Summary
Une procédure d’extraction de l’ADN acellulaire de l’humeur vitréenne et aqueuse pour effectuer des études moléculaires pour diagnostiquer le lymphome vitréo-rétinien est établie ici. La méthode offre la possibilité d’extraire simultanément l’ADN de la composante cellulaire de l’échantillon ou de le réserver pour des tests auxiliaires.
Abstract
Le lymphome vitréo-rétinien (VRL) représente un lymphome agressif, souvent classé comme lymphome diffus à grandes cellules B du système nerveux central. Pour diagnostiquer la VRL, des échantillons tels que l’humeur vitrée et, plus récemment, l’humeur aqueuse sont collectés. Les tests diagnostiques de VRL sur ces échantillons comprennent la cytologie, la cytométrie en flux et les tests moléculaires. Cependant, la cytopathologie et la cytométrie en flux, ainsi que les tests moléculaires utilisant l’ADN cellulaire, nécessitent des cellules entières intactes. Le défi réside dans le fait que l’humeur vitrée et l’humeur aqueuse ont généralement une faible cellularité et que de nombreuses cellules sont détruites lors de la collecte, du stockage et du traitement. De plus, ces échantillons posent des difficultés supplémentaires pour les tests moléculaires en raison de la viscosité élevée de l’humeur vitrée et du faible volume de l’humeur vitrée et aqueuse. Cette étude propose une méthode d’extraction de l’ADN acellulaire à partir d’échantillons vitrés et aqueux. Cette approche complète l’extraction de l’ADN cellulaire ou permet d’utiliser la composante cellulaire de ces échantillons pour d’autres méthodes de diagnostic, notamment la cytologie et la cytométrie en flux.
Introduction
Le lymphome vitréo-rétinien (VRL) est un lymphome agressif associé à un lymphome diffus à grandes cellules B du système nerveux central 1,2,3. La VRL est généralement mortelle en raison de son implication dans le système nerveux central 1,2. Bien que rare1,4, le VRL présente souvent des symptômes similaires à ceux de l’uvéite postérieure et d’autres maladies vitréo-rétiniennes 4,5. Par conséquent, les patients présentant des symptômes d’uvéite ont besoin d’un diagnostic pour confirmer ou infirmer la VRL.
Récemment, des critères consensuels pour le diagnostic de la VRL ont été publiés, qui impliquent une combinaison d’examen clinique et de résultats de laboratoire6. Les échantillons couramment utilisés pour diagnostiquer la VRL comprennent l’humeur vitrée et, plus récemment, l’humeur aqueuse7. L’humeur vitrée est obtenue par une intervention chirurgicale appelée vitrectomie pars plana, qui permet d’accéder au segment postérieur de l’œil8.
Dans le protocole présenté, des échantillons d’humeur aqueuse et d’humeur vitrée ont été prélevés pour l’extraction cellulaire et l’ADNcf. Après anesthésier les patients et placer des trocarts à environ 4 mm du limbe cornéen, un échantillon d’humeur aqueuse d’environ 100 à 200 μL a été obtenu à l’aide d’une seringue à tuberculine de 1 mL au niveau du limbe cornéen. Pour les patients pseudophaques, le vitré non dilué a été obtenu en introduisant de l’air stérile dans la perfusion, ce qui a permis de recueillir une plus grande quantité de vitré non dilué (jusqu’à 3,5 ml). Chez les patients phaques, environ 500 à 1000 μL de vitré non dilué ont été retirés avant d’activer une perfusion de solution saline équilibrée. Dans certains cas, du vitré dilué secondairement (500 à 2 000 μL) a été prélevé en changeant la perfusion en liquide et en plaçant le vitrecteur dans la jupe vitréenne pour obtenir cet échantillon. La fraction vitréenne la plus diluée a été recueillie en conservant le sac de cassette (figure supplémentaire 1) à la fin de l’opération. Une fois que ce sac est arrivé au service de pathologie, le vitré dilué a été obtenu en drainant le liquide de ce sac dans des tubes coniques pour l’extraction ultérieure de l’ADN.
La cytopathologie du liquide vitré est souvent considérée comme l’étalon-or9. Cependant, plusieurs études ont démontré une sensibilité limitée en raison du traitement et d’une cellularité minimale10,11,12. La cytométrie en flux peut aider à identifier les lymphocytes B clonaux, mais peut également être limitée par une faible cellularité et la fragilité des grandes cellules de lymphome13,14,15. La cytopathologie et la cytométrie en flux nécessitent toutes deux des cellules entières intactes. Beaucoup de ces cellules sont détruites lors de la collecte, de l’entreposage et du traitement. Lorsque les tests moléculaires sont effectués à partir d’ADN extrait de cellules intactes (ADN cellulaire), ils souffrent de cette même limitation. De plus, la division de l’échantillon vitreux limité pour tous ces tests réduit la quantité de matériel disponible pour chaque test.
L’ADN acellulaire (cfDNA) représente une autre source d’ADN qui ne nécessite pas de cellules intactes. L’ADNcf provenant d’échantillons de vitré a été utilisé pour la détection du VRL 16,17 ainsi que du mélanome uvéal18. Dans ce protocole, l’ADN cellulaire et acellulaire est extrait du liquide vitré et aqueux pour détecter le VRL.
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Protocol
Le présent protocole suit les lignes directrices sur les soins à la personne et avec l’approbation du comité d’examen institutionnel (IRB) de l’Université du Michigan. Une renonciation au consentement éclairé a été obtenue à cet effet auprès de la CISR. Il n’y a pas de critères d’inclusion ou d’exclusion pertinents pour les patients concernés.
1. Séparation des composants cellulaires et acellulaires
REMARQUE : Trois types d’échantillons peuvent être prélevés pour les tests diagnostiques de la VRL : le vitré (non dilué ; liquide de vitrectomie recueilli avant le début de la perfusion), le vitré dilué dans un sac de cassette (figure 1) et l’humeur aqueuse (liquide de la chambre antérieure de l’œil).
- Pour le liquide vitré non dilué, qui est très visqueux, diluer avec 3 à 5 mL de PBS pour faciliter le pipetage.
- Pour diluer le vitré dans le sac de la cassette (figure supplémentaire 1), vider le liquide dans des tubes coniques de 50 ml (un pour 45 mL de liquide).
- L’humeur aqueuse est très faible en volume (<200 μL). Pour assurer une récupération maximale des cellules, transférez l’échantillon dans un tube de 1,5 ml, rincez le tube de microcentrifugation d’origine de 500 μl dans lequel l’échantillon a été prélevé avec un volume égal de PBS et ajoutez-le au tube de 1,5 ml.
- Centrifuger un liquide vitré ou aqueux à 3 000 x g pendant 15 min à température ambiante.
- Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette, en veillant à ne pas perturber les cellules granulées.
2. Extraction de l’ADN à partir du composant cellulaire
- Ajouter une quantité appropriée de solution de lyse cellulaire (300 μL pour les petits granulés, 1 mL ou plus pour les granulés plus gros) (voir le tableau des matériaux). Mélangez en pipetant de haut en bas.
- Lorsqu’il est complètement lysé, ajouter 1/3 du volume total de la solution de précipité protéique (100 μL pour 300 μL de lysat) (voir le tableau des matériaux).
- Tourbillonner vigoureusement pendant 20-30 s. Essorer pendant 3 min à 3 000 x g à température ambiante.
- Pipeter 300 μL d’isopropanol dans un tube de microcentrifugation propre. Pipeter soigneusement le surnageant de l’étape précédente dans le tube d’isopropanol.
- Ajouter 1,5 μL de glycogène à 20 mg/mL (pour une lyse à 300 μL) (voir le tableau des matériaux).
- Bien mélanger par inversion, puis placer l’échantillon dans un congélateur à -20 °C pendant 1 h à toute la nuit pour faciliter la précipitation de l’ADN.
- Centrifuger le tube de 1,5 ml pendant 5 min à 3 000 x g à température ambiante. Pipeter l’isopropanol.
- Ajouter 0,5 mL d’éthanol à 70 % et retourner le tube pour laver la pastille.
- Essorez pendant 1 min à 3 000 x g à température ambiante et transvasez l’éthanol. Répétez le lavage à l’éthanol une fois.
- Retournez le tube sur de la gaze propre pour drainer la solution et séchez la pastille ou la carafe. Faites tourner rapidement l’ADN dans une microcentrifugeuse et pipetez la goutte d’éthanol restante avec un embout de pipette jetable à pointe fine (une fois qu’il ne reste plus d’éthanol résiduel dans le tube, l’ADN devrait être sec et prêt à s’hydrater en 5 à 10 minutes).
- Ajouter 45 μL de solution d’hydratation de l’ADN (voir le tableau des matériaux) à la pastille d’ADN séché.
- Placez le tube dans un bloc chauffant à 50 °C et laissez-le solubiliser pendant 1 à 2 h. Pipetez l’ADN de haut en bas pour accélérer le processus d’hydratation.
REMARQUE : Ajoutez plus de solution d’hydratation d’ADN si l’échantillon semble trop visqueux.
3. Extraction d’ADN acellulaire
- La quantité de surnageant à partir de l’étape 1.5 est variable. Ajouter 70 μL de tampon de conditionnement (voir le tableau des matériaux) pour chaque millilitre de surnageant.
- Bien mélanger les billes de dégagement par vortex. Ajouter 10 μL de billes de déblaiement si vous traitez <14 mL de surnageant acellulaire, 20 μL si vous traitez 14 à 40 mL.
- Bien mélanger le mélange échantillon/billes par vortex. Centrifuger à 3 000 x g pendant 15 min à température ambiante.
- Sans perturber la pastille, pipeter le surnageant en laissant 100 μL si 10 μL de billes de clarification sont utilisées, et 200 μL si 20 μL de billes de clarification sont utilisées.
- Ajouter un volume égal de tampon de digestion des pastilles d’urine (voir le tableau des matériaux) à la pastille et bien remettre la pastille en suspension par vortex ou pipetage.
- Ajouter la protéinase K (5 % (v/v)) à la pastille remise en suspension (p. ex., ajouter 10 μL de protéinase K au mélange de 200 μL) et bien mélanger en effectuant un léger vortex.
- Incuber le mélange de granulés à 55 °C pendant 30 min.
- Ajouter un volume de tampon de lyse génomique (voir le tableau des matériaux) au mélange de digestion (p. ex., 210 μL de tampon de lyse génomique pour 210 μL de mélange de digestion) et mélanger par vortex.
- Transférez la colonne d’essorage disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) dans un nouveau tube de collecte.
- Ajouter 200 μL de tampon de préparation de l’ADN urinaire dans la colonne de centrifugation, centrifuger à ≥16 000 x g pendant 1 min à température ambiante et jeter l’écoulement.
- Ajouter 700 μL de tampon de lavage de l’ADN urinaire dans la colonne, centrifuger à ≥16 000 x g pendant 1 min à température ambiante et jeter l’écoulement.
- Répétez l’étape avec 200 μL de tampon de lavage de l’ADN urinaire.
- Transférez la colonne de centrifugation dans un tube de microcentrifugation sans DNase/RNase.
- Ajouter le volume approprié de tampon d’élution d’ADN (en fonction des tests moléculaires à effectuer) directement sur la matrice de colonne et laisser reposer pendant 3 à 5 minutes à température ambiante.
NOTE : 30 μL de tampon d’élution ont été utilisés dans les cas d’exemple. Plus de tampon d’élution est utilisé si des tests supplémentaires sont nécessaires. - Centrifuger à ≥16 000 x g à température ambiante pendant 1 min pour obtenir l’ADN acellulaire.
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Representative Results
Ces méthodes d’extraction ont été réalisées sur un nombre limité de cas afin d’assurer un rendement et une amplifiabilité adéquats de l’ADN acellulaire par rapport à l’ADN cellulaire des échantillons vitrés (quatre) et aqueux (quatre). À partir de ces échantillons, les rendements en ADN de la composante acellulaire de ces fluides sont similaires à ceux de la composante cellulaire (tableau 1). L’ADNc cellulaire et l’ADNcf de ces échantillons ont également été évalués à l’aide de tests moléculaires, comme pour la mutation MYD88 L265P associée au VRL. Une PCR en temps réel spécifique à l’allèle pour MYD88 L265P (Figure 1) illustre la détection de cette mutation associée au VRL dans l’ADN cellulaire et l’ADNcf. Dans cet exemple, la charge de morbidité semble être plus élevée dans la composante acellulaire, comme l’illustre un seuil de cycle (Ct) plus bas. Ces données illustrent que l’ADNcf extrait de l’humeur vitrée et aqueuse à l’aide de cette méthode permet d’obtenir une source d’ADN qui peut également être appliquée aux tests moléculaires diagnostiques.
Figure 1 : PCR en temps réel spécifique à l’allèle MYD88 L265P. Diagramme d’amplification représentatif montrant la PCR en temps réel spécifique à l’allèle MYD88 L265P pour l’ADN cellulaire et acellulaire (chaque réaction de PCR réalisée en double). Le seuil de seuil de cycle (Ct) est indiqué par la ligne verte. Les points où l’amplification de l’ADNcf (traces bleues et brunes) et de l’ADN cellulaire (traces rouges et vertes) - chacune réalisée en double - atteignent le seuil sont étiquetés. La fluorescence de fond est présente près de 1.00e-003. Une charge de mutation plus élevée est présente dans la composante acellulaire, comme le démontre un Ct plus faible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Cellulaire | Sans cellules | |
| Vitreux 1 | 130.5 | 67.5 |
| Vitré 2 | 337.5 | 105 |
| Vitré 3 | 150 | 168 |
| Vitré 4 | 1816 | 654 |
| Aqueux 1 | 58.5 | 40.5 |
| Aqueux 2 | 153 | 225 |
| Aqueux 3 | 117 | 454.5 |
| Aqueux 4 | TL | 27 |
Tableau 1 : Rendements d’extraction d’ADN cellulaire et acellulaire. Rendement en ADN (en ng) de quatre liquides vitrés non dilués et de quatre liquides d’humeur aqueuse (chambre antérieure) provenant de quatre individus différents, d’après la quantification de l’ADN fluorométrique. TL = trop faible pour être quantifié.
Figure 1 supplémentaire : Sac de cassette vitrée. Exemple d’un sac de cassette vitrée contenant du liquide vitré dilué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le lymphome vitréo-rétinien (VRL) est un lymphome agressif à grandes cellules B 1,2,3 dont les symptômes peuvent imiter ceux d’autres maladies vitréo-rétiniennes 4,5. Les tests moléculaires de l’humeur vitrée et, plus récemment, aqueuse sont devenus une méthode essentielle pour poser le diagnostic de VRL ou l’exclure. Cependant, ces fluides sont très faibles en volume et ont souvent une faible cellularité. De nombreuses cellules de ces fluides peuvent également être endommagées lors de la collecte, du stockage et du traitement13,14,15. Par conséquent, les rendements en ADN de ces spécimens sont souvent faibles. De plus, les cellules de ces fluides doivent être partagées avec d’autres méthodes de diagnostic, notamment la cytopathologie et la cytométrie en flux. L’ADN acellulaire (cfDNA) contenu dans ces fluides fournit une autre source d’ADN qui ne nécessite pas de cellules intactes.
Ce protocole sépare les composants cellulaires et acellulaires du liquide vitré ou aqueux. Le liquide vitré est dilué avec du PBS pour permettre le pipetage en raison de sa viscosité. Le fluide aqueux est manipulé afin d’assurer une récupération maximale de ce fluide de très faible volume.
Une comparaison des rendements en ADN de ces deux composants montre qu’il est possible d’obtenir un supplément substantiel d’acide nucléique à partir du composant acellulaire. Les tests moléculaires de l’ADNcf, tels que la PCR en temps réel spécifique à l’allèle MYD88 L265P, démontrent que le VRL peut être détecté dans la composante acellulaire de l’humeur vitrée et aqueuse ainsi que dans la composante cellulaire. Dans de nombreux cas, la quantité relative de VRL est plus élevée dans la composante acellulaire que dans la cellule (Figure 1).
L’extraction de la composante acellulaire du liquide vitré et aqueux permet l’évaluation moléculaire d’un composant de ces fluides qui serait autrement rejeté. Étant donné que le VRL est représenté dans des composants cellulaires et non cellulaires, l’ADN cellulaire et l’ADNcf pourraient être combinés pour maximiser l’ADN disponible à partir de ces spécimens limités. Alternativement, le composant acellulaire de ces fluides pourrait être utilisé pour les tests moléculaires, et le composant cellulaire pourrait être utilisé pour les tests qui nécessitent des cellules intactes, c’est-à-dire la cytopathologie et la cytométrie en flux. Cette approche permettrait d’éviter que des aliquotes distinctes de ces fluides soient attribuées à chaque essai, ce qui pourrait compromettre la sensibilité de chaque essai pour la détection de la VRL. Compte tenu du succès de cette méthode dans les échantillons vitreux et aqueux, cette méthode peut également être utile dans d’autres fluides limités pour augmenter la quantité d’ADN disponible pour les tests moléculaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, et Helmut Weigelin, MLS(ASCP) ont joué un rôle déterminant dans l’établissement de cette méthode d’extraction au sein de notre laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
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