Summary
ここでは、網膜硝子体リンパ腫を診断するための分子研究を行うために、硝子体および房水から無細胞DNAを抽出する手順が確立されています。この方法では、サンプルの細胞成分からDNAを同時に抽出したり、補助的な検査のためにDNAを予約したりできます。
Abstract
網膜硝子体リンパ腫(VRL)は侵攻性リンパ腫であり、原発性中枢神経系びまん性大細胞型B細胞リンパ腫に分類されることが多い。VRLを診断するために、硝子体液や最近では房水などの標本が収集されます。これらの検体に対するVRLの診断検査には、細胞診、フローサイトメトリー、および分子検査が含まれます。しかし、細胞病理学とフローサイトメトリーはどちらも、細胞DNAを用いた分子検査とともに、無傷の全細胞を必要とします。課題は、硝子体および房水は通常細胞性が低く、多くの細胞が収集、保管、および処理中に破壊されるという事実にあります。さらに、これらの標本は、硝子体液の粘度が高く、硝子体液と房水の両方の量が少ないため、分子検査にさらなる困難をもたらします。本研究では、ガラス質および水性試料から無細胞DNAを抽出する方法を提案します。このアプローチは、細胞DNAの抽出を補完したり、これらの標本の細胞成分を細胞診やフローサイトメトリーなどの他の診断方法に利用したりすることができます。
Introduction
網膜硝子体リンパ腫(VRL)は、原発性中枢神経系びまん性大細胞型B細胞リンパ腫1,2,3に関連する侵攻性リンパ腫です。VRLは、中枢神経系への関与により、典型的には致命的である1,2。まれではあるが1,4、VRLはしばしば後部ぶどう膜炎や他の網膜硝子体疾患に似た症状を呈する4,5。その結果、ぶどう膜炎の症状を示す患者は、VRLを確認または除外するための診断を必要とします。
最近、VRLを診断するためのコンセンサス基準が発表されましたが、これには臨床検査と検査所見の組み合わせが含まれます6。VRLの診断に一般的に使用される標本には、硝子体液、そして最近では房水が含まれます7。硝子体液は、扁平部硝子体切除術と呼ばれる外科的処置によって得られ、これにより眼の後部セグメントへのアクセスが可能になります8。
提示されたプロトコルでは、房水と硝子体液の両方の標本が細胞およびcfDNA抽出のために収集されました。患者に麻酔をかけ、角膜辺縁から約4 mmのところにトロカールを配置した後、角膜辺縁部に1 mLのツベルクリン注射器を使用して、約100〜200μLの房水サンプルが得られました。偽水晶体患者の場合、未希釈硝子体は無菌空気を注入液に導入することによって得られ、より多くの未希釈硝子体(最大3.5 mL)の収集が可能になりました。.有水晶体患者では、平衡塩溶液の注入をオンにする前に、約500〜1000μLの希釈されていない硝子体が除去されました。.場合によっては、注入液を液体に切り替え、硝子体スカート内に硝子体を配置してこのサンプルを得ることにより、二次希釈された硝子体(500〜2,000μL)を採取しました。最も希薄な硝子体画分は、手術終了時にカセットバッグ(補足図1)を保存することによって収集されました。このバッグが病理部門に到着すると、このバッグから液体を円錐形のチューブに排出して希薄な硝子体が得られ、その後のDNA抽出が行われました。
硝子体液の細胞病理学は、しばしばゴールドスタンダードと見なされます9。しかし、いくつかの研究では、処理と細胞性が最小限であるため、感度が限られていることが示されています10,11,12。フローサイトメトリーは、クローン性B細胞の同定に役立ちますが、細胞性が低く、大きなリンパ腫細胞の脆弱性によって制限されることもあります13,14,15。細胞病理学とフローサイトメトリーの両方に、無傷の全細胞が必要です。これらの細胞の多くは、収集、保管、および処理中に破壊されます。無傷の細胞(細胞DNA)から抽出したDNA(細胞DNA)を用いて分子検査を行う場合も、これと同じ制限があります。さらに、これらすべての試験で限られた硝子体標本を分割すると、各試験に利用できる材料の量が減少します。
無細胞DNA(cfDNA)は、無傷の細胞を必要としないDNAの別の供給源です。硝子体標本由来のcfDNAは、VRL 16,17およびブドウ膜黒色腫18の検出に使用されています。このプロトコルでは、細胞および無細胞DNAを硝子体および水性流体から抽出してVRLを検出します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
現在のプロトコルは、ヒューマンケアガイドラインに従い、ミシガン大学の治験審査委員会(IRB)の承認を得ています。これについては、IRBからインフォームドコンセントの放棄が得られました。関与する患者に関連する包含基準または除外基準はありません。
1. 細胞成分と無細胞成分の分離
注:VRL診断検査には、硝子体(希釈されていない、注入開始前に採取された硝子体切除術からの液体)、カセットバッグ内の希釈された硝子体(図1)、および房水(眼の前房からの液体)の3種類のサンプルを受け取ることができます。
- 粘性が高い未希釈の硝子体液の場合は、ピペッティングを容易にするために3〜5 mLのPBSで希釈します。
- カセットバッグ内の希薄硝子体の場合(補足図1)、液体を50 mLのコニカルチューブ(液体45 mLごとに1本)に排出します。
- 房水は容量が非常に少ない(<200μL)。細胞の回収率を最大限に高めるには、サンプルを 1.5 mL チューブに移し、サンプルを採取した元の 500 μL 微量遠心チューブを等量の PBS で洗い流し、1.5 mL チューブに加えます。
- 3,000 x g で室温で15分間、硝子体または水性流体を遠心分離します。
- ペレット状の細胞を乱さないように注意しながら、ピペットを使用して上清を慎重に除去します。
2. 細胞成分からのDNA抽出
- 適量の細胞溶解溶液(小ペレットの場合は300 μL、大ペレットの場合は1 mL以上)を添加します( 材料表参照)。ピペッティングで上下に混ぜます。
- 完全に溶解したら、総容量の1/3のタンパク質沈殿物溶液(300 μLのライセートに対して100 μL)を加えます( 材料表を参照)。
- 20〜30秒間激しく渦巻きます。室温で3,000 x g で3分間遠心します。
- 300 μLのイソプロパノールを清潔な微量遠心チューブにピペットで移します。前のステップの上清をイソプロパノールチューブに慎重にピペットで移します。
- 1.5 μL の 20 mg/mL グリコーゲン(300 μL の溶解用)を添加します( 材料表を参照)。
- 反転させてよく混合し、サンプルを-20°Cの冷凍庫に1時間から一晩入れてDNA沈殿を助けます。
- 1.5 mL チューブを室温で 3,000 x g で 5 分間遠心分離します。イソプロパノールをピペットで取り除きます。
- 0.5 mLの70%エタノールを加え、チューブをひっくり返してペレットを洗浄します。
- 室温で3,000 x g で1分間遠心し、エタノールをデカントします。エタノール洗浄を一度繰り返します。
- きれいなガーゼでチューブを裏返して溶液を排出し、ペレットまたはデカントを乾燥させます。微量遠心分離機でDNAをすばやく回転させ、残りのエタノールを先端の使い捨てピペットチップでピペットします(チューブにエタノールが残っなくなったら、DNAは乾燥し、5〜10分で水和する準備が整います)。
- 乾燥したDNAペレットに45μLのDNA水和溶液( 材料表を参照)を加えます。
- チューブを50°Cの加熱ブロックに入れ、1〜2時間可溶化させます。DNAを上下にピペットでつなぎ、水分補給プロセスをスピードアップします。
注:サンプルの粘性が高すぎると思われる場合は、DNA水和溶液を追加します。
3. 無細胞DNA抽出
- ステップ1.5の上澄みの量は可変です。上清1ミリリットルあたり70 μLのコンディショニングバッファー( 材料表を参照)を添加します。
- ボルテックスでクリアビーズをよく混ぜます。無細胞上清を処理する場合は10 μLの透明ビーズ<14 mL、14〜40 mLを処理する場合は20 μLを加えます。
- サンプル/ビーズの混合物をボルテックスでよく混合します。室温で3,000 x g で15分間遠心分離します。
- ペレットを乱すことなく、10 μLのクリアリングビーズを使用する場合は100 μL、20 μLのクリアリングビーズを使用する場合は200 μLを残して上清をピペットで取り出します。
- 等量の尿ペレット消化バッファー( 材料表を参照)をペレットに加え、ボルテックスまたはピペッティングでペレットを良好に再懸濁します。
- プロテイナーゼK(5%(v/v))を再懸濁したペレットに添加し(例:200 μLの混合物に10 μLのプロテイナーゼKを添加)、穏やかなボルテックスでよく混合します。
- ペレット混合物を55°Cで30分間インキュベートします。
- 消化混合物に1容量のゲノム溶解バッファー( 材料表を参照)を加え(例:210 μLのゲノム溶解バッファーから210 μLの消化混合物)、ボルテックスで混合します。
- 市販のスピンカラム( 材料表を参照)を新しいコレクションチューブに移します。
- 200 μL の Urine DNA Prep バッファーをスピンカラムに添加し、室温で ≥16,000 x g で 1 分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
- 700 μL の尿 DNA 洗浄バッファーをカラムに加え、室温で ≥16,000 x g で 1 分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
- 200 μLの尿DNA洗浄バッファーでこのステップを繰り返します。
- スピンカラムをDNase/RNaseフリーの微量遠心チューブに移します。
- 適切な量のDNA溶出バッファー(実施する分子試験に基づく)をカラムマトリックスに直接添加し、室温で3〜5分間静置します。
注:例では、30 μL の溶出バッファーを使用しました。追加の試験が必要な場合は、より多くの溶出バッファーを使用します。 - 室温で≥16,000 x g で1分間遠心分離し、無細胞DNAを得ます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
これらの抽出法は、ガラス質(4)および水性(4)検体からの細胞DNAと比較して、無細胞DNAの適切な収量および増幅性を確保するために、限られた数の症例で実施されました。これらのサンプルから、これらの液体の無細胞成分からのDNA収量は、細胞成分のDNA収量と類似しています(表1)。これらのサンプルの細胞およびcfDNAも、VRL関連変異 MYD88 L265Pなどの分子検査を使用して評価しました。 MYD88 L265Pの対立遺伝子特異的リアルタイムPCR(図1)は、細胞DNAとcfDNAの両方におけるこのVRL関連変異の検出を示しています。この例では、疾患の負荷は、より低い(サイクル閾値(Ct))によって示されるように、無細胞成分において高いようである。これらのデータは、この方法を用いて硝子体および房水から抽出されたcfDNAが、診断用分子検査にも適用できるDNAの供給源となることを示しています。
図1: MYD88 L265P対立遺伝子特異的リアルタイムPCR。 細胞および無細胞DNAの MYD88 L265P対立遺伝子特異的リアルタイムPCRを示す代表的な増幅プロット(各PCR反応は重複して実施)。サイクル閾値(Ct)の閾値は緑色の線で示されています。cfDNA(青と茶色のトレース)と細胞DNA(赤と緑のトレース)の増幅がそれぞれ重複して行われ、閾値に達するポイントが標識されます。バックグラウンド蛍光は1.00e-003付近に存在します。Ctが低いことからもわかるように、無細胞成分では変異負荷が高く なっています。
| 携帯 | セルフリー | |
| 硝子体 1 | 130.5 | 67.5 |
| 硝子体 2 | 337.5 | 105 |
| 硝子体 3 | 150 | 168 |
| 硝子体 4 | 1816 | 654 |
| 水性 1 | 58.5 | 40.5 |
| 水性 2 | 153 | 225 |
| 水性 3 | 117 | 454.5 |
| 水性 4 | TLの | 27 |
表1:細胞および無細胞DNA抽出の収量。 蛍光分析による DNA 定量に基づく、4 人の異なる個体からの 4 つの希釈されていない硝子体液と 4 つの房水(前房)液の DNA 収量(ng)。TL = 低すぎて定量できません。
補足図1:硝子体カセットバッグ。 希薄な硝子体液が入った硝子体カセットバッグの例。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
網膜硝子体リンパ腫(VRL)は、侵攻性の大細胞型B細胞リンパ腫であり1,2,3、その症状は他の網膜硝子体疾患を模倣する可能性があります4,5。硝子体、そして最近では房水の分子検査は、VRLの診断を下すか、または除外するための重要な方法になっています。ただし、これらの液体は体積が非常に少なく、多くの場合、細胞性が低くなります。これらの液体内の細胞の多くは、収集、保管、および処理中に損傷を受ける可能性もあります13,14,15。その結果、これらの標本からのDNA収量はしばしば低くなります。さらに、これらの液体からの細胞は、細胞病理学やフローサイトメトリーなどの他の診断方法と共有する必要があります。これらの液体に含まれる無細胞DNA(cfDNA)は、無傷の細胞を必要としない別のDNA源を提供します。
このプロトコルはガラス質か水様の液体の細胞およびcell-free部品を分ける。ガラス質液はPBSで希釈され、その粘度によりピペッティングが可能です。水性流体は、この非常に少量の流体を最大限に回収できるように取り扱われます。
これら2つの成分のDNA収量を比較すると、実質的な追加の核酸が無細胞成分から得られ得ることが示される。 MYD88 L265P対立遺伝子特異的リアルタイムPCRなどのcfDNAの分子検査により、VRLは細胞成分だけでなく、硝子体および房水の無細胞成分でも検出できることが実証されています。多くの場合、VRLの相対量は、細胞よりも無細胞成分の方が多くなります(図1)。
ガラス質および水性流体の無細胞成分を抽出することで、これらの流体の成分を分子評価することができます。VRLは細胞成分と無細胞成分で表されるため、細胞DNAとcfDNAを組み合わせて、これらの限られた標本から利用可能なDNAを最大化することができます。あるいは、これらの液体の無細胞成分を分子検査に使用し、細胞成分を無傷の細胞を必要とする検査、すなわち細胞病理学およびフローサイトメトリーに使用することもできます。このアプローチにより、これらの液体の個別のアリコートが各テストに割り当てられることを回避し、VRLの検出に関する各テストの感度を損なう可能性があります。この方法が硝子体および水性標本で成功していることを考えると、この方法は、分子検査に利用できるDNAの量を増やすために、他の限られた液体でも有用である可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, および Helmut Weigelin, MLS(ASCP) は、この抽出法を研究室内で確立するのに尽力しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
- Coupland, S. E., Damato, B.
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A.
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P.
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
