Summary
Der Artikel beschreibt die Methoden und Reagenzien, die notwendig sind, um eine Hybridisierungskettenreaktion, RNA-Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) durchzuführen, um Einblicke in die räumliche und zelluläre Auflösung von chemosensorischen Rezeptorgenen in der Moskitoantenne und im Oberkieferpalp zu erhalten.
Abstract
Stechmücken sind effektive Überträger tödlicher Krankheiten und können sich mit Hilfe von chemosensorischen Rezeptoren, die in ihren olfaktorischen Anhängseln exprimiert werden, in ihrer chemischen Umgebung zurechtfinden. Das Verständnis, wie chemosensorische Rezeptoren in den peripheren olfaktorischen Anhängseln räumlich organisiert sind, kann Einblicke in die Kodierung von Gerüchen im Riechsystem von Mücken geben und neue Wege zur Bekämpfung der Ausbreitung von durch Mücken übertragenen Krankheiten aufzeigen. Das Aufkommen der dritten Generation der Hybridisierungskettenreaktions-RNA-Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) ermöglicht die räumliche Kartierung und gleichzeitige Erstellung von Expressionsprofilen mehrerer chemosensorischer Gene. Hier beschreiben wir einen schrittweisen Ansatz zur Durchführung von HCR-RNA-WM-FISH an der Anopheles-Moskitoantenne und dem Oberkieferpalp. Wir untersuchten die Sensitivität dieser Technik, indem wir das Expressionsprofil ionotroper olfaktorischer Rezeptoren untersuchten. Wir fragten, ob die beschriebene HCR WM-FISH-Technik für Multiplex-Studien geeignet ist, bei denen RNA-Sonden an drei spektral unterschiedliche Fluorophore gebunden werden. Die Ergebnisse lieferten Hinweise darauf, dass HCR-RNA WM-FISH robust sensitiv ist, um mehrere chemosensorische Gene gleichzeitig in den olfaktorischen Anhängseln der Antenne und des Oberkiefers zu detektieren. Weitere Untersuchungen belegen die Eignung von HCR WM-FISH für das Co-Expressions-Profiling von Doppel- und Dreifach-RNA-Targets. Diese Technik könnte, wenn sie mit Modifikationen angewendet wird, anpassungsfähig sein, um Gene von Interesse im Riechgewebe anderer Insektenarten oder in anderen Anhängseln zu lokalisieren.
Introduction
Stechmückenvektoren wie Anopheles gambiae sind auf ein reiches Repertoire an chemosensorischen Genen angewiesen, die in ihren peripheren olfaktorischen Anhängseln exprimiert werden, um in einer komplexen chemischen Welt zu gedeihen und verhaltensrelevante Gerüche zu identifizieren, die von menschlichen Wirten ausgehen, Nektarquellen aufzuspüren und Eiablageplätze zu lokalisieren1. Die Mückenantenne und der Oberkieferpalp sind mit chemosensorischen Genen angereichert, die die Geruchswahrnehmung in diesen olfaktorischen Anhängseln steuern. Drei Hauptklassen von ligandengesteuerten Ionenkanälen steuern die Geruchserkennung in den olfaktorischen Anhängseln von Mücken: die Geruchsrezeptoren (ORs), die mit einem obligaten Geruchsrezeptor-Co-Rezeptor (Orco) zusammenarbeiten; die ionotropen Rezeptoren (IRs), die mit einem oder mehreren IR-Corezeptoren (IR8a, IR25a und IR76b) interagieren; die chemosensorischen gustatorischen Rezeptoren (GRs), die als Komplex aus drei Proteinen zum Nachweis von Kohlendioxid (CO2)1,2 fungieren.
Die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis der Expression endogener mRNA3. Im Allgemeinen verwendet diese Methode eine Fluorophor-markierte einzelsträngige Nukleinsäuresonde mit einer Sequenz, die komplementär zu einer Ziel-mRNA ist. Die Bindung der fluoreszierenden RNA-Sonde an die Ziel-RNA ermöglicht die Identifizierung von Zellen, die ein Transkript von Interesse exprimieren. Jüngste Fortschritte ermöglichen nun die Detektion von Transkripten in ganzem Mückengewebe 4,5. Die erste Generation der Hybridisierungskettenreaktion (HCR)-Technologie verwendete einen RNA-basierten HCR-Verstärker; Dies wurde in einer Methode der zweiten Generation verbessert, die stattdessen technisch hergestellte DNA für den HCR-Verstärker 6,7 verwendete. Dieses Upgrade führte zu einer 10-fachen Steigerung des Signals, einer drastischen Senkung der Produktionskosten und einer deutlichen Verbesserung der Haltbarkeit der Reagenzien 6,7.
In dem Protokoll beschreiben wir die Verwendung einer HCR-Whole-Mount-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (HCR RNA WM-FISH) der dritten Generation, die für den Nachweis der räumlichen Lokalisierung und Expression eines beliebigen Gens entwickelt wurde 8,9. Bei dieser zweistufigen Methode werden zunächst Nukleinsäuresonden verwendet, die für die interessierende mRNA spezifisch sind, aber auch eine Initiatorerkennungssequenz enthalten. Im zweiten Schritt werden mit Fluorophoren markierte Haarnadeln verwendet, die an die Initiatorsequenz binden, um das Fluoreszenzsignal zu verstärken (Abbildung 1). Dieses Verfahren ermöglicht auch das Multiplexen von zwei oder mehr RNA-Sonden und das Amplifizieren von Sondensignalen, um den RNA-Nachweis und die Quantifizierung zu erleichtern8. Die Visualisierung der Transkripthäufigkeit und der RNA-Lokalisierungsmuster von chemosensorischen Genen, die in den olfaktorischen Anhängen exprimiert werden, bietet den ersten Einblick in chemosensorische Genfunktionen und Geruchskodierungen.
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Protocol
1. Überlegungen und Vorbereitung der Materialien
- Entscheiden Sie, ob ein ganzer Schnitt oder ein Kryoschnitt des Gewebes angemessen ist. Dieses Protokoll ist optimiert für die In-situ-Bildgebung von RNA in der Anopheles-Mückenantenne und im Oberkieferpalp ohne Kryoschnitt. Wenn die Proben dicker als 5 mm sind, wird ein Kryoschnitt empfohlen, um das Eindringen der Sonde zu ermöglichen.
- Identifizieren Sie die interessierenden Gene und kopieren Sie die Sequenzen einschließlich Introns und Exons aus einer geeigneten Datenbank. Transkribieren Sie die Gensequenz in RNA für die Synthese.
- Bestimmen Sie, ob Sie Sonden von kommerziellen Anbietern kaufen oder ob Sonden im Labor synthetisiert werden sollen.
HINWEIS: In dieser Studie wurden die In-situ-Sonden von einem kommerziellen Anbieter gekauft (siehe Materialtabelle). Alternativ kann es synthetisiert werden, wie zuvor berichtet10. Die in der Studie verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 1 beschrieben. Die für die Herstellung der Reagenzien erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
2. Vorfixierung des Gewebes
- Betäuben Sie 10-15 erwachsene weibliche oder männliche Anopheles coluzzii-Mücken (Stamm N'Gousso), die 5-10 Tage nach dem Schlüpfen alt sind, indem Sie sie mit einem Mundsauger in einen Pappbecher oder ein Plastikröhrchen sammeln und in einen Eimer mit Eis legen. Eine erfolgreiche Kälteanästhesie kann bestätigt werden, wenn die Mücken unbeweglich sind.
- Enthaupte sie, indem du die Köpfe mit einer Zange aus dem Halsbereich entfernst. Greife mit der nicht-dominanten Hand den Thorax mit einer Pinzette und trenne den Hals vom Körper mit einer Pinzette, die von der dominanten Hand gehalten wird. Die Köpfe werden in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 μl Chitinase-Chymotrypsin-Dimethylsulfoxid-Puffer (CCD-Puffer) auf Eis gelegt.
HINWEIS: Das Einfrieren von Tieren kann die Antennen verformen. Ein schneller Knockdown auf Eis wird empfohlen. Das Alter der Mücke während des Tests kann je nach Projekt variieren. Es ist wichtig, ihren physiologischen Status zu bestätigen und zu koordinieren, z. B. ob sie mit Blut gefüttert, ausgehungert oder begattet werden. In dieser Studie wurden olfaktorische Anhängsel von Mücken entnommen, die mit Blut gefüttert und gepaart worden waren. - Moskitoköpfe in CCD-Puffer bei 37 °C auf einem Heizblock 5 min vorheizen und dann das Röhrchen mit den Moskitoköpfen in einen Hybridisierungsofen überführen und bei 37 °C drehen. Die Inkubationszeit im CCD-Puffer hängt vom Gewebetyp ab. Für weibliche Anopheles-Antennen 20 Minuten verwenden, männliche Antennen benötigen 15 Minuten, während für die Oberkieferpalpen eine längere Inkubationszeit (1 h) erforderlich ist.
- Den gesamten Inhalt des Röhrchens in ein Sezieruhrglas geben. Gießen Sie die Probe vorsichtig in die Vertiefung eines Uhrenglases (Sezierglas). Wenn Moskitoköpfe im Röhrchen stecken, verwenden Sie eine Pipette, um CCD-Puffer in das Röhrchen zu geben und den Kopf auszuspülen.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Köpfe oder alle Antennen/Palpen, die sich während der Inkubation abgelöst haben, vorsichtig zu übertragen und 1 ml des Präfixiermittels zu fixieren.
HINWEIS: Übrig gebliebener CCD-Puffer kann bei -20 ° C aufbewahrt werden. Puffer kann bis zu 3x wiederverwendet werden. Wenn das Präfixiermittel aufgrund der CCD-Pufferverschleppung durch das Gewebe leicht bräunlich wird, ersetzen Sie es durch weitere 1 ml Fixiermittel. - Drehen Sie die Köpfe im Vorfixiermittel für 24 Stunden bei 4° C mit einem Nutator.
HINWEIS: Die Wippgeschwindigkeit für den in dieser Studie verwendeten Nutator war nicht einstellbar; Es wurde die vom Hersteller eingestellte Standarddrehzahl (12 U/min) verwendet.
3. Gewebedissektion
- Spülköpfe 4x (5 Minuten pro Waschgang) mit 1 ml 0,1 % PBS-Tween auf Eis spülen. Um Probenverluste zu vermeiden, verwenden Sie eine Pipette, die an der Gelladespitze befestigt ist, um die Flüssigkeit zu entfernen.
HINWEIS: Zwei schnelle Wäschen, gefolgt von einer 10-minütigen langen Wäsche, und eine letzte Schnellwäsche kann anstelle von Schritt 3.1 durchgeführt werden. - Setzen Sie die Köpfe in der Röhre in ein Sezieruhrglas um. Gießen Sie die Probe vorsichtig in die Vertiefung eines Uhrenglases. Spülen Sie Mückenköpfe, die in der Röhre stecken, mit 0,1% PBS-Tween aus.
- Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop das interessierende Gewebe (Antennen/Palpen) mit einer scharfen Zange vom Kopf. Halten Sie den hinteren Teil des Kopfes mit einer Pinzette fest und greifen Sie eine Antenne mit einer anderen Pinzette von der Basis aus. Reinigen Sie die Pinzette mit Papier, das mit RNAse-freiem Lösungsmittel angefeuchtet ist. Entfernen Sie die Palps auf die gleiche Weise.
- Übertragen Sie die Antennen und Palpen mit einer Pinzette in leere DNA/RNase-freie Röhrchen, die auf Eis gestellt werden. Trennen Sie die verschiedenen Gewebeteile in vorbeschriftete verschiedene Röhrchen.
- Gewebe in 400 μl Lösungsmittel mit einer Mischung aus Methanol (MeOH 80%) und Dimethylsulfoxid (DMSO 20%) 1 h bei Raumtemperatur dehydrieren.
HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, Taschentücher auf einen Nutengeber zu legen. Lassen Sie es bei Raumtemperatur auf einem Röhrchengestell auf dem Labortisch stehen. Es wird empfohlen, eine frische Lösungsmittelmischung zu verwenden. Für eine 500-μl-Stammlösung mischen Sie 400 μl MeOH mit 100 μl DMSO. - Ersetzen Sie das Entwässerungsreagenz durch 400 μl absolutes (100%) Methanol und dehydrieren Sie das Gewebe über Nacht bei -20 °C. Lassen Sie das Gewebe durch die Schwerkraft absetzen und verwenden Sie eine Pipette, um die Flüssigkeit zu entfernen.
HINWEIS: Die Proben sind für einen längeren Zeitraum der Dehydrierung geeignet, bis zu 4 Nächte wurden ohne Signalverlust getestet.
4. Gewebe nach der Fixierung
- Rehydrieren Sie das Gewebe in einer vierstufigen Serie von abgestuften 400 μl MeOH/PBS-Tween für 10 Minuten auf Eis. Beginnen Sie mit 75 % MeOH/25 % PBS-Tween, gefolgt von 50 % MeOH / 50 % PBS-Tween, dann 25 % MeOH / 75 % PBS-Tween und schließlich 100 % PBS-Tween.
HINWEIS: Eine Gel-Ladespitze mit einer winzigen Öffnung kann verwendet werden, um den Puffer aus dem Röhrchen zu entfernen, um den Verlust des Gewebes zu vermeiden. Die Pufferentfernung kann unter einem Präpariermikroskop erfolgen. - Mit 400 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (PBS-T) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur waschen. Waschen Sie, indem Sie die Probe auf einen Nutator legen.
- Stellen Sie eine 20 μg/ml Proteinase-K-Lösung her und inkubieren Sie sie in 400 μl Proteinase-K-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Verdünnen Sie 20 mg/ml Proteinase-K-Stamm (1000x Stammlösung), d. h. 2 μl in 2 ml 0,1% PBS-Tween. Die Reste können in einem -20°C Gefrierschrank aufbewahrt werden. - Stoppen Sie die enzymatische Verdauung des Gewebes, indem Sie es 2x für 10 Minuten mit 400 μl 0,1% PBS-Tween waschen.
- 400 μl des Postfixiermittels zugeben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. 3x waschen, 15 min pro Wäsche, mit 400 μl 0,1% PBS-Tween.
5. Hybridisierung der Sonde
- Inkubieren Sie das Gewebe 5 Minuten lang in 400 μl Sondenhybridisierungspuffer. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in den Puffer eingetaucht ist, indem Sie vorsichtig pipettieren.
- Bereiten Sie sich auf den nächsten Schritt vor, indem Sie ein Aliquot des Sondenhybridisierungspuffers für 30 min auf 37 °C erhitzen.
- Puffer entfernen und mit 400 μL vorgeheiztem Sonden-Hybridisierungspuffer für 30 min bei 37 °C vorhybridisieren.
- Stellen Sie die Sondenlösung für die chemosensorischen Zielrezeptoren (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a oder Orco) her, indem Sie 8 pM Sonde hinzufügen. 8 μl 1 μM Sondenmaterial zu 500 μl vorgewärmtem Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen.
- Entfernen Sie den vorgewärmten Sondenhybridisierungspuffer und ersetzen Sie ihn durch 400 μl erhitzte Sondenlösung.
- Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 ° C für zwei Nächte auf einem Nutenator, der in einen Inkubator gestellt und unter einer Box abgedeckt ist.
6. Verstärkung der Sonde
- Erhitzen Sie den Sondenwaschpuffer auf 37 ° C. Entfernen Sie überschüssige Sondenlösung, indem Sie das Gewebe 5x spülen, 10 min pro Waschgang, mit 400 μl Sondenwaschpuffer bei 37 ° C, im Inkubator nutieren.
HINWEIS: Die Vorbereitungen für Schritt 6.4 können beginnen. Beachten Sie den Hinweis in Schritt 6.4. - Waschen Sie die Proben 2 x 5 min pro Waschgang mit 400 μl 5x Kochsalz-Natriumcitrat mit 10 % Tween-20 (SSCT) bei Raumtemperatur. Amplifikationspuffer auf Raumtemperatur auf einem Labortisch auftauen.
- Bereiten Sie das Gewebe für die Amplifikation vor, indem Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 400 μl Amplifikationspuffer inkubieren. Aufgrund der Viskosität des Amplifikationspuffers kann es vorkommen, dass das Gewebe nicht vollständig untergetaucht wird. Mischen Sie, indem Sie den Amplifikationspuffer vorsichtig unter das Gewebe pipettieren und den Puffer auf dem Gewebe ausstoßen, bis sie untergetaucht sind.
- 18 pM Hairpin h1 und 18 pM Hairpin h2 separat vorbereiten, indem 6 μl 3 μM Material 90 s lang bei 95 °C erhitzt und 30 Minuten lang in einer dunklen Schublade auf Raumtemperatur abkühlen. Stellen Sie sicher, dass die PCR-Röhrchen fest verschlossen sind, um zu verhindern, dass die Haarnadeln beim Erhitzen in einem Thermocycler verdampfen.
HINWEIS: Um Zeit zu sparen, kann Schritt 6.4 während des 4. Waschschritts in Schritt 6.1 gestartet werden. Haarnadeln sollten separat erhitzt werden, um Kreuzreaktionen zu vermeiden. Haarnadeln sollten in diesem Schritt nicht mit einem Puffer verdünnt werden. Die Hairpins können zusammen mit den Sonden beim Sondenhersteller erworben werden. - Der in Schritt 6.3 hinzugefügte Verstärkungspuffer wird durch ein Gemisch ersetzt, das die erhitzten Haarnadeln (aus Schritt 6.4) zusammen mit 100 μl Verstärkungspuffer enthält. Eine typische Reaktion enthält 6 μl h1, 6 μl h2 und 100 μl Amplifikationspuffer.
HINWEIS: Die Haarnadeln h1 und h2 können nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur kombiniert und dann zu 100 μl Verstärkungspuffer hinzugefügt werden. Um zu vermeiden, dass die Gewebeproben von einem Röhrchen in ein anderes übertragen werden, kann der Amplifikationspuffer in Schritt 6.3 entfernt und durch das in Amplifikationspuffer verdünnte Haarnadelgemisch ersetzt werden. - Gewebe über Nacht inkubieren und im Dunkeln bei Raumtemperatur mit der Standardgeschwindigkeit des Nutators nutieren.
7. Einbetten der Gewebeprobe
- Verdünnen Sie den Amplifikationspuffer im inkubierten Gewebe mit 300 μl 5x SSCT (Natriumchlorid-Natriumcitrat verdünnt in Tween-20).
HINWEIS: Die Verdünnung ist hilfreich, um die Viskosität zu verringern und erleichtert das Entfernen des Amplifikationspuffers aus dem Gewebe. Wir verwendeten Triton-X 100 für das Präfixiermittel und Tween-20 für den postfixativen Schritt, da sie sich in ihrer Wirkung als Wirkstoffe zur Permeabilisierung der Zellmembran unterscheiden. - Waschen Sie das Gewebe 5x mit 400 μl 5x SSCT bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Lagern Sie das Gewebe bei Bedarf vorübergehend bei 4 °C, bis es zum Befestigen bereit ist. Wir haben 2 Tage vor der Bildgebung nicht überschritten. - Stellen Sie 5 Tröpfchen Montagelösung auf einem Objektträger her. Schneiden Sie die Spitze einer 200-μl-Pipettenspitze ab, um sie breiter zu machen, und übertragen Sie das Gewebe auf einen neuen Objektträger.
- Fassen Sie die Gewebeproben mit einer Pinzette an ihrer Basis und tauchen und spülen Sie sie vorsichtig in eine Reihe von Tröpfchen der Einbettlösung. Achten Sie darauf, das Gewebe bei diesem Schritt nicht zu brechen.
- Mit Montagelösung montieren, Deckglas auflegen und mit Nagellack versiegeln. Abbildung von In-situ-Gewebeproben mit einem konfokalen Mikroskop.
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Representative Results
Robuster Nachweis chemosensorischer Gene in Anopheles-Antenne
Wir untersuchten die Sensitivität der HCR FISH-Methode (Abbildung 1), um die Expression von chemosensorischen Rezeptoren in Riechgeweben von Mücken nachzuweisen. Geleitet von den RNA-Transkriptdaten, die zuvor über die weibliche Anopheles-Mückenantenne berichtet wurden, generierten wir Sonden, um eine Vielzahl von IRs anzuvisieren. Die durchschnittlichen Transkriptionswerte aus vier unabhängigen Antennen-Transkriptom-Studien zeigten, dass Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) und Ir7t (13 RPKM) im Vergleich zu den Co-Rezeptoren Ir25a (197 RPKM) und Ir76b (193 RPKM) weniger häufig in der Antenne vorhanden waren5,11,12,13,14. Wir haben Sonden generiert, um Ir41t.1, Ir75d und Ir7t anzuvisieren. IR64a (31 RPKM) wurde ebenfalls ins Visier genommen, da sein Transkriptspiegel etwa 3x häufiger ist als der niedrigste Transkriptwert unter den Kandidatengenen von Interesse. Hierbei ist zu beachten, dass die RPKM-Werte aus Transkriptomik-Studien eine Massenmessung von Transkripten der gesamten Antenne darstellen. So könnte es sein, dass nur wenige Neuronen ein IR-Gen-Transkript stark exprimieren, oder es könnte sein, dass ein IR-Gen in vielen Zellen niedrig exprimiert wird. RPKM-Werte müssen daher nicht unbedingt mit dem Häufigkeitsniveau eines IR innerhalb eines Neurons übereinstimmen. Darüber hinaus könnte die Signalverstärkung durch die HCR-Methode es auch schwierig machen, diese Methode zur genauen Messung neuronaler Transkriptspiegel auf der Grundlage von Fluoreszenzsignalen zu verwenden. In unserer jüngsten Veröffentlichung haben wir diese Konzepte ausführlicher erörtert5. Die Daten deuten darauf hin, dass HCR WM-FISH sehr empfindlich auf den Nachweis von mRNA-Transkripten aus Antennengeweben reagiert, wie in Abbildung 2 dargestellt.
Multiplex-Co-Markierung verschiedener RNA-Targets in chemosensorischen Anhängseln
Um die Kolokalisation von RNA-Zielen zu untersuchen, haben wir Sonden generiert, die mit verschiedenen Fluorophoren konjugiert sind. Die doppelte In-situ-Hybridisierung , die auf Transkripte des Odorant-Rezeptor-Co-Rezeptor-Gens (Orco) und des am weitesten verbreiteten ionotropen Rezeptor-Co-Rezeptor-Gens (Ir25a) abzielte, zeigte eine Kolokalisation dieser unterschiedlichen chemosensorischen Rezeptorfamilien in einer Untergruppe von Zellpopulationen in der Antenne (Abbildung 3A) und im Oberkieferpalp (Abbildung 3B). Wir untersuchten auch die Kolokalisation von Transkripten von drei IR-Corezeptor-Genen (Ir8a, Ir25a und Ir76b). Kolokalisationsmuster deuten darauf hin, dass Ir76b-positive Zellen Ir25a exprimieren, während Ir8a-positive Zellen teilweise mit Ir76b und Ir25a kolokalisieren (Abbildung 4). Die Co-Expressionsanalyse der IR-Corezeptoren zeigt die Robustheit der Verwendung von HCR WM-FISH für Multiplex-Studien.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der in situ Hybridisierungskettenreaktion. Diese Methode funktioniert in zwei Schritten: Detektion und Amplifikation. Ein Sondenset für die in situ Hybridisierungskettenreaktion besteht aus einem Split-Initiator und einer Nukleinsäuresequenz, die spezifisch für das RNA-Target ist. Mehrere Paare von Sondensätzen können entworfen werden, um mehrere Regionen im RNA-Target zu hybridisieren. Dadurch wird der Erkennungsschritt definiert. Der Amplifikationsschritt erfordert, dass Fluorophor-markierte Haarnadeln (h1 und h2) spezifisch an den Initiator binden, der mit einem Sondensatz konjugiert ist. Bei der Bindung wird das durch den Fluorophor markierte RNA-Signal durch wiederholte Bindung von Fluorophor-markierten Haarnadeln verstärkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: RNA-Lokalisierung von IR-chemosensorischen Genen. HCR WM-FISH von weiblichen Anopheles coluzzii-Antennen zum Anvisieren von IRs. Zu den RNA-Sonden gehören (A) IR41t.1, (B) IR75d, (C) IR7t und (D) IR64a. Die Einschübe in weiß gestrichelten Kästchen sind vergrößerte Bilder aus dem Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Doppelte in situ Kolokalisation chemosensorischer Gene in der Antenne und im Oberkieferpalp. Konfokale Z-Stapel-Bilder von Zellen, die Ir25a (grün) und Orco (magenta) in der (A) Antenne und (B) Oberkieferpalp weiblicher Anopheles coluzzii-Mücken exprimieren. Die Einschübe in weiß gestrichelten Kästchen sind vergrößerte Bilder aus dem Gewebe. Die Skala beträgt 10 μm. Abbildung 3B wurde von15 abgeändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Kartierung der räumlichen Kolokalisation mehrerer RNA-Ziele. In-situ-Bilder zeigen Kolokalisationsmuster von drei IR-Korezeptoren, IR25a (magenta), IR8a (grün) und IR76b (blau) in der Moskitoantenne. Weiße Pfeile zeigen auf Zellen, die die drei IR-Korezeptoren (IR25a, IR8a und IR76b) exprimieren. Die Skala beträgt 20 μm. Diese Zahl wurde von5 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Reagenzien für die In-situ-Hybridisierungskettenreaktion. Reagenzien, die für die Durchführung der Hybridisierungskettenreaktion und der Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die dritte Generation der Hybridisierungskettenreaktion (HCR) zeichnet sich durch ihre Empfindlichkeit und Robustheit zur Visualisierung mehrerer RNA-Ziele aus8. HCR WM-FISH wurde erfolgreich bei den Embryonen von Drosophila, Hühnern, Mäusen und Zebrafischen sowie bei den Larven von Nematoden und Zebrafischen eingesetzt 10,16,17. Moskitoantennen und Oberkieferpalpen sind in der Regel anfällig für hohe Autofluoreszenz und schwache Sondenpenetration, was bei der Durchführung herkömmlicher In-situ-Methoden für die gesamte Montage eine besondere Herausforderung darstellt. Diese Nachteile wurden durch den in das HCR-Protokoll integrierten Signalverstärkungsschritt verringert, der das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis verbessert und den Nachweis von olfaktorischen Chemorezeptor-mRNA-Transkripten ermöglicht (Abbildung 2). Das HCR-Protokolldesign stellt sicher, dass die initiierenden Sonden an die Amplifikationspolymere gebunden sind, was die Abbildung von RNA-Zielen mit niedrigem Signal ermöglicht. Im Multiplex-Aufbau wurden verschiedene orthogonale HCR-Verstärker an spektral einzigartige Fluorophore gebunden. Dieser Ansatz war entscheidend, um ein spektrales Durchsickern durch einen benachbarten Bildgebungskanal zu vermeiden.
Um die HCR-Methode für den Einsatz mit Mückenanhängen zu optimieren, haben wir mehrere Beobachtungen gemacht. Die HCR-Verstärker sind lichtempfindlich und sollten immer in einer Box in einem -20°C Gefrierschrank gelagert werden. Unserer Erfahrung nach kann eine ausgedehnte Inkubation von Geweben in CCD-Puffer, Proteinase K, oder eine kurze Fixierungszeit in Paraformaldehyd zu einem Bruch von Antennen oder Palpen während der Waschschritte führen. Auch Antennen und Oberkieferpalpen sollten immer an der Basis gegriffen werden, um einen Bruch zu vermeiden. In der frühen Phase der Anpassung dieses Protokolls verloren wir während der Reihe des Pufferaustauschs (Schritte 5 und 6) immer wieder Gewebe. Um solche Verluste zu minimieren, wurde die Anzahl der Gewebe zu Beginn des Experiments verdoppelt, Waschschritte und Pufferwechsel unter dem Mikroskop durchgeführt und Gelladespitzen verwendet, die nicht breiter als 0,5 mm waren, um die Puffer aus dem Gewebe zu entfernen.
Der HCR WM-FISH hat sich in peripheren olfaktorischen Anhängseln der Stechmückenvektoren Anopheles gambiae 5,15 und Aedes aegypti 4,18 bewährt, und das Protokoll konnte weiter optimiert und an andere Insektengewebeteile oder andere Tiere angepasst werden. Das ursprüngliche, vom Hersteller entwickelte Protokoll enthält keine Inkubation im CCD-Puffer. Dieser Schritt wurde in das Protokoll integriert, um die Chitinkutikula zu verdauen und zu permeabilisieren. Wir haben die Inkubationszeit in den Sondensets um zwei Nächte verlängert, um mehr Zeit für die Sondenpenetration zu haben, eine Modifikation des Herstellerprotokolls, das eine Inkubationszeit von 16 Stunden empfiehlt, die für generische Proben auf einem Objektträger gut geeignet ist. Die Optimierung dieses Protokolls für andere Gewebeteile von Insekten würde eine Variation der Inkubationszeit im CCD-Puffer erfordern. Periphere Gewebeteile mit dicker Nagelhaut erfordern wahrscheinlich eine längere Inkubationszeit. Die Konzentration der Proteinase K muss ebenfalls experimentell angepasst werden, während dieses Protokoll an verschiedene Gewebe- oder Entwicklungsstadien von Tieren angepasst wird. Bei der Arbeit mit Geweben, die dicker als 5 mm sind, wird das Eindringen der Sonde zu einer Herausforderung. In einer solchen Situation sind zusätzliche Anstrengungen erforderlich, um eine Gewebekryosektion durchzuführen oder das in dieser Studie beschriebene Protokoll weiter zu ändern.
HCR WM-FISH ist im Vergleich zur räumlichen Transkriptomik auf die gleichzeitige Visualisierung von nur wenigen Genzielen beschränkt, was möglicherweise die gleichzeitige Abbildung von Tausenden von Genen ermöglichen könnte19. Die kommerzielle Synthese von RNA-Sonden ist teuer; Die Alternative wäre, die Sonden und Verstärker im Labor herzustellen, was jedoch für die meisten Gruppen eine Herausforderung darstellen kann und arbeits- und zeitintensiv ist. Dieses Protokoll wird auch durch Schwierigkeiten beim Eindringen der RNA-Sonde in dicke Proben eingeschränkt, die Änderungen des Protokolls (z. B. Gewebepräparation in Schritt 2) oder das Schneiden des intakten Gewebes erfordern könnten. Wenn die hier beschriebene HCR-WM-FISH-Methode kein RNA-Transkript in einem olfaktorischen Anhängsel nachweisen kann, kann das Gen nur in wenigen Zellen exprimiert werden und eine umfangreiche Untersuchung des Gewebes erfordern, möglicherweise nicht transkribiert werden oder auf einem Niveau unterhalb der Nachweisgrenze dieser Methode transkribiert werden. Quantitative RT-PCR oder RNA-Sequenzierung könnte durchgeführt werden, um solche Ergebnisse zu validieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Margo Herre und dem Labor von Leslie Vosshall für die Bereitstellung ihres In-situ-Hybridisierungsprotokolls für Aedes aegypti olfaktorische Anhängsel. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health an C.J.P. (NIAID R01Al137078), ein HHMI Hanna Gray Stipendium an J.I.R., einen Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award an J.I.R. und ein Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship an J.I.R. unterstützt. Wir danken dem Johns Hopkins Malaria Research Institute und Bloomberg Philanthropies für ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
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