Summary
Vitreoretinal lenfoma teşhisi için moleküler çalışmalar yapmak üzere vitreus ve sulu mizahtan hücresiz DNA ekstrakte etmek için bir prosedür burada oluşturulmuştur. Yöntem, numunenin hücresel bileşeninden DNA'yı eşzamanlı olarak çıkarma veya yardımcı test için ayırma yeteneği sunar.
Abstract
Vitreoretinal lenfoma (VRL), sıklıkla primer santral sinir sistemi diffüz büyük B hücreli lenfoma olarak sınıflandırılan agresif bir lenfomayı temsil eder. VRL'yi teşhis etmek için vitreus mizahı ve daha yakın zamanda sulu mizah gibi örnekler toplanır. Bu örneklerde VRL için tanı testleri sitoloji, akış sitometrisi ve moleküler testleri içerir. Bununla birlikte, hem sitopatoloji hem de akış sitometrisi, hücresel DNA kullanılarak yapılan moleküler testlerle birlikte, sağlam bütün hücreler gerektirir. Buradaki zorluk, camsı ve sulu mizahın tipik olarak düşük hücreselliğe sahip olması ve toplama, depolama ve işleme sırasında birçok hücrenin tahrip olması gerçeğinde yatmaktadır. Ayrıca, bu numuneler, vitreus mizahının yüksek viskozitesi ve hem vitreus hem de sulu mizahın düşük hacmi nedeniyle moleküler testler için ek zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, camsı ve sulu örneklerden hücresiz DNA'nın ekstraksiyonu için bir yöntem önermektedir. Bu yaklaşım, hücresel DNA'nın ekstraksiyonunu tamamlar veya bu örneklerin hücresel bileşeninin sitoloji ve akış sitometrisi dahil olmak üzere diğer tanı yöntemleri için kullanılmasına izin verir.
Introduction
Vitreoretinal lenfoma (VRL), primer santral sinir sistemi diffüz büyük B hücreli lenfoma 1,2,3 ile ilişkili agresif bir lenfomadır. VRL, merkezi sinir sisteminekatılımı nedeniyle tipik olarak ölümcüldür 1,2. Nadir görülmeklebirlikte 1,4, VRL sıklıkla posterior üveit ve diğer vitreoretinal hastalıklara benzer semptomlarla kendini gösterir 4,5. Sonuç olarak, üveit semptomları sergileyen hastalar, VRL'yi doğrulamak veya ekarte etmek için bir tanıya ihtiyaç duyarlar.
Son zamanlarda, klinik muayene ve laboratuvar bulgularının bir kombinasyonunu içeren VRL tanısı için konsensüs kriterleri yayınlanmıştır6. VRL'yi teşhis etmek için yaygın olarak kullanılan örnekler arasında vitreus mizahı ve daha yakın zamanda sulu mizah7 bulunur. Vitreus mizahı, pars plana vitrektomi adı verilen ve gözün arka segmentine erişim sağlayan cerrahi bir prosedürle elde edilir8.
Sunulan protokolde, hücresel ve cfDNA ekstraksiyonu için hem sulu mizah hem de vitreus mizah örnekleri toplandı. Hastalar uyuşturulduktan ve kornea limbusundan yaklaşık 4 mm uzağa trokarlar yerleştirildikten sonra, kornea limpusuna 1 mL tüberkülin şırıngası kullanılarak yaklaşık 100-200 μL'lik sulu mizah örneği elde edildi. Psödofakik hastalar için, infüzyona steril hava verilerek seyreltilmemiş vitreus elde edildi ve daha fazla miktarda seyreltilmemiş vitreus (3.5 mL'ye kadar) toplandı. Fakik hastalarda, dengeli tuz çözeltisi infüzyonu açılmadan önce yaklaşık 500 ila 1000 μL seyreltilmemiş vitreus çıkarıldı. Bazı durumlarda, infüzyonu sıvıya çevirerek ve bu numuneyi elde etmek için vitrektörü vitreus eteğine yerleştirerek ikincil olarak seyreltilmiş vitreus (500 ila 2.000 μL) toplandı. En seyrek vitreus fraksiyonu ameliyat sonunda kaset torbası korunarak toplandı (Ek Şekil 1). Bu torba patoloji bölümüne ulaştığında, daha sonra DNA ekstraksiyonu için bu torbadan sıvının konik tüplere boşaltılmasından seyreltik vitreus elde edildi.
Vitreus sıvısının sitopatolojisi genellikle altın standart olarak kabul edilir9. Bununla birlikte, birkaç çalışma, işleme ve minimum hücresellik nedeniyle sınırlı hassasiyet göstermiştir10,11,12. Akış sitometrisi, klonal B hücrelerinin tanımlanmasına yardımcı olabilir, ancak aynı zamanda düşük hücresellik ve büyük lenfoma hücrelerinin kırılganlığı ile de sınırlandırılabilir13,14,15. Hem sitopatoloji hem de akış sitometrisi, sağlam tüm hücreler gerektirir. Bu hücrelerin çoğu toplama, depolama ve işleme sırasında yok edilir. Moleküler test, bozulmamış hücrelerden (hücresel DNA) ekstrakte edilen DNA kullanılarak yapıldığında, aynı sınırlamadan muzdariptir. Ek olarak, tüm bu testler için sınırlı vitreus örneğinin bölünmesi, her test için mevcut malzeme miktarını azaltır.
Hücresiz DNA (cfDNA), bozulmamış hücrelere ihtiyaç duymayan başka bir DNA kaynağını temsil eder. Vitreus örneklerinden alınan cfDNA, VRL 16,17 ve uveal melanom 18'in tespiti için kullanılmıştır. Bu protokolde, VRL'yi tespit etmek için vitröz ve sulu sıvıdan hücresel ve hücresiz DNA ekstrakte edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mevcut protokol, insan bakımı yönergelerini ve Michigan Üniversitesi kurumsal inceleme kurulunun (IRB) onayını takip eder. Bunun için IRB'den bilgilendirilmiş onam feragatnamesi alındı. İlgili hastalar için ilgili dahil etme veya dışlama kriterleri yoktur.
1. Hücresel ve hücresiz bileşenlerin ayrılması
NOT: VRL tanı testi için üç tip numune alınabilir: vitreus (seyreltilmemiş; infüzyona başlamadan önce toplanan vitrektomi sıvısı), bir kaset torbası içinde seyreltilmiş vitreus (Şekil 1) ve sulu hümör (gözün ön odasından sıvı).
- Çok viskoz olan seyreltilmemiş vitreus sıvısı için, pipetlemeyi kolaylaştırmak için 3-5 mL PBS ile seyreltin.
- Kaset torbası içindeki seyreltik vitreus için (Ek Şekil 1), sıvıyı 50 mL konik tüplere boşaltın (her 45 mL sıvı için bir tane).
- Sulu mizah hacmi çok düşüktür (<200 μL). Hücrelerin maksimum geri kazanımını sağlamak için, numuneyi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın, numunenin toplandığı orijinal 500 μL mikrosantrifüj tüpünü eşit hacimde PBS ile durulayın ve 1.5 mL'lik tüpe ekleyin.
- Camsı veya sulu sıvıyı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
- Peletlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.
2. Hücresel bileşenden DNA ekstraksiyonu
- Uygun miktarda hücre lizis çözeltisi ekleyin (küçük pelet için 300 μL, daha büyük pelet için 1 mL veya daha fazla) (bkz. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- Tamamen parçalandığında, protein çökelti çözeltisinin toplam hacminin 1/3'ünü ekleyin (300 μL lizat için 100 μL) (Malzeme Tablosuna bakınız).
- 20-30 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Oda sıcaklığında 3.000 x g'da 3 dakika döndürün.
- 300 μL izopropanolü temiz bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Süpernatanı önceki adımdan izopropanol tüpüne dikkatlice pipetleyin.
- 1.5 μL 20 mg / mL glikojen ekleyin (300 μL lizis için) (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Ters çevirerek iyice karıştırın, ardından DNA çökelmesine yardımcı olmak için numuneyi 1 saat ila gece boyunca -20 ° C'lik bir dondurucuya koyun.
- 1.5 mL'lik tüpü oda sıcaklığında 3.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. İzopropanolü pipetleyin.
- 0,5 mL %70 etanol ekleyin ve peleti yıkamak için tüpü ters çevirin.
- Oda sıcaklığında 3.000 x g'da 1 dakika döndürün ve etanolü boşaltın. Etanol yıkamayı bir kez tekrarlayın.
- Çözeltiyi boşaltmak ve peleti veya dekantı kurutmak için tüpü temiz gazlı bez üzerinde ters çevirin. DNA'yı bir mikrosantrifüjde hızlı bir şekilde döndürün ve kalan etanol damlasını ince uçlu tek kullanımlık bir pipet ucuyla pipetleyin (tüpte artık etanol kalmadığında, DNA 5-10 dakika içinde kuru ve hidratlanmaya hazır olmalıdır).
- Kurutulmuş DNA peletine 45 μL DNA hidrasyon çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- Tüpü 50 °C'de bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve 1-2 saat çözünmesine izin verin. Hidrasyon sürecini hızlandırmak için DNA'yı yukarı ve aşağı pipetleyin.
NOT: Örnek çok viskoz görünüyorsa daha fazla DNA hidrasyon solüsyonu ekleyin.
3. Hücresiz DNA ekstraksiyonu
- Adım 1.5'teki süpernatan miktarı değişkendir. Süpernatantın her mililitresi için 70 μL şartlandırma tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- Temizleme boncuklarını girdap yaparak iyice karıştırın. <14 mL hücresiz süpernatan işleniyorsa 10 μL, 14-40 mL işleniyorsa 20 μL temizleme boncukları ekleyin.
- Numune/boncuk karışımını girdaplayarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
- Peleti bozmadan, 10 μL temizleme boncuğu kullanılıyorsa 100 μL ve 20 μL temizleme boncuğu kullanılıyorsa 200 μL geride bırakarak süpernatanı pipetleyin.
- Peletlere eşit hacimde İdrar Pelet Sindirim tamponu (Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin ve peleti girdap veya pipetleme yoluyla iyice yeniden süspanse edin.
- Yeniden süspanse edilmiş pelete Proteinaz K (%5 (h/h)) ekleyin (örneğin, 200 μL karışıma 10 μL Proteinaz K ekleyin) ve hafifçe girdaplama ile iyice karıştırın.
- Pelet karışımını 55 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Sindirim karışımına bir hacim Genomik lizis tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin (örneğin, 210 μL Genomik lizis tamponu ila 210 μL sindirim karışımı) ve vorteksleme ile karıştırın.
- Piyasada bulunan sıkma kolonunu (Malzeme Tablosuna bakın) yeni bir toplama tüpüne aktarın.
- Döndürme kolonuna 200 μL İdrar DNA Hazırlama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
- Kolona 700 μL İdrar DNA yıkama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
- Adımı 200 μL İdrar DNA yıkama tamponu ile tekrarlayın.
- Spin kolonunu DNase / RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Uygun hacimde DNA elüsyon tamponunu (yapılacak moleküler testlere göre) doğrudan kolon matrisine ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika bekletin.
NOT: Örnek durumlarda 30 μL elüsyon tamponu kullanılmıştır. Ek test gerekiyorsa daha fazla elüsyon tamponu kullanılır. - Hücresiz DNA'yı elde etmek için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu ekstraksiyon yöntemleri, vitröz (dört) ve sulu (dört) örneklerden elde edilen hücresel DNA ile karşılaştırıldığında hücresiz DNA'nın yeterli verimini ve amplifiye edilebilirliğini sağlamak için sınırlı sayıda vaka üzerinde gerçekleştirildi. Bu örneklerden, bu sıvıların hücresiz bileşeninden elde edilen DNA verimleri, hücresel bileşeninkine benzer (Tablo 1). Bu örneklerden elde edilen hücresel ve cfDNA, VRL ile ilişkili mutasyon MYD88 L265P gibi moleküler testler kullanılarak da değerlendirildi. MYD88 L265P için alele özgü gerçek zamanlı bir PCR (Şekil 1), hem hücresel DNA'da hem de cfDNA'da bu VRL ile ilişkili mutasyonun tespitini göstermektedir. Bu örnekte, hastalık yükü, daha düşük bir (döngü eşiği (Ct) ile gösterildiği gibi, hücresiz bileşende daha yüksek görünmektedir. Bu veriler, bu yöntem kullanılarak camsı ve sulu mizahtan ekstrakte edilen cfDNA'nın, tanısal moleküler testlere de uygulanabilen bir DNA kaynağı ile sonuçlandığını göstermektedir.
Resim 1: MYD88 L265P alele özgü gerçek zamanlı PCR. Hücresel ve hücresiz DNA için MYD88 L265P aleline özgü gerçek zamanlı PCR'yi gösteren temsili amplifikasyon grafiği (her PCR reaksiyonu çift olarak gerçekleştirilir). Döngü eşiği (Ct) eşiği yeşil çizgi ile gösterilir. CfDNA'nın (mavi ve kahverengi izler) ve hücresel DNA'nın (kırmızı ve yeşil izler) amplifikasyonunun - her biri çift olarak gerçekleştirilir - eşiğe ulaştığı noktalar etiketlenir. Arka plan floresansı 1.00e-003 civarında mevcuttur. Daha düşük bir CT ile gösterildiği gibi, hücresiz bileşende daha yüksek bir mutasyon yükü bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Cep telefonu | Hücresiz | |
| Vitreus 1 | 130.5 | 67.5 |
| Vitreus 2 | 337.5 | 105 |
| Vitreus 3 | 150 | 168 |
| Vitreus 4 | 1816 | 654 |
| Sulu 1 | 58.5 | 40.5 |
| Sulu 2 | 153 | 225 |
| Sulu 3 | 117 | 454.5 |
| Sulu 4 | TL | 27 |
Tablo 1: Hücresel ve hücresiz DNA ekstraksiyon verimleri. Florometrik DNA kantitasyonuna dayalı olarak dört farklı bireyden dört seyreltilmemiş vitreus ve dört sulu mizah (ön kamara) sıvısı için DNA verimi (ng cinsinden). TL = nicelleştirmek için çok düşük.
Ek Şekil 1: Vitreus kaset torbası. Seyreltik vitreus sıvısı içeren vitreus kaset torbası örneği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitreoretinal lenfoma (VRL), semptomları diğer vitreoretinal hastalıkları taklit edebilen agresif büyük bir B hücreli lenfomadır1,2,3 4,5. Vitreusun ve daha yakın zamanda aköz mizahın moleküler testi, VRL tanısı koymak veya ekarte etmek için kritik bir yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, bu sıvılar hacim olarak çok düşüktür ve genellikle düşük hücreselliğe sahiptir. Bu sıvıların içindeki hücrelerin çoğu, toplama, depolama ve işleme sırasında da zarar görebilir13,14,15. Sonuç olarak, bu örneklerden elde edilen DNA verimleri genellikle düşüktür. Ek olarak, bu sıvılardan gelen hücreler, sitopatoloji ve akış sitometrisi dahil olmak üzere diğer tanı yöntemleriyle paylaşılmalıdır. Bu sıvıların içindeki hücresiz DNA (cfDNA), bozulmamış hücrelere ihtiyaç duymayan başka bir DNA kaynağı sağlar.
Bu protokol, vitröz veya sulu sıvının hücresel ve hücresiz bileşenlerini ayırır. Vitreus sıvısı, viskozitesi nedeniyle pipetlemeyi sağlamak için PBS ile seyreltilir. Bu çok düşük hacimli sıvının maksimum geri kazanımını sağlamak için sulu sıvı işlenir.
Bu iki bileşenin DNA verimlerinin karşılaştırılması, hücresiz bileşenden önemli miktarda ek nükleik asidin türetilebileceğini göstermektedir. MYD88 L265P alele özgü gerçek zamanlı PCR gibi cfDNA'nın moleküler testi, VRL'nin hücresel bileşenin yanı sıra vitreus ve sulu mizahın hücresiz bileşeninde de tespit edilebileceğini göstermektedir. Çoğu durumda, göreceli VRL miktarı, hücresiz bileşende hücreselden daha yüksektir (Şekil 1).
Camsı ve sulu sıvının hücresiz bileşeninin ekstraksiyonu, bu sıvıların aksi takdirde atılacak olan bir bileşeninin moleküler değerlendirmesini sağlar. VRL, hücresel ve hücresiz bileşenlerde temsil edildiğinden, bu sınırlı örneklerden elde edilen mevcut DNA'yı en üst düzeye çıkarmak için hücresel DNA ve cfDNA birleştirilebilir. Alternatif olarak, bu sıvıların hücresiz bileşeni moleküler testler için kullanılabilir ve hücresel bileşen, sağlam hücreler, yani sitopatoloji ve akış sitometrisi gerektiren testler için kullanılabilir. Bu yaklaşım, VRL'nin tespiti için her testin hassasiyetini tehlikeye atabilecek her bir teste bu sıvıların ayrı ayrı ayrılmasını önleyecektir. Bu yöntemin camsı ve sulu örneklerdeki başarısı göz önüne alındığında, bu yöntem, moleküler test için mevcut DNA miktarını artırmak için diğer sınırlı sıvılarda da yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Timothy Daniels, MLS (ASCP), MB, QLS ve Helmut Weigelin, MLS (ASCP) laboratuvarımızda bu ekstraksiyon yönteminin kurulmasında etkili oldular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
- Coupland, S. E., Damato, B.
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A.
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P.
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
