreslår en metode for å ekstrahere cellefritt DNA fra glasslegeme og vandige prøver. Denne tilnærmingen utfyller ekstraksjonen av cellulært DNA eller gjør at den cellulære komponenten i disse prøvene kan brukes til andre diagnostiske metoder, inkludert cytologi og flowcytometri.
Introduction
Vitreoretinalt lymfom (VRL) er et aggressivt lymfom assosiert med primært sentralnervesystem diffust storcellet B-celle lymfom 1,2,3. VRL er vanligvis dødelig på grunn av sitt engasjement i sentralnervesystemet 1,2. Selv om det er sjeldent1,4, presenterer VRL ofte symptomer som ligner på bakre uveitt og andre vitreoretinale sykdommer 4,5. Følgelig krever pasienter som viser uveittsymptomer en diagnose for å enten bekrefte eller utelukke VRL.
Nylig ble det publisert konsensuskriterier for diagnostisering av VRL, som innebærer en kombinasjon av klinisk undersøkelse og laboratoriefunn6. Eksempler som ofte brukes til å diagnostisere VRL inkluderer glassaktig humor og, mer nylig, vandig humor7. Vitreous humor oppnås gjennom en kirurgisk prosedyre kalt pars plana vitrektomi, som gir tilgang til det bakre segmentet av øyet8.
I den presenterte protokollen ble både vandig humor og glassaktige humorprøver samlet for cellulær og cfDNA-ekstraksjon. Etter bedøvelse av pasientene og plassering av trocars ca. 4 mm fra hornhinnen limbus, ble det tatt en vandig humorprøve på ca. 100-200 μL ved bruk av en 1 ml tuberkulinsprøyte ved hornhinnen limbus. For pseudofakiske pasienter ble ufortynnet glasslegeme oppnådd ved å introdusere steril luft inn i infusjonen, noe som muliggjorde oppsamling av en større mengde ufortynnet glasslegeme (opptil 3,5 ml). Hos fakiske pasienter ble ca. 500 til 1000 mikrol ufortynnet glasslegeme fjernet før infusjon av balansert saltoppløsning ble slått på. I noen tilfeller ble sekundært fortynnet glasslegeme (500 til 2000 μL) samlet ved å bytte infusjonen til væske og plassere virektoren i glasslegemet for å oppnå denne prøven. Den mest fortynnede glassfraksjonen ble samlet ved å bevare kassettposen (tilleggsfigur 1) på slutten av operasjonen. Når denne posen nådde patologiavdelingen, ble fortynnet glasslegeme oppnådd ved å drenere væske ut av denne posen i koniske rør for påfølgende DNA-ekstraksjon.
Cytopatologi av glassvæske regnes ofte som gullstandarden9. Imidlertid har flere studier vist begrenset sensitivitet på grunn av prosessering og minimal cellularitet10,11,12. Flowcytometri kan hjelpe til med å identifisere klonale B-celler, men kan også begrenses av lav cellularitet og skjørheten til store lymfomceller13,14,15. Både cytopatologi og flowcytometri krever intakte hele celler. Mange av disse cellene blir ødelagt under innsamling, lagring og behandling. Når molekylær testing utføres ved hjelp av DNA ekstrahert fra intakte celler (cellulært DNA), lider den av den samme begrensningen. I tillegg deler den begrensede glassprøven for alle disse testene mengden materiale som er tilgjengelig for hver test.
Cellefritt DNA (cfDNA) representerer en annen DNA-kilde som ikke krever intakte celler. cfDNA fra glasslegemeprøver har blitt brukt til påvisning av VRL 16,17 samt uveal melanom18. I denne protokollen ekstraheres cellulært og cellefritt DNA fra glasslegeme og vandig væske for å oppdage VRL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende protokollen følger retningslinjene for menneskelig omsorg og med godkjenning av det institusjonelle gjennomgangsstyret (IRB) ved University of Michigan. Det ble innhentet frafall av informert samtykke til dette fra IRB. Det finnes ingen relevante inklusjons- eller eksklusjonskriterier for de involverte pasientene.
1. Separasjon av cellulære og cellefrie komponenter
MERK: Tre typer prøver kan mottas for VRL-diagnostisk testing: glasslegeme (ufortynnet, væske fra vitrektomi samlet før infusjonsstart), fortynnet glasslegeme i en kassettpose (figur 1) og vandig humor (væske fra øyets fremre kammer).
- For ufortynnet glassvæske, som er meget tyktflytende, fortynnes med 3-5 ml PBS for å lette pipettering.
- For fortynnet glasslegeme i kassettposen (tilleggsfigur 1), tøm væsken ned i 50 ml koniske rør (én for hver 45 ml væske).
- Vandig humor er svært lav i volum (<200 μL). For å sikre maksimal utvinning av celler, overfør prøven til et 1,5 ml rør, skyll det originale 500 μL mikrosentrifugerøret prøven ble samlet inn i med et likt volum PBS, og legg til 1,5 ml røret.
- Sentrifuge glasslegemet eller vandig væske ved 3000 x g i 15 minutter ved romtemperatur.
- Fjern forsiktig supernatanten med en pipette, og pass på at du ikke forstyrrer de pelleterte cellene.
2. DNA-ekstraksjon fra den cellulære komponenten
- Tilsett en passende mengde cellelyseoppløsning (300 μL for liten pellet, 1 ml eller mer for større pellet) (se Materialfortegnelse). Bland ved å pipettere opp og ned.
- Når det er fullstendig lysert, tilsett 1/3 totalt volum av proteinutfellingsløsningen (100 μL for 300 μL lysat) (se materialtabell).
- Vortex kraftig i 20-30 s. Spinn i 3 minutter ved 3000 x g ved romtemperatur.
- Pipette 300 μL isopropanol inn i et rent mikrosentrifugerør. Pipetter supernatanten forsiktig fra forrige trinn til isopropanolrøret.
- Tilsett 1,5 μL glykogen 20 mg/ml glykogen (for 300 μL lysis) (se materialfortegnelse).
- Bland godt ved inversjon, og legg deretter prøven i en -20 ° C fryser i 1 time til over natten for å hjelpe til med DNA-utfelling.
- Sentrifuger 1,5 ml røret i 5 minutter ved 3000 x g ved romtemperatur. Pipette av isopropanol.
- Tilsett 0,5 ml 70% etanol og vend røret for å vaske pelleten.
- Spinn i 1 min ved 3000 x g ved romtemperatur og dekanter etanolen. Gjenta etanolvasken en gang.
- Vend røret på rent gasbind for å tømme løsningen og tørk pelleten eller dekanteringen. Spinn DNA-et raskt i en mikrosentrifuge og pipett den gjenværende dråpen etanol med en engangspipetspiss (når det ikke er igjen gjenværende etanol i røret, bør DNA-et være tørt og klart til å hydrere i løpet av 5-10 minutter).
- Tilsett 45 μL DNA-hydreringsløsning (se materialtabell) til den tørkede DNA-pelleten.
- Legg tuben i en varmeblokk ved 50 °C og la den oppløses i 1-2 timer. Pipett DNA-et opp og ned for å fremskynde hydreringsprosessen.
MERK: Tilsett mer DNA-hydreringsløsning hvis prøven virker for tyktflytende.
3. Cellefri DNA-ekstraksjon
- Mengden supernatant fra trinn 1,5 varierer. Tilsett 70 μL kondisjoneringsbuffer (se materialfortegnelse) for hver milliliter supernatant.
- Bland ryddeperler godt ved å virvle. Tilsett 10 μL ryddekuler ved behandling av <14 ml cellefri supernatant, 20 μL ved behandling av 14-40 ml.
- Bland prøven / perleblandingen godt ved vortexing. Sentrifuge ved 3000 x g i 15 minutter ved romtemperatur.
- Uten å forstyrre pelleten, pipetter du ut supernatanten og etterlater 100 μL hvis 10 μL ryddeperler brukes, og 200 μL hvis 20 μL ryddeperler brukes.
- Tilsett et likt volum av urinpelletsfordøyelsesbuffer (se materialtabell) til pelleten og resuspender pelletbrønnen ved vortexing eller pipettering.
- Tilsett Proteinase K (5% (v / v)) til den resuspenderte pelleten (tilsett f.eks. 10 μL proteinase K til 200 μL-blanding) og bland godt ved forsiktig vortexing.
- Inkuber pelletsblandingen ved 55 °C i 30 minutter.
- Tilsett ett volum genomisk lysisbuffer (se materialtabell) til fordøyelsesblandingen (f.eks. 210 μL genomisk lysisbuffer til 210 μL fordøyelsesblanding) og bland ved virvel.
- Overfør den kommersielt tilgjengelige spinnkolonnen (se Materialfortegnelse) til et nytt oppsamlingsrør.
- Tilsett 200 μL DNA Prep-buffer for urin til sentrifugeringskolonnen, sentrifuge ved ≥16 000 x g i 1 min ved romtemperatur, og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 700 μL urin DNA-vaskebuffer i kolonnen, sentrifuge ved ≥ 16 000 x g i 1 min ved romtemperatur og kast gjennomstrømningen.
- Gjenta trinnet med 200 μL urin DNA vaskebuffer.
- Overfør spinnkolonnen til et DNase/RNase-fritt mikrosentrifugerør.
- Tilsett passende volum DNA-elueringsbuffer (basert på molekylære tester som skal utføres) direkte på kolonnematrisen og la den stå i 3-5 minutter ved romtemperatur.
MERK: 30 μL elueringsbuffer ble brukt i eksempeltilfellene. Mer elueringsbuffer brukes hvis ytterligere testing er nødvendig. - Sentrifuge ved ≥ 16 000 x g ved romtemperatur i 1 min for å oppnå det cellefrie DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse ekstraksjonsmetodene ble utført på et begrenset antall tilfeller for å sikre tilstrekkelig utbytte og amplifiserbarhet av cellefritt DNA i sammenligning med cellulært DNA fra glasslegemet (fire) og vandige (fire) prøver. Fra disse prøvene er DNA-utbyttet fra den cellefrie komponenten av disse væskene lik den for den cellulære komponenten (tabell 1). Cellulær og cfDNA fra disse prøvene ble også evaluert ved hjelp av molekylær testing, for eksempel for VRL-assosiert mutasjon MYD88 L265P. En allel-spesifikk sanntids-PCR for MYD88 L265P (figur 1) illustrerer påvisningen av denne VRL-assosierte mutasjonen i både cellulært DNA og cfDNA. I dette eksemplet ser sykdomsbyrden ut til å være høyere i den cellefrie komponenten, illustrert ved en lavere (syklusterskel (Ct). Disse dataene illustrerer at cfDNA ekstrahert fra glasslegeme og vandig humor ved hjelp av denne metoden resulterer i en DNA-kilde som også kan brukes til diagnostisk molekylær testing.
Figur 1: MYD88 L265P allel-spesifikk sanntids-PCR. Representativt amplifikasjonsplott som viser MYD88 L265P allel-spesifikk sanntids-PCR for cellulært og cellefritt DNA (hver PCR-reaksjon utført i duplikat). Terskelen for syklusterskel (Ct) er indikert med den grønne linjen. Punktene der amplifisering av cfDNA (blå og brune spor) og cellulært DNA (røde og grønne spor) - hver utført i duplikat - når terskelen, er merket. Bakgrunnsfluorescens er tilstede nær 1.00e-003. En høyere mutasjonsbyrde er tilstede i den cellefrie komponenten, som demonstrert av en lavere Ct. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mobil | Cellefri | |
| Glassaktig 1 | 130.5 | 67.5 |
| Glassaktig 2 | 337.5 | 105 |
| Glassaktig 3 | 150 | 168 |
| Glassaktig 4 | 1816 | 654 |
| Vandig 1 | 58.5 | 40.5 |
| Vandig 2 | 153 | 225 |
| Vandig 3 | 117 | 454.5 |
| Vandig 4 | TL | 27 |
Tabell 1: Cellulær og cellefri DNA-ekstraksjon gir. DNA-utbytte (i ng) for fire ufortynnede glasslegeme og fire vandige humorvæsker (fremre kammer) fra fire forskjellige individer basert på fluorometrisk DNA-kvantifisering. TL = for lavt til å kvantitisere.
Tilleggsfigur 1: Glassaktig kassettpose. Eksempel på glasskassettpose som inneholder fortynnet glassvæske. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitreoretinal lymfom (VRL) er et aggressivt storcellet B-celle lymfom 1,2,3 hvis symptomer kan etterligne andre vitreoretinale sykdommer 4,5. Molekylær testing av glasslegemet og, mer nylig, vandig humor har blitt en kritisk metode for å stille diagnosen VRL eller utelukke den. Imidlertid er disse væskene svært lave i volum og har ofte lav cellularitet. Mange av cellene i disse væskene kan også bli skadet under innsamling, lagring og behandling13,14,15. Som et resultat er DNA-utbyttet fra disse prøvene ofte lavt. I tillegg må cellene fra disse væskene deles med andre diagnostiske metoder, inkludert cytopatologi og flowcytometri. Cellefritt DNA (cfDNA) i disse væskene gir en annen DNA-kilde som ikke krever intakte celler.
Denne protokollen skiller de cellulære og cellefrie komponentene i glasslegemet eller vandig væske. Glassvæske fortynnes med PBS for å muliggjøre pipettering på grunn av viskositeten. Vandig væske håndteres for å sikre maksimal gjenvinning av denne væsken med svært lavt volum.
En sammenligning av DNA-utbytter av disse to komponentene illustrerer at betydelig ekstra nukleinsyre kan avledes fra den cellefrie komponenten. Molekylær testing av cfDNA, som MYD88 L265P allel-spesifikk sanntids-PCR, demonstrerer at VRL kan detekteres i den cellefrie komponenten av glasslegeme og vandig humor samt den cellulære komponenten. I mange tilfeller er den relative mengden VRL høyere i den cellefrie komponenten enn i cellulær (figur 1).
Ekstraksjon av den cellefrie komponenten av glasslegeme og vandig væske muliggjør molekylær evaluering av en komponent av disse væskene som ellers ville bli kassert. Fordi VRL er representert i cellulære og cellefrie komponenter, kan cellulært DNA og cfDNA kombineres for å maksimere tilgjengelig DNA fra disse begrensede prøvene. Alternativt kan den cellefrie komponenten av disse væskene brukes til molekylær testing, og den cellulære komponenten kan brukes til testing som krever intakte celler, dvs. cytopatologi og flowcytometri. Denne tilnærmingen vil unngå at separate alikoter av disse væskene blir allokert til hver test, noe som kan kompromittere følsomheten til hver test for påvisning av VRL. Gitt suksessen til denne metoden i glasslegeme og vandige prøver, kan denne metoden også være nyttig i andre begrensede væsker for å øke mengden DNA tilgjengelig for molekylær testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Timothy Daniels, MLS (ASCP), MB, QLS, og Helmut Weigelin, MLS (ASCP) var medvirkende til å etablere denne ekstraksjonsmetoden i laboratoriet vårt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
- Coupland, S. E., Damato, B.
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A.
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P.
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
