Summary
כאן נקבע הליך להפקת DNA נטול תאים מהומור זגוגי ומימי לביצוע מחקרים מולקולריים לאבחון לימפומה זגוגית. השיטה מציעה את היכולת לחלץ במקביל DNA מהמרכיב התאי של הדגימה או לשמור אותו לבדיקות נלוות.
Abstract
לימפומה זגוגית (VRL) מייצגת לימפומה אגרסיבית, המסווגת לעתים קרובות כלימפומה ראשונית של מערכת העצבים המרכזית המפזרת תאי B גדולים. כדי לאבחן VRL, דגימות כגון הומור זגוגית, ולאחרונה, הומור מימי נאספים. בדיקות אבחון VRL על דגימות אלה כוללות ציטולוגיה, ציטומטריית זרימה ובדיקות מולקולריות. עם זאת, הן ציטופתולוגיה והן ציטומטריית זרימה, יחד עם בדיקות מולקולריות באמצעות DNA תאי, מחייבות תאים שלמים שלמים. האתגר טמון בעובדה שלהומור זגוגי ומימי יש בדרך כלל תאיות נמוכה, ותאים רבים נהרסים במהלך האיסוף, האחסון והעיבוד. יתר על כן, דגימות אלה מציבות קשיים נוספים לבדיקה מולקולרית בשל הצמיגות הגבוהה של הומור הזגוגית והנפח הנמוך של הומור הזגוגית והמימית כאחד. מחקר זה מציע שיטה לחילוץ דנ"א נטול תאים מדגימות זגוגיות ומימיות. גישה זו משלימה את מיצוי הדנ"א התאי או מאפשרת להשתמש במרכיב התאי של דגימות אלה לשיטות אבחון אחרות, כולל ציטולוגיה וציטומטריית זרימה.
Introduction
לימפומה זגוגית (VRL) היא לימפומה אגרסיבית הקשורה ללימפומה ראשונית של מערכת העצבים המרכזית, מפושטת של תאי B גדולים 1,2,3. VRL הוא בדרך כלל קטלני בשל מעורבותו במערכת העצבים המרכזית 1,2. למרות נדיר1,4, VRL לעתים קרובות מציג סימפטומים דומים uveitis האחורי ומחלות זגוגית אחרות 4,5. כתוצאה מכך, חולים המציגים תסמיני אובאיטיס דורשים אבחנה כדי לאשר או לשלול VRL.
לאחרונה פורסמו קריטריונים מוסכמים לאבחון VRL, הכוללים שילוב של בדיקה קלינית וממצאי מעבדה6. דגימות נפוצות לאבחון VRL כוללות הומור זגוגית, ולאחרונה, הומור מימי7. הומור הזגוגית מתקבל באמצעות הליך כירורגי שנקרא pars plana vitrectomy, המאפשר גישה לחלק האחורי של העין8.
בפרוטוקול המוצג, נאספו דגימות הומור מימי והומור זגוגי לצורך מיצוי תאי ו- cfDNA. לאחר הרדמת החולים והנחת טרוקרים במרחק של כ-4 מ"מ מלימבוס הקרנית, התקבלה דגימת הומור מימית של כ-100-200 מיקרוליטר באמצעות מזרק שחפת 1 מ"ל בלימבוס הקרנית. עבור חולים פסאודופאקים, זגוגית לא מדוללת הושגה על ידי החדרת אוויר סטרילי לעירוי, המאפשר איסוף של כמות גדולה יותר של זגוגית לא מדוללת (עד 3.5 מ"ל). בחולים פאקיים, כ 500 עד 1000 μL של זגוגית לא מדוללת הוסרו לפני הפעלת עירוי של תמיסת מלח מאוזנת. במקרים מסוימים, זגוגית מדוללת משנית (500 עד 2,000 μL) נאספה על ידי החלפת העירוי לנוזל והצבת הוויטרקטור בתוך חצאית הזגוגית כדי לקבל דגימה זו. החלק הזגוגי המדולל ביותר נאסף על ידי שימור תיק הקלטות (איור משלים 1) בסוף הניתוח. ברגע ששקית זו הגיעה למחלקה הפתולוגית, הזגוגית המדוללת התקבלה מניקוז נוזל מתוך שקית זו לצינורות חרוטיים לצורך מיצוי DNA לאחר מכן.
ציטופתולוגיה של נוזל הזגוגית נחשבת לעתים קרובות לתקן הזהב9. עם זאת, מספר מחקרים הדגימו רגישות מוגבלת עקב עיבוד וסלולריות מינימלית10,11,12. ציטומטריית זרימה יכולה לסייע בזיהוי תאי B משובטים, אך יכולה להיות מוגבלת גם על ידי תאים נמוכים ושבריריות של תאי לימפומה גדולים13,14,15. הן ציטופתולוגיה והן ציטומטריית זרימה דורשות תאים שלמים שלמים. רבים מהתאים האלה נהרסים במהלך האיסוף, האחסון והעיבוד. כאשר הבדיקה המולקולרית מבוצעת באמצעות דנ"א המופק מתאים שלמים (דנ"א תאי), הוא סובל מאותה מגבלה. בנוסף, חלוקת דגימת הזגוגית המוגבלת לכל הבדיקות הללו מפחיתה את כמות החומר הזמין לכל בדיקה.
דנ"א נטול תאים (cfDNA) מייצג מקור נוסף של דנ"א שאינו דורש תאים שלמים. cfDNA מדגימות זגוגית שימש לזיהוי VRL 16,17 וכן מלנומה של uveal18. בפרוטוקול זה, דנ"א תאי ונטול תאים מופקים מנוזל זגוגי ומימי כדי לזהות VRL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי עוקב אחר הנחיות הטיפול האנושי ובאישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של אוניברסיטת מישיגן. ויתור על הסכמה מדעת התקבל לכך מ-IRB. אין קריטריוני הכללה או הדרה רלוונטיים עבור המטופלים המעורבים.
1. הפרדת רכיבים סלולריים ורכיבים נטולי תאים
הערה: ניתן לקבל שלושה סוגים של דגימות לבדיקת אבחון VRL: זגוגית (לא מדוללת; נוזל מויטרקטומיה שנאסף לפני תחילת העירוי), זגוגית מדוללת בתוך שקית קסטה (איור 1), והומור מימי (נוזל מהחדר הקדמי של העין).
- עבור נוזל זגוגית לא מדולל, שהוא צמיג מאוד, לדלל עם 3-5 מ"ל PBS כדי להקל על pipetting.
- עבור זגוגית מדוללת בתוך שקית הקלטות (איור משלים 1), יש לנקז את הנוזל לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל (אחד לכל 45 מ"ל נוזל).
- הומור מימי נמוך מאוד בנפח (<200 μL). כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של תאים, להעביר את הדגימה לצינור 1.5 מ"ל, לשטוף את צינור מיקרוצנטריפוגה המקורי 500 μL הדגימה נאספה עם נפח שווה של PBS, ולהוסיף צינור 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה זגוגית או נוזל מימי ב 3,000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה, נזהר לא להפריע את התאים pelleted.
2. מיצוי DNA מהרכיב התאי
- הוסף כמות מתאימה של תמיסת ליזה תאית (300 מיקרוליטר עבור גלולה קטנה, 1 מ"ל או יותר עבור גלולה גדולה יותר) (ראה טבלת חומרים). מערבבים על ידי פיטינג למעלה ולמטה.
- לאחר ליזה מלאה, הוסף 1/3 נפח כולל של תמיסת המשקעים החלבוניים (100 μL עבור 300 μL ליזט) (ראה טבלת חומרים).
- מערבולת במרץ במשך 20-30 שניות. סבבו במשך 3 דקות במהירות של 3,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
- פיפטה 300 μL של איזופרופנול לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי. בזהירות פיפטה את supernatant מן השלב הקודם אל צינור isopropanol.
- הוסף 1.5 μL של 20 מ"ג/מ"ל גליקוגן (עבור 300 μL ליזה) (ראה טבלת חומרים).
- יש לערבב היטב בהיפוך, ולאחר מכן להכניס את הדגימה למקפיא בטמפרטורה של -20°C למשך שעה עד לילה כדי לסייע במשקעים ב-DNA.
- צנטריפוגה את הצינור 1.5 מ"ל למשך 5 דקות ב 3,000 x גרם בטמפרטורת החדר. פיפטה מהאיזופרופנול.
- הוסף 0.5 מ"ל של אתנול 70% והפוך את הצינור כדי לשטוף את הכדור.
- יש לסחור במשך דקה אחת במהירות של 3,000 x גרם בטמפרטורת החדר ולרוקן את האתנול. חזור על שטיפת אתנול פעם אחת.
- הפוך את הצינור על גזה נקייה כדי לנקז את התמיסה ולייבש את הגלולה או decant. סובבו במהירות את הדנ"א במיקרוצנטריפוגה ופיפטה את טיפת האתנול הנותרת עם קצה פיפט חד פעמי דק (ברגע שלא נשאר אתנול שאריות בצינור, הדנ"א צריך להיות יבש ומוכן להתייבש תוך 5-10 דקות).
- הוסף 45 μL של תמיסת לחות DNA (ראה טבלת חומרים) לכדורית ה- DNA המיובשת.
- הניחו את הצינור בבלוק חימום בטמפרטורה של 50°C ואפשרו לו להתסיס למשך 1-2 שעות. מפטמים את הדנ"א מעלה ומטה כדי להאיץ את תהליך ההידרציה.
הערה: הוסף תמיסת הידרציה נוספת של DNA אם הדגימה נראית צמיגה מדי.
3. מיצוי DNA ללא תאים
- כמות הסופרנאטנט משלב 1.5 משתנה. הוסף 70 μL של חיץ מיזוג (ראה טבלת חומרים) עבור כל מיליליטר של supernatant.
- מערבבים היטב חרוזי ניקוי על ידי מערבולת. הוסף 10 μL של חרוזי ניקוי אם עיבוד <14 מ"ל של supernatant ללא תאים, 20 μL אם עיבוד 14-40 מ"ל.
- מערבבים היטב מדגם / תערובת חרוזים על ידי ערבול. צנטריפוגה במהירות 3,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- מבלי להפריע לכדורית, פיפטה החוצה את supernatant משאיר מאחור 100 μL אם 10 μL של חרוזי ניקוי משמשים, ו 200 μL אם 20 μL של חרוזי ניקוי משמשים.
- הוסף נפח שווה של מאגר עיכול גלולות השתן (ראה טבלת חומרים) לגלולה והשהה מחדש את הגלולה היטב על ידי מערבולות או פיפטציה.
- הוסף פרוטאינאז K (5% (v/v)) לגלולה המרחפת מחדש (למשל, הוסף 10 μL של פרוטאינאז K לתערובת 200 μL) וערבב היטב על ידי מערבולות עדינות.
- לדגור על תערובת הכדוריות ב 55 ° C במשך 30 דקות.
- הוסף נפח אחד של חיץ ליזה גנומי (ראה טבלת חומרים) לתערובת העיכול (למשל, חיץ ליזה גנומי של 210 מיקרוליטר לתערובת עיכול של 210 מיקרוליטר) וערבב באמצעות מערבולת.
- העבר את עמודת הספין הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) לשפופרת איסוף חדשה.
- הוסף 200 μL של מאגר הכנת DNA בשתן לעמודת הספין, צנטריפוגה ב ≥16,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והשליך את הזרימה.
- הוסף 700 μL של מאגר שטיפת DNA בשתן לעמודה, צנטריפוגה ב ≥16,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר והשליך את הזרימה.
- חזור על השלב עם מאגר שטיפת DNA של 200 μL בשתן.
- העבר את עמודת הספין לצינור מיקרוצנטריפוגה ללא DNase/RNase.
- הוסף את הנפח המתאים של מאגר אלוציית DNA (בהתבסס על הבדיקות המולקולריות שיש לבצע) ישירות על מטריצת העמודה ואפשר לה לעמוד 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: 30 μL של מאגר elution שימש במקרים לדוגמה. נעשה שימוש במאגר אלוציה נוסף אם נדרשות בדיקות נוספות. - צנטריפוגה במהירות של ≥16,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי לקבל את הדנ"א נטול התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטות מיצוי אלה בוצעו במספר מצומצם של מקרים כדי להבטיח תפוקה נאותה והגברה של DNA ללא תאים בהשוואה לדנ"א תאי מדגימות הזגוגית (ארבע) והמימית (ארבע). מדגימות אלה, תפוקת הדנ"א מהרכיב נטול התאים של נוזלים אלה דומה לזו של הרכיב התאי (טבלה 1). תאים ו- cfDNA מדגימות אלה הוערכו גם באמצעות בדיקות מולקולריות, כגון עבור מוטציה הקשורה ל- VRL MYD88 L265P. PCR ספציפי לאלל בזמן אמת עבור MYD88 L265P (איור 1) מדגים את הזיהוי של מוטציה זו הקשורה ל-VRL הן בדנ"א תאי והן ב-cfDNA. בדוגמה זו, נראה כי נטל המחלה גבוה יותר ברכיב נטול תאים, כפי שמודגם על ידי נמוך יותר (סף מחזור (Ct). נתונים אלה ממחישים כי cfDNA המופק מהומור זגוגי ומימי בשיטה זו יוצר מקור DNA שניתן ליישם גם בבדיקות מולקולריות אבחנתיות.
איור 1: MYD88 L265P PCR ספציפי לאלל בזמן אמת. תרשים הגברה מייצג המציג PCR בזמן אמת ספציפי לאלל MYD88 L265P עבור DNA סלולרי וללא תאים (כל תגובת PCR מבוצעת כפולה). הסף לסף מחזור (Ct) מסומן על ידי הקו הירוק. מסומנות הנקודות שבהן הגברה של cfDNA (עקבות כחולות וחומות) ודנ"א תאי (עקבות אדומות וירוקות) - כל אחת מהן מבוצעת בשכפול - מגיעות לסף. פלואורסצנטיות רקע קיימת ליד 1.00e-003. עומס מוטציות גבוה יותר קיים ברכיב נטול תאים, כפי שמודגם על ידי CT נמוך יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| טלפון נייד | ללא תאים | |
| זגוגית 1 | 130.5 | 67.5 |
| זגוגית 2 | 337.5 | 105 |
| זגוגית 3 | 150 | 168 |
| זגוגית 4 | 1816 | 654 |
| מימי 1 | 58.5 | 40.5 |
| מימי 2 | 153 | 225 |
| מימי 3 | 117 | 454.5 |
| מימי 4 | TL | 27 |
טבלה 1: מיצוי דנ"א תאי וללא תאים מניב. תפוקת DNA (ב-ng) עבור ארבעה נוזלי זגוגית לא מדוללים וארבעה נוזלי הומור מימי (החדר הקדמי) מארבעה פרטים שונים בהתבסס על כימות DNA פלואורומטרי. TL = נמוך מכדי לכמת.
איור משלים 1: תיק קסטה זגוגית. דוגמה לשקית קסטה זגוגית המכילה נוזל זגוגית מדולל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לימפומה זגוגית (VRL) היא לימפומה אגרסיבית של תאי B גדולים 1,2,3 שתסמיניה יכולים לחקות מחלות זגוגיות אחרות 4,5. בדיקה מולקולרית של זגוגית, ולאחרונה גם הומור מימי, הפכה לשיטה קריטית לאבחנה של VRL או לשלילתה. עם זאת, נוזלים אלה הם נמוכים מאוד בנפח ולעתים קרובות יש תאים נמוכים. רבים מהתאים בתוך נוזלים אלה יכולים גם להיפגע במהלך איסוף, אחסון ועיבוד13,14,15. כתוצאה מכך, תפוקות הדנ"א מדגימות אלה הן לעתים קרובות נמוכות. בנוסף, יש לשתף את התאים מנוזלים אלה עם שיטות אבחון אחרות, כולל ציטופתולוגיה וציטומטריית זרימה. דנ"א ללא תאים (cfDNA) בתוך נוזלים אלה מספק מקור נוסף של דנ"א שאינו דורש תאים שלמים.
פרוטוקול זה מפריד בין המרכיבים התאיים ונטולי התאים של נוזל הזגוגית או המימי. נוזל הזגוגית מדולל עם PBS כדי לאפשר פיפטינג בשל צמיגותו. נוזל מימי מטופל כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של נוזל זה בנפח נמוך מאוד.
השוואה של תפוקות הדנ"א של שני מרכיבים אלה ממחישה כי ניתן להפיק חומצת גרעין משמעותית נוספת מהרכיב נטול התא. בדיקות מולקולריות של cfDNA, כגון MYD88 L265P אלל ספציפי בזמן אמת, מראות כי VRL יכול להיות מזוהה ברכיב ללא תאים של הומור זגוגית ומימית, כמו גם את המרכיב התאי. במקרים רבים, הכמות היחסית של VRL גבוהה יותר ברכיב נטול תאים מאשר בתא (איור 1).
מיצוי הרכיב נטול התאים של נוזל הזגוגית והמימית מאפשר הערכה מולקולרית של רכיב בנוזלים אלה שאחרת היה מושלך. מאחר ש-VRL מיוצג ברכיבים תאיים ונטולי תאים, דנ"א תאי ו-cfDNA יכולים להיות משולבים כדי למקסם את הדנ"א הזמין מהדגימות המוגבלות האלה. לחלופין, הרכיב הנטול-תאי של נוזלים אלה יכול לשמש לבדיקה מולקולרית, והרכיב התאי יכול לשמש לבדיקה הדורשת תאים שלמים, כלומר ציטופתולוגיה וציטומטריית זרימה. גישה זו תמנע הקצאה נפרדת של נוזלים אלה לכל בדיקה, מה שעלול לפגוע ברגישות של כל בדיקה לזיהוי VRL. בהתחשב בהצלחה של שיטה זו בדגימות זגוגית ומימית, שיטה זו עשויה להיות שימושית גם בנוזלים מוגבלים אחרים כדי להגדיל את כמות ה- DNA הזמין לבדיקה מולקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
טימותי דניאלס, MLS(ASCP), MB, QLS, והלמוט וייגלין, MLS (ASCP) סייעו בביסוס שיטת מיצוי זו במעבדה שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
- Coupland, S. E., Damato, B.
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A.
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P.
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
