Summary
En procedure til ekstraktion af cellefrit DNA fra glasagtig og vandig humor til udførelse af molekylære undersøgelser til diagnosticering af vitreoretinal lymfom er etableret her. Metoden giver mulighed for samtidig at ekstrahere DNA fra prøvens cellulære komponent eller reservere det til supplerende testning.
Abstract
Vitreoretinal lymfom (VRL) repræsenterer et aggressivt lymfom, ofte kategoriseret som primært centralnervesystem diffust stort B-celle lymfom. For at diagnosticere VRL indsamles prøver som glasagtig humor og for nylig vandig humor. Diagnostisk test for VRL på disse prøver inkluderer cytologi, flowcytometri og molekylær testning. Imidlertid kræver både cytopatologi og flowcytometri sammen med molekylær test ved hjælp af cellulært DNA intakte hele celler. Udfordringen ligger i, at glasagtig og vandig humor typisk har lav cellularitet, og mange celler bliver ødelagt under indsamling, opbevaring og behandling. Desuden udgør disse prøver yderligere vanskeligheder for molekylær testning på grund af den høje viskositet af glasagtig humor og det lave volumen af både glasagtig og vandig humor. Denne undersøgelse foreslår en metode til ekstraktion af cellefrit DNA fra glasagtige og vandige prøver. Denne fremgangsmåde supplerer ekstraktionen af cellulært DNA eller tillader, at den cellulære komponent i disse prøver anvendes til andre diagnostiske metoder, herunder cytologi og flowcytometri.
Introduction
Vitreoretinal lymfom (VRL) er et aggressivt lymfom forbundet med primært centralnervesystem diffust stort B-celle lymfom 1,2,3. VRL er typisk dødelig på grund af dets involvering i centralnervesystemet 1,2. Selvom det er sjældent1,4, viser VRL ofte symptomer svarende til posterior uveitis og andre vitreoretinale sygdomme 4,5. Derfor kræver patienter, der udviser uveitissymptomer, en diagnose for enten at bekræfte eller udelukke VRL.
For nylig blev konsensuskriterier for diagnosticering af VRL offentliggjort, som involverer en kombination af klinisk undersøgelse og laboratorieresultater6. Prøver, der almindeligvis anvendes til at diagnosticere VRL, omfatter glasagtig humor og for nylig vandig humor7. Glasagtig humor opnås gennem en kirurgisk procedure kaldet pars plana vitrektomi, som giver adgang til det bageste segment af øjet8.
I den præsenterede protokol blev både vandig humor og glasagtige humorprøver indsamlet til cellulær og cfDNA-ekstraktion. Efter bedøvelse af patienterne og placering af trocars ca. 4 mm fra hornhinden limbus blev der opnået en vandig humorprøve på ca. 100-200 μL ved anvendelse af en 1 ml tuberkulinsprøjte ved hornhinden limbus. For pseudophakiske patienter blev ufortyndet glaslegeme opnået ved at indføre steril luft i infusionen, hvilket muliggjorde opsamling af en større mængde ufortyndet glaslegeme (op til 3,5 ml). Hos phakiske patienter blev ca. 500 til 1000 μL ufortyndet glaslegeme fjernet, før der blev tændt for en infusion af afbalanceret saltopløsning. I nogle tilfælde blev sekundært fortyndet glaslegeme (500 til 2.000 μL) opsamlet ved at skifte infusionen til væske og placere vitrektor i glaslegemet for at opnå denne prøve. Den mest fortyndede glasagtige fraktion blev opsamlet ved at bevare kassetteposen (supplerende figur 1) ved afslutningen af operationen. Når denne pose nåede patologiafdelingen, blev fortyndet glaslegeme opnået ved at dræne væske ud af denne pose i koniske rør til efterfølgende DNA-ekstraktion.
Cytopatologi af glaslegeme betragtes ofte som guldstandarden9. Imidlertid har flere undersøgelser vist begrænset følsomhed på grund af behandling og minimal cellularitet10,11,12. Flowcytometri kan hjælpe med at identificere klonale B-celler, men kan også begrænses af lav cellularitet og skrøbelighed i store lymfomceller13,14,15. Både cytopatologi og flowcytometri kræver intakte hele celler. Mange af disse celler ødelægges under indsamling, opbevaring og behandling. Når molekylær test udføres ved hjælp af DNA ekstraheret fra intakte celler (cellulært DNA), lider det af den samme begrænsning. Desuden reducerer opdelingen af den begrænsede glasagtige prøve til alle disse test mængden af materiale, der er tilgængeligt for hver test.
Cellefrit DNA (cfDNA) repræsenterer en anden kilde til DNA, der ikke kræver intakte celler. cfDNA fra glasagtige prøver er blevet anvendt til påvisning af VRL 16,17 samt uvealt melanom18. I denne protokol ekstraheres cellulært og cellefrit DNA fra glasagtig og vandig væske for at detektere VRL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne for menneskelig pleje og med godkendelse af det institutionelle review board (IRB) ved University of Michigan. Der blev indhentet et afkald på informeret samtykke hertil fra IRB. Der er ingen relevante inklusions- eller eksklusionskriterier for de involverede patienter.
1. Adskillelse af cellulære og cellefrie komponenter
BEMÆRK: Tre typer prøver kan modtages til VRL-diagnostisk test: glaslegeme (ufortyndet; væske fra vitrektomi indsamlet før infusionsstart), fortyndet glaslegeme i en kassettepose (figur 1) og vandig humor (væske fra øjets forreste kammer).
- For ufortyndet glasagtig væske, som er meget tyktflydende, fortyndes med 3-5 ml PBS for at lette pipettering.
- For fortyndet glaslegeme i kassetteposen (supplerende figur 1) drænes væske i 50 ml koniske rør (et for hver 45 ml væske).
- Vandig humor er meget lav i volumen (<200 μL). For at sikre maksimal restitution af celler overføres prøven til et 1,5 ml rør, det originale 500 μL mikrocentrifugerør, som prøven blev opsamlet i, skylles med et tilsvarende volumen PBS og tilsættes til 1,5 ml glasset.
- Centrifuger glasagtig eller vandig væske ved 3.000 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes forsigtigt med en pipette, og pas på ikke at forstyrre de pelleterede celler.
2. DNA-ekstraktion fra den cellulære komponent
- Tilsæt en passende mængde cellelyseopløsning (300 μL for lille pellet, 1 ml eller mere for større pellet) (se materialetabel). Bland ved pipettering op og ned.
- Når den er fuldstændigt lyseret, tilsættes 1/3 samlet volumen af proteinbundfaldsopløsningen (100 μL for 300 μL lysat) (se materialetabel).
- Vortex kraftigt i 20-30 s. Spin i 3 min ved 3.000 x g ved stuetemperatur.
- Der pipetteres 300 μL isopropanol i et rent mikrocentrifugeglas. Supernatanten pipetteres forsigtigt fra det foregående trin til isopropanolrøret.
- Tilsæt 1,5 μL 20 mg/ml glykogen (til 300 μL lysis) (se materialetabel).
- Bland godt ved invertering, og anbring derefter prøven i en -20 °C fryser i 1 time til natten over for at hjælpe med DNA-udfældning.
- Centrifuger 1,5 ml røret i 5 minutter ved 3.000 x g ved stuetemperatur. Isopropanol pipetteres af.
- Tilsæt 0,5 ml 70% ethanol og vend røret for at vaske pelleten.
- Drej i 1 min ved 3.000 x g ved stuetemperatur og dekanter ethanolen. Gentag ethanolvasken én gang.
- Vend røret på rent gasbind for at dræne opløsningen og tør pellet eller dekantering. Drej hurtigt DNA'et i en mikrocentrifuge og pipette den resterende dråbe ethanol med en engangspipetspids (når der ikke er nogen resterende ethanol tilbage i røret, skal DNA'et være tørt og klar til at hydrere på 5-10 minutter).
- Tilsæt 45 μL DNA-hydreringsopløsning (se materialetabel) til den tørrede DNA-pellet.
- Røret anbringes i en varmeblok ved 50 °C, og det opløses i 1-2 timer. Pipet DNA'et op og ned for at fremskynde hydreringsprocessen.
BEMÆRK: Tilføj mere DNA-hydreringsopløsning, hvis prøven ser for tyktflydende ud.
3. Cellefri DNA-ekstraktion
- Mængden af supernatant fra trin 1.5 varierer. Der tilsættes 70 μL konditioneringsbuffer (se materialetabel) for hver milliliter supernatant.
- Bland rydningsperler godt ved hvirvelstrøm. Der tilsættes 10 μL rydningsperler ved forarbejdning <14 ml cellefri supernatant, 20 μL ved behandling af 14-40 ml.
- Bland prøve / perleblanding godt ved hvirvelstrøm. Der centrifugeres ved 3.000 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Uden at forstyrre pelletten pipetteres supernatanten ud, og der efterlades 100 μL, hvis der anvendes 10 μL rydningsperler, og 200 μL, hvis der anvendes 20 μL rydningsperler.
- Tilsæt en lige stor mængde urinpillefordøjelsesbuffer (se materialetabel) til pelleten, og resuspender pelletbrønden ved hvirvelskæring eller pipettering.
- Tilsæt proteinase K (5% (v/v)) til den resuspenderede pellet (tilsæt f.eks. 10 μL proteinase K til 200 μL blanding) og bland godt ved forsigtig hvirvelstrøm.
- Pelletblandingen inkuberes ved 55 °C i 30 min.
- Der tilsættes et volumen genomisk lyseringsbuffer (se materialetabel) til fordøjelsesblandingen (f.eks. 210 μL genomisk lysisbuffer til 210 μL fordøjelsesblanding) og blandes ved hvirvelstrøm.
- Overfør den kommercielt tilgængelige centrifugeringskolonne (se materialetabel) til et nyt opsamlingsrør.
- Tilsæt 200 μL urin-DNA-forberedelsesbuffer til centrifugeringskolonnen, centrifuger ved ≥16.000 x g i 1 min ved stuetemperatur, og kassér gennemstrømning.
- Der tilsættes 700 μL urin-DNA-vaskebuffer til kolonnen, centrifugeres ved ≥16.000 x g i 1 min ved stuetemperatur og kassér gennemstrømningen.
- Gentag trinnet med 200 μL urin-DNA-vaskebuffer.
- Overfør centrifugeringskolonnen til et DNase/RNase-frit mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes et passende volumen DNA-elueringsbuffer (baseret på de molekylære test, der skal udføres) direkte på kolonnematrixen, og den henstår i 3-5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Der blev anvendt 30 μL elueringsbuffer i eksemplerne. Der anvendes mere elueringsbuffer, hvis der kræves yderligere test. - Der centrifugeres ved ≥16.000 x g ved stuetemperatur i 1 min for at opnå det cellefrie DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse ekstraktionsmetoder blev udført på et begrænset antal tilfælde for at sikre tilstrækkeligt udbytte og amplificerbarhed af cellefrit DNA sammenlignet med cellulært DNA fra glasagtige (fire) og vandige (fire) prøver. Fra disse prøver svarer DNA-udbyttet fra den cellefrie komponent af disse væsker til den cellulære komponent (tabel 1). Cellulær og cfDNA fra disse prøver blev også evalueret ved hjælp af molekylær testning, såsom for den VRL-associerede mutation MYD88 L265P. En allelspecifik realtids PCR for MYD88 L265P (figur 1) illustrerer påvisningen af denne VRL-associerede mutation i både cellulært DNA og cfDNA. I dette eksempel synes sygdomsbyrden at være højere i den cellefrie komponent, som illustreret ved en lavere (cyklustærskel (Ct). Disse data illustrerer, at cfDNA ekstraheret fra glasagtig og vandig humor ved hjælp af denne metode resulterer i en kilde til DNA, der også kan anvendes til diagnostisk molekylær testning.
Figur 1: MYD88 L265P allelspecifik PCR i realtid. Repræsentativt amplifikationsplot, der viser MYD88 L265P allelspecifik realtids-PCR for cellulært og cellefrit DNA (hver PCR-reaktion udført i to eksemplarer). Tærsklen for cyklustærskel (Ct) er angivet med den grønne linje. De punkter, hvor amplifikation af cfDNA (blå og brune spor) og cellulært DNA (røde og grønne spor) - hver udført i to eksemplarer - når tærsklen, er mærket. Baggrundsfluorescens er til stede nær 1.00e-003. En højere mutationsbyrde er til stede i den cellefrie komponent, som demonstreret af en lavere Ct. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mobiltelefon | Uden celler | |
| Glaslegeme 1 Annoncer | 130.5 | 67.5 |
| Glaslegeme 2 | 337.5 | 105 |
| Glaslegeme 3 | 150 | 168 |
| Glaslegeme 4 | 1816 | 654 |
| Vandig 1 | 58.5 | 40.5 |
| Vandig 2 | 153 | 225 |
| Vandig 3 | 117 | 454.5 |
| Vandig 4 | TL | 27 |
Tabel 1: Cellulære og cellefri DNA-ekstraktionsudbytter. DNA-udbytte (i ng) for fire ufortyndede glasagtige og fire vandige humorvæsker (forreste kammer) fra fire forskellige individer baseret på fluorometrisk DNA-kvantificering. TL = for lav til at kvantificere.
Supplerende figur 1: Glaslegeme kassettepose. Eksempel på glasagtig kassettepose, der indeholder fortyndet glaslegeme. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitreoretinal lymfom (VRL) er et aggressivt stort B-celle lymfom 1,2,3, hvis symptomer kan efterligne andre vitreoretinale sygdomme 4,5. Molekylær test af glaslegeme og for nylig vandig humor er blevet en kritisk metode til at stille diagnosen VRL eller udelukke den. Imidlertid er disse væsker meget lave i volumen og har ofte lav cellularitet. Mange af cellerne i disse væsker kan også blive beskadiget under indsamling, opbevaring og behandlingaf 13,14,15. Som følge heraf er DNA-udbyttet fra disse prøver ofte lavt. Derudover skal cellerne fra disse væsker deles med andre diagnostiske metoder, herunder cytopatologi og flowcytometri. Cellefrit DNA (cfDNA) i disse væsker giver en anden kilde til DNA, der ikke kræver intakte celler.
Denne protokol adskiller de cellulære og cellefrie komponenter i glasagtig eller vandig væske. Glaslegemet væske fortyndes med PBS for at muliggøre pipettering på grund af dets viskositet. Vandig væske håndteres for at sikre maksimal genvinding af denne meget lave volumen væske.
En sammenligning af DNA-udbytter af disse to komponenter illustrerer, at betydelig yderligere nukleinsyre kan udledes af den cellefrie komponent. Molekylær test af cfDNA, såsom MYD88 L265P allelspecifik realtids PCR, viser, at VRL kan detekteres i den cellefrie komponent af glasagtig og vandig humor såvel som den cellulære komponent. I mange tilfælde er den relative mængde VRL højere i den cellefrie komponent end i cellulære (figur 1).
Ekstraktion af den cellefrie komponent i glasagtig og vandig væske muliggør molekylær evaluering af en komponent af disse væsker, der ellers ville blive kasseret. Fordi VRL er repræsenteret i cellulære og cellefrie komponenter, kunne cellulært DNA og cfDNA kombineres for at maksimere det tilgængelige DNA fra disse begrænsede prøver. Alternativt kan den cellefrie komponent i disse væsker anvendes til molekylær testning, og den cellulære komponent kan anvendes til testning, der kræver intakte celler, dvs. cytopatologi og flowcytometri. På denne måde undgås det, at der allokeres separate delprøver af disse væsker til hver test, hvilket kan kompromittere hver tests følsomhed med hensyn til påvisning af VRL. I betragtning af succesen med denne metode i glasagtige og vandige prøver kan denne metode også være nyttig i andre begrænsede væsker for at øge mængden af DNA, der er tilgængelig til molekylær testning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Timothy Daniels, MLS (ASCP), MB, QLS og Helmut Weigelin, MLS (ASCP) var medvirkende til at etablere denne ekstraktionsmetode i vores laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
- Coupland, S. E., Damato, B.
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A.
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P.
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
