Summary
تصف المقالة الطرق والكواشف اللازمة لأداء تفاعل سلسلة التهجين RNA مضان كامل التركيب في الموقع (HCR RNA WM-FISH) للكشف عن رؤى حول الدقة المكانية والخلوية لجينات المستقبلات الحسية الكيميائية في هوائي البعوض والجس الفكي.
Abstract
البعوض هو ناقل فعال للأمراض الفتاكة ويمكنه التنقل في بيئته الكيميائية باستخدام المستقبلات الحسية الكيميائية المعبر عنها في الزوائد الشمية. إن فهم كيفية تنظيم المستقبلات الحسية الكيميائية مكانيا في الزوائد الشمية الطرفية يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة حول كيفية تشفير الرائحة في نظام حاسة الشم للبعوض وإبلاغ طرق جديدة لمكافحة انتشار الأمراض التي ينقلها البعوض. يسمح ظهور الجيل الثالث من تفاعل سلسلة التهجين RNA الكامل في التهجين في التهجين الموقع (HCR RNA WM-FISH) برسم الخرائط المكانية والتنميط المتزامن للتعبير عن جينات حسية كيميائية متعددة. هنا ، نصف نهجا متدرجا لأداء HCR RNA WM-FISH على هوائي البعوض Anopheles وجس الفك العلوي. قمنا بالتحقيق في حساسية هذه التقنية من خلال فحص ملف تعريف التعبير للمستقبلات الشمية الأيونية. سألنا عما إذا كانت تقنية HCR WM-FISH الموصوفة مناسبة للدراسات المتعددة عن طريق ربط مجسات الحمض النووي الريبي بثلاثة فلوروفورات متميزة طيفيا. قدمت النتائج دليلا على أن HCR RNA WM-FISH حساس بشدة للكشف في وقت واحد عن جينات حسية كيميائية متعددة في الهوائي والزوائد الشمية الجسية الفكية. وتشهد المزيد من التحريات على ملاءمة HCR WM-FISH لتحديد سمات التعبير المشترك لأهداف الحمض النووي الريبي المزدوج والثلاثي. هذه التقنية ، عند تطبيقها مع التعديلات ، يمكن أن تكون قابلة للتكيف لتوطين الجينات ذات الأهمية في الأنسجة الشمية لأنواع الحشرات الأخرى أو في الزوائد الأخرى.
Introduction
تعتمد ناقلات البعوض مثل Anopheles gambiae على ذخيرة غنية من الجينات الحسية الكيميائية المعبر عنها في الزوائد الشمية المحيطية لتزدهر في عالم كيميائي معقد وتحديد الروائح ذات الصلة سلوكيا المنبعثة من المضيفين البشريين ، واكتشاف مصادر الرحيق ، وتحديد مواقع وضع البيض1. يتم إثراء هوائي البعوض وجس الفك العلوي بالجينات الحسية الكيميائية التي تدفع اكتشاف الرائحة في هذه الزوائد الشمية. ثلاث فئات رئيسية من القنوات الأيونية ذات البوابات تدفع الكشف عن الرائحة في الزوائد الشمية للبعوض: مستقبلات الرائحة (ORs) ، التي تعمل مع مستقبلات مستقبلات مشتعلة ملزمة للرائحة (Orco) ؛ المستقبلات الأيونية (IRs) ، التي تتفاعل مع واحد أو أكثر من مستقبلات الأشعة تحت الحمراء (IR8a و IR25a و IR76b) ؛ المستقبلات الحسية الكيميائية الذوقية (GRs) ، والتي تعمل كمركب من ثلاثة بروتينات للكشف عن ثاني أكسيد الكربون (CO2) 1,2.
يعد مضان الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين أداة قوية للكشف عن التعبير عن mRNA3 الداخلي. بشكل عام ، تستخدم هذه الطريقة مسبار حمض نووي مفرد تقطعت به السبل يحمل علامة الفلوروفور مع تسلسل مكمل ل mRNA المستهدف. يسمح ربط مسبار الحمض النووي الريبي الفلوري بالحمض النووي الريبي المستهدف بتحديد الخلايا التي تعبر عن نسخة من الاهتمام. تتيح التطورات الحديثة الآن اكتشاف النصوص في أنسجة البعوض الكاملة 4,5. استخدم الجيل الأول من تقنية تفاعل سلسلة التهجين (HCR) مضخم HCR قائم على الحمض النووي الريبي. تم تحسين هذا في طريقة الجيل الثاني التي استخدمت بدلا من ذلك الحمض النووي الهندسي لمكبر الصوتHCR 6,7. أدت هذه الترقية إلى زيادة 10x في الإشارة ، وانخفاض كبير في تكلفة الإنتاج ، وتحسن كبير في متانة الكواشف 6,7.
في البروتوكول ، وصفنا استخدام الجيل الثالث من مضان الحمض النووي الريبي الكامل HCR في طريقة التهجين في الموقع (HCR RNA WM-FISH) المصممة للكشف عن التوطين المكاني والتعبير عن أي جين 8,9. تستخدم هذه الطريقة المكونة من خطوتين أولا مجسات الحمض النووي الخاصة ب mRNA محل الاهتمام ، ولكنها تحتوي أيضا على تسلسل التعرف على البادئ. تستخدم الخطوة الثانية دبابيس الشعر الموسومة بالفلوروفور والتي ترتبط بتسلسل البادئ لتضخيم إشارة الفلورسنت (الشكل 1). تسمح هذه الطريقة أيضا بتعدد إرسال اثنين أو أكثر من مجسات الحمض النووي الريبي وتضخيم إشارات المسبار لتسهيل اكتشاف الحمض النووي الريبي وقياسه8. يوفر تصور وفرة النسخ وأنماط توطين الحمض النووي الريبي للجينات الحسية الكيميائية المعبر عنها في الزوائد الشمية السطر الأول من التبصر في وظائف الجينات الحسية الكيميائية وتشفير الرائحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الاعتبارات وإعداد المواد
- قرر ما إذا كان التركيب الكامل أو المقطع المبرد من الأنسجة سيكون مناسبا. تم تحسين هذا البروتوكول للتصوير الكامل في الموقع للحمض النووي الريبي في هوائي البعوض Anopheles وجس الفك العلوي دون المقطع بالتبريد. إذا كانت العينات أكثر سمكا من 5 مم ، يوصى بالتقطيع بالتبريد لتمكين اختراق المسبار.
- تحديد الجينات ذات الأهمية ونسخ التسلسلات بما في ذلك الإنترونات والإكسونات من قاعدة بيانات مناسبة. نسخ تتابع الجينات إلى الحمض النووي الريبوزي (RNA) للتخليق.
- حدد ما إذا كان سيتم شراء مجسات من البائعين التجاريين أو ما إذا كان سيتم تصنيع المجسات في المختبر.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم شراء المجسات في الموقع من بائع تجاري (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكن توليفها كما تم الإبلاغ عنهاسابقا 10. الكواشف المستخدمة في الدراسة موصوفة في الجدول 1. يتم سرد المواد المطلوبة لإعداد الكواشف في جدول المواد.
2. التثبيت المسبق للأنسجة
- تخدير 10-15 من الإناث أو الذكور البالغين من بعوض Anopheles coluzzii (سلالة N'Gousso) ، الذين تتراوح أعمارهم بين 5-10 أيام بعد ظهورهم ، عن طريق جمعها باستخدام شفاط الفم في كوب ورقي أو أنبوب بلاستيكي ووضعها في دلو يحتوي على ثلج. يمكن تأكيد التخدير الناجح الناجم عن البرد عندما يكون البعوض غير متحرك.
- قطع رؤوسهم عن طريق إزالة الرؤوس من منطقة الرقبة مع زوج من الملقط. باستخدام اليد غير المهيمنة ، أمسك الصدر بالملقط وافصل الرقبة عن الجسم بالملقط الذي تمسكه اليد المهيمنة. ضع الرؤوس في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول الكيتيناز-كيموتريبسين ثنائي ميثيل سلفوكسيد (CCD buffer) على الجليد.
ملاحظة: تجميد يمكن أن تشوه الهوائيات. يوصى بضربة قاضية سريعة على الجليد. قد يختلف عمر البعوض أثناء الاختبار حسب المشروع. من المهم تأكيد وتنسيق حالتهم الفسيولوجية ، مثل ما إذا كانوا يتغذون على الدم أو يتضورون جوعا أو يتزاوجون. في هذه الدراسة ، تم أخذ عينات من الزوائد الشمية من البعوض الذي تم تغذيته بالدم والتزاوج. - قم بتسخين رؤوس البعوض مسبقا في محلول CCD عند 37 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة 5 دقائق ثم انقل الأنبوب الذي يحتوي على رؤوس البعوض إلى فرن تهجين وقم بتدويره عند 37 درجة مئوية. يعتمد وقت الحضانة في المخزن المؤقت CCD على نوع الأنسجة. بالنسبة لهوائيات Anopheles الأنثوية ، استخدم 20 دقيقة ، وتتطلب الهوائيات الذكرية 15 دقيقة ، بينما يلزم وقت حضانة أطول (1 ساعة) للجس الفكي.
- انقل محتوى الأنبوب بالكامل إلى زجاج ساعة تشريح. صب العينة برفق في انخفاض زجاج الساعة (التشريح). إذا كانت رؤوس البعوض عالقة داخل الأنبوب ، فاستخدم ماصة لإضافة مخزن CCD في الأنبوب وشطف الرأس.
- استخدم الملقط لنقل الرؤوس بعناية أو أي هوائيات / ملامسات منفصلة أثناء الحضانة وتثبيتها في 1 مل من المثبت المسبق.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على بقايا المخزن المؤقت CCD عند -20 درجة مئوية ، ويمكن إعادة استخدام المخزن المؤقت حتى 3x. إذا تحول المثبت المسبق إلى اللون البني قليلا بسبب ترحيل المخزن المؤقت CCD بواسطة الأنسجة ، فاستبدله ب 1 مل آخر من المثبت. - قم بتدوير الرؤوس في التثبيت المسبق لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية باستخدام نوتيتور.
ملاحظة: كانت سرعة التأرجح للمغذي المستخدم في هذه الدراسة غير قابلة للتعديل. تم استخدام السرعة الافتراضية المحددة (12 دورة في الدقيقة) من قبل الشركة المصنعة.
3. تشريح الأنسجة
- اشطف الرؤوس 4 مرات (5 دقائق لكل غسلة) ب 1 مل من 0.1٪ PBS-Tween على الثلج. لتجنب فقدان العينة ، استخدم ماصة متصلة بطرف تحميل الجل لإزالة السائل.
ملاحظة: يمكن إجراء غسلتين سريعتين متبوعة بغسل طويل لمدة 10 دقائق ، ويمكن إجراء غسل سريع نهائي بدلا من الخطوة 3.1. - انقل الرؤوس الموجودة في الأنبوب إلى زجاج ساعة تشريح. صب العينة برفق في انخفاض زجاج الساعة. شطف رؤوس البعوض العالقة داخل الأنبوب مع 0.1٪ PBS-Tween.
- تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة الأنسجة ذات الأهمية (الهوائيات / الجس) من الرأس باستخدام ملقط حاد. امسك الجزء الخلفي من الرأس بالملقط وأمسك بهوائيا بملقط آخر من القاعدة. نظف الملقط بورق مبلل بمذيب خال من الحمض النووي الريبي. قم بإزالة الجس باستخدام نفس العملية.
- انقل الهوائيات والجس بالملقط إلى أنابيب فارغة خالية من الحمض النووي / RNase موضوعة على الجليد. افصل أجزاء الأنسجة المختلفة إلى أنابيب مختلفة مصنفة مسبقا.
- تجفيف الأنسجة في 400 ميكرولتر من المذيب الذي يحتوي على خليط من الميثانول (MeOH 80٪) وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO 20٪) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لوضع الأنسجة على nutator. اتركه يجلس على رف أنبوبي في درجة حرارة الغرفة على مقعد المختبر. يوصى باستخدام خليط مذيب طازج. للحصول على محلول مخزون 500 ميكرولتر ، امزج 400 ميكرولتر من MeOH مع 100 ميكرولتر من DMSO. - استبدل كاشف التجفيف ب 400 ميكرولتر من الميثانول المطلق (100٪) والأنسجة المجففة طوال الليل عند -20 درجة مئوية. اسمح للأنسجة بالاستقرار عن طريق الجاذبية واستخدم ماصة لإزالة السائل.
ملاحظة: العينات قابلة للتطبيق لفترة طويلة من الجفاف ، وقد تم اختبار ما يصل إلى 4 ليال دون فقدان الإشارة.
4. الأنسجة بعد التثبيت
- أعد ترطيب الأنسجة في سلسلة من أربع خطوات من 400 ميكرولتر MeOH / PBS-Tween لمدة 10 دقائق على الجليد. ابدأ ب 75٪ MeOH / 25٪ PBS-Tween متبوعا ب 50٪ MeOH / 50٪ PBS-Tween ، ثم 25٪ MeOH / 75٪ PBS-Tween وأخيرا 100٪ PBS-Tween.
ملاحظة: يمكن استخدام طرف تحميل جل بفتحة صغيرة لإزالة المخزن المؤقت من الأنبوب لتجنب فقدان الأنسجة. يمكن إزالة المخزن المؤقت تحت مجهر تشريح. - يغسل ب 400 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.1٪ Tween-20 (PBS-T) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل عن طريق وضع العينة على nutator.
- اصنع محلول Proteinase-K سعة 20 ميكروغرام / مل واحتضانه في 400 ميكرولتر من محلول Proteinase-K لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قم بتخفيف مخزون Proteinase-K 20 مجم / مل (محلول مخزون 1000x) أي 2 ميكرولتر في 2 مل من 0.1٪ PBS-Tween. يمكن تخزين الباقي في ثلاجة -20 درجة مئوية. - وقف الهضم الأنزيمي للأنسجة عن طريق غسل 2x لمدة 10 دقائق مع 400 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-tween.
- أضف 400 ميكرولتر من ما بعد التثبيت واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل 3 مرات ، 15 دقيقة لكل غسلة ، مع 400 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-Tween.
5. التحقيق في التهجين
- احتضان الأنسجة في 400 ميكرولتر من مخزن تهجين المسبار لمدة 5 دقائق. تأكد من غمر الأنسجة بالكامل في المخزن المؤقت عن طريق سحب الإصبع برفق.
- استعد للخطوة التالية عن طريق تسخين حصصة من مخزن تهجين المسبار إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة المخزن المؤقت والتهجين المسبق باستخدام 400 ميكرولتر من محلول تهجين المسبار المسخن مسبقا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- اصنع محلول مسبار للمستقبلات الحسية الكيميائية المستهدفة (IR8a أو IR76b أو IR25a أو IR41t.1 أو IR75d أو IR7t أو IR64a أو Orco) عن طريق إضافة 8 pM من المسبار. أضف 8 ميكرولتر من مخزون مسبار 1 ميكرومتر إلى مخزن تهجين مسبار مسخن مسبقا 500 ميكرولتر.
- قم بإزالة المخزن المؤقت لتهجين المسبار المسخن مسبقا واستبدله ب 400 ميكرولتر من محلول المسبار الساخن.
- احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ليلتين على مغذي يوضع داخل حاضنة ومغطى تحت صندوق.
6. تضخيم التحقيق
- قم بتسخين المخزن المؤقت لغسيل المسبار إلى 37 درجة مئوية ، قم بإزالة محلول المسبار الزائد عن طريق شطف الأنسجة 5x ، 10 دقائق لكل غسلة ، مع 400 ميكرولتر من محلول غسيل المسبار عند 37 درجة مئوية ، مع التغذية في الحاضنة.
ملاحظة: قد يبدأ التحضير للخطوة 6.4. انظر الملاحظة في الخطوة 6.4. - غسل العينات 2x ، 5 دقائق لكل غسلة ، مع 400 ميكرولتر من 5x سترات الصوديوم المالحة التي تحتوي على 10٪ Tween-20 (SSCT) في درجة حرارة الغرفة. قم بإذابة المخزن المؤقت لتضخيم درجة حرارة الغرفة على سطح الطاولة.
- تحضير الأنسجة للتضخيم عن طريق الحضانة مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بسبب لزوجة المخزن المؤقت للتضخيم ، قد لا تكون الأنسجة مغمورة بالكامل. امزج عن طريق سحب المخزن المؤقت للتضخيم برفق أسفل الأنسجة وطرد المخزن المؤقت فوق الأنسجة حتى يتم غمرها.
- قم بإعداد 18 pM بشكل منفصل من دبوس الشعر h1 و 18 pM من دبوس الشعر h2 عن طريق تسخين 6 ميكرولتر من مخزون 3 ميكرومتر عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية وتبرد إلى درجة حرارة الغرفة في درج مظلم لمدة 30 دقيقة. تأكد من تغطية أنابيب PCR بإحكام لمنع تبخر دبابيس الشعر أثناء التسخين في دورة حرارية.
ملاحظة: لتوفير الوقت ، يمكن بدء الخطوة 6.4 أثناءخطوة الغسيل الرابعة في الخطوة 6.1. يجب تسخين دبابيس الشعر بشكل منفصل لمنع التفاعل المتقاطع. لا ينبغي تخفيف دبابيس الشعر بأي مخزن مؤقت في هذه الخطوة. يمكن شراء دبابيس الشعر من الشركة المصنعة للمسبار جنبا إلى جنب مع المجسات. - استبدل المخزن المؤقت للتضخيم المضاف في الخطوة 6.3 بخليط يحتوي على دبابيس الشعر المسخنة (من الخطوة 6.4) مع 100 ميكرولتر من مخزن التضخيم. سيحتوي التفاعل النموذجي على 6 ميكرولتر من h1 و 6 ميكرولتر من h2 و 100 ميكرولتر من محلول التضخيم.
ملاحظة: يمكن دمج دبابيس الشعر h1 و h2 بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ثم إضافتها إلى 100 ميكرولتر من مخزن التضخيم. لتجنب نقل عينات الأنسجة من أنبوب إلى آخر ، يمكن إزالة المخزن المؤقت للتضخيم في الخطوة 6.3 واستبداله بخليط دبابيس الشعر المخفف في مخزن التضخيم. - احتضان الأنسجة طوال الليل وجوزها في الظلام في درجة حرارة الغرفة باستخدام السرعة الافتراضية للمغذيات.
7. تصاعد عينة الأنسجة
- تمييع المخزن المؤقت للتضخيم في الأنسجة المحتضنة مع 300 ميكرولتر من 5x SSCT (سترات كلوريد الصوديوم الصوديوم المخففة في Tween-20).
ملاحظة: التخفيف مفيد لتقليل اللزوجة ويسهل إزالة المخزن المؤقت للتضخيم من الأنسجة. استخدمنا Triton-X 100 للتثبيت المسبق و Tween-20 لخطوة ما بعد التثبيت بسبب الاختلافات في أفعالهم كعوامل لاختراق غشاء الخلية. - اغسل المنديل 5x ب 400 ميكرولتر من 5x SSCT في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قم بتخزين المنديل مؤقتا على حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للتركيب ، إذا لزم الأمر. لم نتجاوز 2 أيام قبل التصوير. - اصنع 5 قطرات من محلول التركيب على شريحة زجاجية. قم بقص طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لجعله أوسع ونقل الأنسجة إلى شريحة زجاجية جديدة.
- احصل على عينات الأنسجة من قاعدتها بالملقط واغمرها واشطفها برفق في سلسلة من قطرات المحلول المتصاعدة. احرص على عدم كسر الأنسجة في هذه الخطوة.
- قم بالتركيب بمحلول التثبيت ، ضع غطاء الغطاء ، وختم بطلاء الأظافر. صورة عينات الأنسجة في الموقع باستخدام مجهر متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الكشف القوي عن الجينات الحسية الكيميائية في هوائي الأنوفيليس
قمنا بالتحقيق في حساسية طريقة HCR FISH (الشكل 1) للكشف عن تعبير المستقبلات الحسية الكيميائية في الأنسجة الشمية للبعوض. مسترشدين ببيانات نسخة الحمض النووي الريبي التي تم الإبلاغ عنها سابقا على هوائي بعوضة الأنوفيليس الأنثوية ، أنشأنا تحقيقات لاستهداف مجموعة متنوعة من الأشعة تحت الحمراء. كشف متوسط قيم النسخ من أربع دراسات مستقلة لنسخ الهوائيات أن Ir41t.1 (11 RPKM) و Ir75d (12 RPKM) و Ir7t (13 RPKM) كانت أقل وفرة في الهوائي مقارنة بالمستقبلات المشتركة Ir25a (197 RPKM) و Ir76b (193 RPKM) 5،11،12،13،14. أنشأنا تحقيقات لاستهداف Ir41t.1 و Ir75d و Ir7t. كما تم استهداف IR64a (31 RPKM) نظرا لأن مستوى نسخته أكثر وفرة بحوالي 3 مرات من أدنى قيمة للنسخة بين الجينات المرشحة ذات الأهمية. وتجدر الإشارة هنا إلى أن قيم RPKM من دراسات النسخ تمثل قياسا كبيرا للنصوص من الهوائي بأكمله. على هذا النحو ، يمكن أن يكون عدد قليل فقط من الخلايا العصبية يعبر بشكل كبير عن نسخة جين الأشعة تحت الحمراء ، أو قد يكون التعبير عن جين الأشعة تحت الحمراء منخفضا عبر العديد من الخلايا. لذلك قد لا تتوافق قيم RPKM بالضرورة مع مستوى وفرة الأشعة تحت الحمراء داخل الخلية العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تضخيم الإشارة الذي توفره طريقة HCR قد يجعل من الصعب أيضا استخدام هذه الطريقة لقياس مستويات النسخ العصبية بدقة بناء على إشارات الفلورسنت. ناقش منشورنا الأخير هذه المفاهيم بمزيد من التفصيل5. تشير البيانات إلى أن HCR WM-FISH حساس للغاية للكشف عن نسخ mRNA من أنسجة الهوائيات كما هو موضح في الشكل 2.
وضع العلامات المشتركة المتعددة لأهداف الحمض النووي الريبي المختلفة في الزوائد الحسية الكيميائية
لفحص التوطين المشترك لأهداف الحمض النووي الريبي ، أنشأنا مجسات مترافقة مع فلوروفورات مختلفة. كشف التهجين المزدوج في الموقع الذي يستهدف نسخ جين المستقبلات المشتركة لمستقبلات الرائحة (Orco) وجين المستقبلات المشتركة للمستقبلات الأيونية الأكثر تعبيرا (Ir25a) عن التمركز المشترك لعائلات المستقبلات الحسية الكيميائية المتميزة هذه في مجموعة فرعية من مجموعات الخلايا في الهوائي (الشكل 3 أ) وجس الفك العلوي (الشكل 3 ب). قمنا أيضا بالتحقيق في التموضع المشترك لنسخ ثلاثة جينات مستقبلات الأشعة تحت الحمراء (Ir8a و Ir25a و Ir76b). تشير أنماط التمركز المشترك إلى أن الخلايا الإيجابية Ir76b تعبر عن Ir25a ، في حين أن الخلايا الإيجابية Ir8a تتركز جزئيا مع Ir76b و Ir25a (الشكل 4). يوضح تحليل التعبير المشترك لمستقبلات الأشعة تحت الحمراء متانة استخدام HCR WM-FISH للدراسات المتعددة.
الشكل 1: رسم تخطيطي لتفاعل سلسلة التهجين في الموقع . تعمل هذه الطريقة في خطوتين: الكشف والتضخيم. يتألف المسبار المحدد لتفاعل سلسلة التهجين في الموقع من بادئ منقسم وتسلسل حمض نووي خاص بهدف الحمض النووي الريبي. يمكن تصميم أزواج متعددة من مجموعات المسبار لتهجين عدة مناطق في هدف الحمض النووي الريبي ؛ هذا يحدد خطوة الكشف. تتطلب خطوة التضخيم دبابيس شعر موسومة بالفلوروفور (h1 و h2) لربطها على وجه التحديد بالبادئ المترافق مع مجموعة مسبار. عند الربط ، يتم تضخيم إشارة الحمض النووي الريبي التي يسميها الفلوروفور عن طريق الربط المتكرر لدبابيس الشعر الموسومة بالفلوروفور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توطين الحمض النووي الريبوزي (RNA) للجينات الحسية الكيميائية بالأشعة تحت الحمراء. HCR WM-FISH من إناث هوائيات Anopheles coluzzii لاستهداف الأشعة تحت الحمراء. تشمل مجسات الحمض النووي الريبي (أ) IR41t.1 و (ب) IR75d و (ج) IR7t و (د) IR64a. الأجزاء الداخلية في المربعات البيضاء المتقطعة عبارة عن صور مكبرة من المنديل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التوطين المزدوج في الموقع للجينات الحسية الكيميائية في الهوائي والجس الفكي. صور Z-stack متحدة البؤر للخلايا التي تعبر عن Ir25a (أخضر) و Orco (أرجواني) في الهوائي (A) و (B) ملامسة الفك العلوي لإناث بعوض Anopheles coluzzii . الأجزاء الداخلية في المربعات البيضاء المتقطعة عبارة عن صور مكبرة من المنديل. المقياس 10 ميكرومتر. تم تعديل الشكل 3B من15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم خرائط التمركز المكاني لأهداف الحمض النووي الريبي المتعددة. صور في الموقع تظهر أنماط التمركز المشترك لثلاثة مستقبلات للأشعة تحت الحمراء ، IR25a (أرجواني) ، IR8a (أخضر) ، و IR76b (أزرق) في هوائي البعوض. تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا التي تعبر عن مستقبلات الأشعة تحت الحمراء الثلاثة (IR25a و IR8a و IR76b). المقياس 20 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: كواشف تفاعل سلسلة التهجين في الموقع . الكواشف اللازمة لأداء تفاعل سلسلة التهجين الفلورسنت الكامل التركيب في الموقع التهجين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتميز الجيل الثالث من تفاعل سلسلة التهجين (HCR) بحساسيته وقوته لتصور العديد من أهداف الحمض النووي الريبي8. تم استخدام HCR WM-FISH بنجاح على أجنة ذبابة الفاكهة والدجاج والفئران وسمك الزرد وكذلك يرقات الديدان الخيطية وسمك الزرد10،16،17. عادة ما تكون هوائيات البعوض وملامس الفك العلوي عرضة للتألق الذاتي العالي واختراق المسبار الضعيف الذي يمثل تحديا خاصا عند إجراء الطرق التقليدية الكاملة في الموقع . تم تقليل هذه العيوب من خلال خطوة تضخيم الإشارة المدمجة في بروتوكول HCR الذي يحسن نسبة الإشارة إلى الخلفية ويسمح بالكشف عن نسخ mRNA للمستقبلات الكيميائية الشمية (الشكل 2). يضمن تصميم بروتوكول HCR ربط مجسات البدء ببوليمرات التضخيم التي تسمح بتصوير أهداف الحمض النووي الريبي بإشارة منخفضة. في الإعداد المتعدد ، تم ربط مضخمات HCR المتعامدة المختلفة بفلوروفورات فريدة من نوعها طيفيا. كان هذا النهج حاسما لتجنب النزيف الطيفي من قناة تصوير مجاورة.
لتحسين طريقة HCR للاستخدام مع الزوائد البعوض ، قدمنا العديد من الملاحظات. مكبرات الصوت HCR حساسة للضوء ويجب تخزينها دائما في صندوق في ثلاجة -20 درجة مئوية. في تجربتنا ، يمكن أن يؤدي التحضين المكثف للأنسجة في محلول CCD أو البروتيناز K أو وقت التثبيت القصير في بارافورمالدهيد إلى كسر الهوائيات أو الجس أثناء خطوات الغسيل. يجب دائما إمساك الهوائيات وملامس الفك العلوي بواسطة القاعدة لتجنب الكسر. في المرحلة المبكرة من تكييف هذا البروتوكول ، فقدنا الأنسجة باستمرار خلال سلسلة من التبادلات العازلة (الخطوتان 5 و 6). لتقليل هذه الخسائر ، تضاعف عدد الأنسجة في بداية التجربة ، وتم إجراء خطوات الغسيل وتبادل العازلة تحت المجهر ، وتم استخدام نصائح تحميل هلام لا يزيد عرضها عن 0.5 مم لإزالة المخازن المؤقتة من الأنسجة.
وقد نجحت أسماك حمى الهيدروكلور في الزوائد الشمية المحيطية للبعوض Anopheles gambiae 5,15 و Aedes aegypti 4,18 الناقل للبعوض، ويمكن تحسين البروتوكول وتكييفه مع أجزاء أنسجة الحشرات الأخرى أو المختلفة. لا يتضمن البروتوكول الأصلي الذي صممته الشركة المصنعة الحضانة في المخزن المؤقت لاتفاقية مكافحة التصحر. تم دمج هذه الخطوة في البروتوكول لهضم وتخلل بشرة الكيتينوس. قمنا بتمديد وقت الحضانة في مجموعات المسبار لمدة ليلتين لإعطاء مزيد من الوقت لاختراق المسبار ، وهو تعديل لبروتوكول الشركة المصنعة الذي يوصي بوقت حضانة مدته 16 ساعة يعمل بشكل جيد للعينات العامة على شريحة. يتطلب تحسين هذا البروتوكول لأجزاء أنسجة الحشرات الأخرى تغيير وقت الحضانة في المخزن المؤقت لاتفاقية مكافحة التصحر. من المحتمل أن تتطلب أجزاء الأنسجة المحيطية ذات البشرة السميكة وقتا طويلا للحضانة. يجب أيضا تعديل تركيز البروتيناز K تجريبيا أثناء تكييف هذا البروتوكول مع الأنسجة المختلفة أو مراحل نمو. عند العمل مع أنسجة يزيد سمكها عن 5 مم ، يصبح اختراق المسبار تحديا. في مثل هذه الحالة ، هناك حاجة إلى بذل جهود إضافية لإجراء تشريح الأنسجة أو تغيير البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة.
يقتصر HCR WM-FISH على تصور عدد قليل فقط من الأهداف الجينية في وقت واحد مقارنة بالنسخ المكاني الذي يمكن أن يسمح بالتصوير المتزامن لآلاف الجينات19. التوليف التجاري لتحقيقات الحمض النووي الريبي مكلف ؛ سيكون البديل هو إنتاج المجسات ومكبرات الصوت في المختبر ، ولكن هذا يمكن أن يكون تحديا لمعظم المجموعات ويتطلب عمالة كثيفة ويستغرق وقتا طويلا. هذا البروتوكول محدود أيضا بسبب الصعوبات التي يواجهها اختراق مسبار الحمض النووي الريبي من خلال عينات سميكة كاملة التركيب ، والتي قد تتطلب بدائل للبروتوكول (على سبيل المثال ، إعداد الأنسجة في الخطوة 2) أو تقسيم الأنسجة السليمة. إذا فشلت طريقة HCR WM-FISH الموصوفة هنا في الكشف عن نسخة الحمض النووي الريبي في الزائدة الشمية ، فقد يتم التعبير عن الجين في عدد قليل من الخلايا فقط ويتطلب مسحا مكثفا للأنسجة ، أو ربما لا يتم نسخه ، أو قد يتم نسخه عند مستوى أقل من حد الكشف لهذه الطريقة. يمكن إجراء تسلسل RT-PCR أو RNA الكمي للتحقق من صحة هذه النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر مارجو هير ومختبر ليزلي فوشال على مشاركة بروتوكول التهجين في الموقع لملاحق الزاعجة المصرية الشمية. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة إلى C.J.P. (NIAID R01Al137078) ، وزمالة HHMI Hanna Gray إلى JIR ، وجائزة مسرع جونز هوبكنز لما بعد الدكتوراه إلى JIR ، وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لأبحاث الملاريا إلى JIR. ونشكر معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا ومؤسسة بلومبرغ الخيرية على دعمهما.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al.
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al.
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
