Summary
이 기사에서는 모기 안테나와 상악 팔프에서 화학 감각 수용체 유전자의 공간 및 세포 분해능에 대한 통찰력을 밝히기 위해 혼성화 연쇄 반응 RNA 전체 장착 형광 in situ 교잡(HCR, RNA WM-FISH)을 수행하는 데 필요한 방법과 시약을 설명합니다.
Abstract
모기는 치명적인 질병의 효과적인 매개체이며 후각 부속기에서 발현되는 화학 감각 수용체를 사용하여 화학적 환경을 탐색할 수 있습니다. 화학감각 수용체가 말초 후각 부속기에서 어떻게 공간적으로 조직되어 있는지 이해하면 냄새가 모기 후각계에서 어떻게 암호화되는지에 대한 통찰력을 제공하고 모기 매개 질병의 확산을 막는 새로운 방법을 알려줄 수 있습니다. 3세대 혼성화 연쇄 반응 RNA 전체 장착 형광 in situ 교잡화(HCR, RNA, WM-FISH)의 출현으로 여러 화학 감각 유전자의 공간 매핑 및 동시 발현 프로파일링이 가능합니다. 여기에서는 Anopheles 모기 안테나와 상악 손바닥에서 HCR RNA WM-FISH를 수행하기 위한 단계적 접근 방식을 설명합니다. 우리는 이온성 후각 수용체의 발현 프로파일을 조사하여 이 기술의 민감도를 조사했습니다. 설명된 HCR WM-FISH 기법이 RNA 프로브를 스펙트럼적으로 구별되는 3개의 형광단에 테더링하여 다중 연구에 적합한지 물었습니다. 그 결과 HCR RNA WM-FISH가 더듬이와 상악 팔 후각 부속기에서 여러 화학 감각 유전자를 동시에 검출할 수 있도록 매우 민감하다는 증거가 제공되었습니다. 추가 조사를 통해 이중 및 삼중 RNA 표적의 동시 발현 프로파일링에 대한 HCR WM-FISH의 적합성이 입증되었습니다. 이 기술은 변형과 함께 적용될 때 다른 곤충 종의 후각 조직이나 다른 부속지의 관심 유전자를 국소화하는 데 적응할 수 있습니다.
Introduction
Anopheles gambiae와 같은 모기 매개체는 복잡한 화학 세계에서 번성하기 위해 말초 후각 부속지에서 발현되는 풍부한 화학 감각 유전자 레퍼토리에 의존하며, 인간 숙주에서 나오는 행동 관련 냄새를 식별하고, 꿀 공급원을 감지하고, 산란 부위를 찾습니다1. 모기 안테나와 상악 손바닥에는 이러한 후각 부속 기관에서 냄새 감지를 유도하는 화학 감각 유전자가 풍부합니다. 리간드 개폐 이온 채널의 세 가지 주요 부류는 모기의 후각 부속지에서 냄새 감지를 유도합니다: 의무 냄새 수용체 공동 수용체(Orco)와 함께 기능하는 냄새 수용체(OR); 하나 이상의 IR 코어 수용체(IR8a, IR25a 및 IR76b)와 상호 작용하는 이온성 수용체(IR); 화학 감각 미각 수용체 (GRs), 이산화탄소 (CO2)를 검출하기 위하여 3개의 단백질의 복합물로 기능하는1,2.
RNA 형광 in situ hybridization은 내인성 mRNA3의 발현을 검출하기 위한 강력한 도구입니다. 일반적으로 이 방법은 표적 mRNA에 상보적인 염기서열을 가진 형광단 태깅 단일 가닥 핵산 프로브를 사용합니다. 형광 RNA 프로브를 표적 RNA에 결합하면 관심 전사체를 발현하는 세포를 식별할 수 있습니다. 최근의 발전으로 이제 전체 마운트 모기 조직에서 전사체를 검출할 수 있게 되었다 4,5. 1세대 하이브리드화 연쇄 반응(HCR) 기술은 RNA 기반 HCR 증폭기를 사용했습니다. 이것은 HCR 증폭기 6,7에 대해 엔지니어링된 DNA를 대신 사용하는 2세대 방법에서 개선되었습니다. 이 업그레이드로 신호가 10배 증가하고, 생산 비용이 크게 절감되었으며, 시약의 내구성이 크게 향상되었습니다 6,7.
프로토콜에서는 모든 유전자 8,9의 공간적 국소화 및 발현을 검출하기 위해 설계된 3세대 HCR 전체 장착 RNA 형광 in situ hybridization(HCR RNA WM-FISH) 방법의 활용에 대해 설명합니다. 이 2단계 방법은 먼저 관심 mRNA에 특이적이지만 개시제 인식 서열도 포함하는 핵산 프로브를 사용합니다. 두 번째 단계에서는 형광 신호를 증폭하기 위해 개시제 시퀀스에 결합하는 형광단 표지 헤어핀을 사용합니다(그림 1). 이 방법은 또한 두 개 이상의 RNA 프로브를 멀티플렉싱하고 프로브 신호를 증폭하여 RNA 검출 및 정량화를 용이하게 한다8. 후각 부속기에서 발현되는 화학 감각 유전자의 전사체 풍부도 및 RNA 국소화 패턴을 시각화하면 화학 감각 유전자 기능 및 냄새 코딩에 대한 첫 번째 통찰력을 얻을 수 있습니다.
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Protocol
1. 자료의 고려 사항 및 준비
- 조직의 전체 마운트 또는 극저온 절편이 적절한지 결정합니다. 이 프로토콜은 냉동 절개 없이 Anopheles 모기 안테나와 상악 구개에서 RNA의 전체 마운트 in situ 이미징에 최적화되어 있습니다. 샘플이 5mm보다 두꺼우면 프로브 침투를 위해 극저온 절편을 사용하는 것이 좋습니다.
- 관심 유전자를 식별하고 적절한 데이터베이스에서 인트론 및 엑손을 포함한 염기서열을 복사합니다. 합성을 위해 유전자 염기서열을 RNA로 전사합니다.
- 상용 공급업체로부터 프로브를 구매할지 또는 실험실에서 프로브를 합성할지 여부를 결정합니다.
알림: 이 연구에서 현장 프로브는 상용 공급업체에서 구입했습니다( 재료 표 참조). 대안적으로, 이전에 보고된 바와 같이 합성될 수있다 10. 연구에 사용된 시약은 표 1에 설명되어 있습니다. 시약을 준비하는 데 필요한 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.
2. 조직 전 고정
- 출현 후 5-10 일 된 10-15 성인 여성 또는 남성 Anopheles coluzzii 모기 (균주 N' Gousso)를 구강 흡인기로 종이컵 또는 플라스틱 튜브에 모으고 얼음이 들어있는 양동이에 넣어 마취합니다. 성공적인 감기 유도 마취는 모기가 움직이지 않을 때 확인할 수 있습니다.
- 한 쌍의 집게로 목 부위에서 머리를 제거하여 목을 베십시오. 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 집게로 흉부를 잡고 주로 사용하는 손으로 잡은 집게로 목과 몸을 분리합니다. 얼음 위에 500μL의 키티나아제-키모트립신 디메틸 설폭사이드 완충액(CCD 완충액)이 들어 있는 1.5mL 튜브에 헤드를 넣습니다.
알림: 얼린 동물은 더듬이를 변형시킬 수 있습니다. 얼음 위에서 빠르게 녹다운하는 것이 좋습니다. 테스트 중 모기의 나이는 프로젝트에 따라 다를 수 있습니다. 피를 먹었는지, 굶주렸는지, 짝짓기를 했는지와 같은 생리적 상태를 확인하고 조정하는 것이 중요합니다. 이 연구에서는 피를 먹고 짝짓기를 한 모기에서 후각 부속물을 채취했습니다. - CCD 완충액의 모기머리를 히트 블록 상에서 37°C로 5분 동안 예열한 후 모기두가 들어있는 튜브를 교잡 오븐으로 옮기고 37°C에서 회전시킵니다. 암컷 Anopheles 더듬이의 경우 20분, 수컷 더듬이의 경우 15분이 필요하며 상악 손바닥의 경우 더 긴 잠복기(1시간)가 필요합니다.
- 튜브의 전체 내용물을 해부 시계 유리에 옮깁니다. 시계(해부) 유리의 움푹 들어간 곳에 샘플을 부드럽게 붓습니다. 모기 머리가 튜브 안에 끼인 경우 피펫을 사용하여 CCD 버퍼를 튜브에 추가하고 머리를 헹굽니다.
- 겸자를 사용하여 배양 중에 분리된 머리 또는 더듬이/손바닥을 조심스럽게 옮기고 사전 고정제 1mL에 고정합니다.
알림: 남은 CCD 버퍼는 -20°C에서 보존할 수 있으며 버퍼는 최대 3배까지 재사용할 수 있습니다. 조직에 의한 CCD 완충액 캐리오버로 인해 사전 고정제가 약간 갈색으로 변하면 다른 1mL의 고정제로 교체합니다. - 너트를 사용하여 24°C에서 4시간 동안 사전 고정제에서 헤드를 회전합니다.
참고: 이 연구에 사용된 너트의 흔들림 속도는 조정할 수 없었습니다. 제조업체에서 설정한 기본 속도(12rpm)가 사용되었습니다.
3. 조직 해부
- 얼음 위에서 0.1% PBS-Tween 1mL로 헤드를 4회(세척당 5분) 헹굽니다. 샘플 손실을 방지하려면 겔 로딩 팁에 부착된 피펫을 사용하여 액체를 제거하십시오.
알림: 두 번의 빠른 세탁 후 10분 동안 세탁하고 3.1단계 대신 마지막 빠른 세탁을 수행할 수 있습니다. - 튜브의 헤드를 해부 시계 유리로 옮깁니다. 시계 유리의 움푹 들어간 곳에 샘플을 부드럽게 붓습니다. 튜브 안에 끼인 모기 머리를 0.1% PBS-Tween으로 헹굽니다.
- 해부 현미경으로 날카로운 집게로 머리에서 관심 조직(더듬이/손바닥)을 제거합니다. 집게로 머리의 뒤쪽 부분을 잡고 베이스에서 다른 집게로 안테나를 잡습니다. RNAse-free 용매로 적신 종이로 집게를 청소하십시오. 동일한 과정을 사용하여 손바닥을 제거합니다.
- 더듬이와 손바닥을 겸자로 얼음 위에 놓인 빈 DNA/RNase-free 튜브에 옮깁니다. 서로 다른 조직 부분을 미리 라벨이 붙은 다른 튜브로 분리합니다.
- 메탄올(MeOH 80%)과 디메틸 설폭사이드(DMSO 20%)의 혼합물을 함유한 용매 400μL에서 실온에서 1시간 동안 조직을 탈수합니다.
알림: 너트 위에 조직을 놓을 필요가 없습니다. 실험실 벤치의 실온에서 튜브 랙에 놓아두십시오. 신선한 용매 혼합물을 사용하는 것이 좋습니다. 500μL 원액의 경우 400μL의 MeOH와 100μL의 DMSO를 혼합합니다. - 탈수 시약을 400μL의 절대(100%) 메탄올로 교체하고 -20°C에서 밤새 조직을 탈수합니다. 조직이 중력에 의해 가라앉도록 하고 피펫을 사용하여 액체를 제거합니다.
참고: 샘플은 장기간 탈수에 사용할 수 있으며 최대 4일 동안 신호 손실 없이 테스트되었습니다.
4. 조직 포스트 고정
- 얼음 위에서 10분 동안 등급이 매겨진 400μL MeOH/PBS-Tween의 4단계 시리즈로 조직에 수분을 보충합니다. 75% MeOH/25% PBS-트윈으로 시작해서 50% MeOH/50% PBS-트윈, 25% MeOH/75% PBS-트윈, 마지막으로 100% PBS-트윈 순으로 합니다.
알림: 작은 구멍이 있는 젤 로딩 팁을 사용하여 튜브에서 버퍼를 제거하여 조직이 손실되는 것을 방지할 수 있습니다. 완충액 제거는 해부 현미경으로 수행할 수 있습니다. - 실온에서 0.1% Tween-20(PBS-T)을 함유한 400μL의 인산염 완충 식염수로 10분 동안 세척합니다. 샘플을 너트 위에 올려 놓아 세척하십시오.
- 20μg/mL Proteinase-K 용액을 만들고 400μL의 Proteinase-K 용액에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 20mg/mL Proteinase-K 스톡(1000x 원액) 즉 2mL의 0.1% PBS-Tween에 2μL를 희석합니다. 남은 음식은 -20 ° C의 냉동실에 보관할 수 있습니다. - 0.1% PBS-트윈 400μL로 10분 동안 2번 세척하여 조직의 효소 분해를 중단합니다.
- 400μL의 사후 고정제를 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 400μL의 0.1% PBS-Tween으로 15분 동안 3회 세척합니다.
5. 프로브 하이브리드화
- 400μL의 프로브 교잡 완충액에서 조직을 5분 동안 배양합니다. 부드럽게 피펫팅하여 조직이 완충액에 완전히 잠기도록 합니다.
- 프로브 혼성화 완충액의 분취액을 30분 동안 37°C로 가열하여 다음 단계를 준비합니다.
- 완충액을 제거하고 37°C에서 30분 동안 400μL의 예열된 프로브 혼성화 완충액으로 예비-하이브리드화합니다.
- 8pM의 프로브를 추가하여 표적 화학 감각 수용체(IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a 또는 Orco)에 대한 프로브 용액을 만듭니다. 8 μL의 1 μM 프로브 스톡을 500 μL 예열 프로브 혼성화 버퍼에 추가합니다.
- 예열된 프로브 혼성화 버퍼를 제거하고 400μL의 가열된 프로브 용액으로 교체합니다.
- 인큐베이터 내부에 배치하고 상자 아래에 덮은 너트에서 37 ° C에서 2 박 동안 조직을 배양합니다.
6. 프로브 증폭
- 프로브 세척 버퍼를 37°C로 가열하고, 인큐베이터에서 너트를 추출하여 37°C에서 400μL의 프로브 세척 완충액으로 조직을 5x, 세척당 10분 헹구어 과잉 프로브 용액을 제거합니다.
참고: 6.4단계 준비가 시작될 수 있습니다. 6.4단계의 참고를 참조하십시오. - 실온에서 10% 트윈-20(SSCT)을 함유한 400μL의 5x 식염수-구연산나트륨 400μL를 사용하여 세척당 5분, 2회 세척합니다. ampliification buffer를 벤치 상단에서 실온으로 해동합니다.
- 400μL의 증폭 완충액으로 실온에서 10분 동안 배양하여 증폭을 위한 조직을 준비합니다. 증폭 완충액의 점도로 인해 조직이 완전히 잠기지 않을 수 있습니다. 조직 아래에 증폭 완충액을 부드럽게 피펫팅하고 완충액이 잠길 때까지 조직 위로 완충액을 배출하여 혼합합니다.
- 헤어핀 h1 18 pM과 헤어핀 h2 18 pM을 95°C에서 95μL 동안 가열하여 3μL 스톡을 90μL 가열하고 어두운 서랍에서 30분 동안 실온으로 냉각하여 별도로 준비합니다. 열 순환기에서 가열하는 동안 헤어핀의 증발을 방지하기 위해 PCR 튜브가 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오.
알림: 시간을 절약하기 위해 6.4단계의 4번째 세탁 단계에서 6.1단계를 시작할 수 있습니다. 머리핀은 교차 반응을 방지하기 위해 별도로 가열해야 합니다. 이 단계에서 헤어핀을 완충액으로 희석해서는 안 됩니다. 헤어핀은 프로브와 함께 프로브 제조업체에서 구입할 수 있습니다. - 6.3단계에서 추가된 증폭 버퍼를 100μL의 증폭 버퍼와 함께 가열된 헤어핀(6.4단계에서)을 포함하는 혼합물로 교체합니다. 일반적인 반응에는 6μL의 h1, 6μL의 h2 및 100μL의 증폭 완충액이 포함됩니다.
참고: 헤어핀 h1 및 h2는 실온으로 냉각한 후 100μL의 증폭 버퍼에 추가할 수 있습니다. 조직 샘플이 한 튜브에서 다른 튜브로 이동하는 것을 방지하기 위해, 단계 6.3의 증폭 버퍼를 제거하고 증폭 버퍼에 희석된 헤어핀 혼합물로 대체할 수 있습니다. - 하룻밤 동안 조직을 배양하고 너트 테이터의 기본 속도를 사용하여 실온의 어두운 곳에서 너트를 추출합니다.
7. 장착 조직 샘플
- 배양 조직에서 300μL의 5x SSCT(Tween-20에 희석된 염화나트륨-구연산나트륨)로 희석한 증폭 완충액을 사용합니다.
알림: 희석은 점도를 낮추는 데 도움이 되며 조직에서 증폭 버퍼를 더 쉽게 제거할 수 있습니다. Triton-X 100은 고정전 단계에, Tween-20은 세포막을 투과시키는 작용의 차이 때문에 고정전 단계에, Tween-20을 사용했습니다. - 실온에서 400μL의 5x SSCT로 티슈를 5배 세척합니다.
알림: 필요한 경우 장착할 준비가 될 때까지 조직을 4°C에서 임시로 보관하십시오. 이미징 전 2일을 초과하지 않았습니다. - 유리 슬라이드에 장착 용액 5방울을 만듭니다. 200μL 피펫 팁의 팁을 잘라 더 넓게 만들고 조직을 새 유리 슬라이드로 옮깁니다.
- 집게로 조직 샘플을 잡고 일련의 장착 용액 방울에 부드럽게 담그고 헹굽니다. 이 단계에서 조직이 깨지지 않도록 주의하십시오.
- 장착 용액으로 장착하고 커버슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉합니다. 컨포칼 현미경을 사용한 현장 조직 샘플 이미지.
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Representative Results
Anopheles 안테나에서 화학감각 유전자의 강력한 검출
모기 후각 조직에서 화학감각 수용체의 발현을 감지하기 위해 HCR FISH 방법(그림 1)의 민감도를 조사했습니다. 암컷 아노펠레스(Anopheles) 모기 안테나에서 이전에 보고된 RNA 전사체 데이터에 따라 다양한 IR을 표적으로 하는 프로브를 생성했습니다. 4개의 독립적인 더듬이 전사체 연구의 평균 전사체 값은 Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) 및 Ir7t (13 RPKM)가 공동 수용체 Ir25a (197 RPKM) 및 Ir76b (193 RPKM)5,11,12,13,14에 비해 안테나에 덜 풍부하다는 것을 보여주었습니다. Ir41t.1, Ir75d 및 Ir7t를 표적으로 하는 프로브를 생성했습니다. IR64a(31 RPKM)는 전사체 수준이 관심 대상 후보 유전자 중 가장 낮은 전사체 값보다 약 3배 더 풍부하다는 점을 감안할 때 표적화되었습니다. 여기서 주목해야 할 점은 전사체학 연구의 RPKM 값이 전체 안테나의 전사체에 대한 대량 측정을 나타낸다는 것입니다. 따라서 소수의 뉴런만 IR 유전자 전사체를 높게 발현할 수도 있고, IR 유전자가 많은 세포에서 낮게 발현될 수도 있습니다. 따라서 RPKM 값은 뉴런 내 IR의 존재 수준과 반드시 일치하지는 않을 수 있습니다. 또한 HCR 방법이 제공하는 신호 증폭으로 인해 형광 신호를 기반으로 신경 세포 전사체 수준을 정확하게 측정하기 위해 이 방법을 사용하는 것이 어려울 수도 있습니다. 최근 간행물에서는 이러한 개념에 대해 더 자세히 논의했습니다5. 데이터에 따르면 HCR WM-FISH는 그림 2와 같이 더듬이 조직에서 mRNA 전사체를 검출하는 데 매우 민감합니다.
화학감각 부속지에서 서로 다른 RNA 표적의 Multiplexed co-labeling
RNA 표적의 co-localization을 조사하기 위해 서로 다른 형광단에 접합된 프로브를 생성했습니다. 냄새 수용체 공동 수용체 유전자(Orco)와 가장 광범위하게 발현된 이온성 수용체 공동 수용체 유전자(Ir25a)의 전사체를 표적으로 하는 이중 현장 교잡은 안테나(그림 3A)와 상악 손바닥(그림 3B)의 세포 집단 하위 집합에서 이러한 뚜렷한 화학 감각 수용체 계열의 공동 국소화를 보여주었습니다. 또한 3개의 IR-코어 수용체 유전자(Ir8a, Ir25a 및 Ir76b)의 전사체에 대한 공동 국소화를 조사했습니다. 공동 국소화 패턴은 Ir76b 양성 세포가 Ir25a를 발현하는 반면, Ir8a 양성 세포는 Ir76b 및 Ir25a와 부분적으로 공동 국소화됨을 시사합니다(그림 4). IR-코어 수용체의 동시 발현 분석은 멀티플렉스 연구에 HCR WM-FISH를 사용하는 것의 견고성을 보여줍니다.
그림 1: in situ hybridization 연쇄 반응의 개략도. 이 방법은 검출과 증폭의 두 단계로 작동합니다. in situ hybridization 연쇄 반응을 위한 프로브 세트는 분할 개시제와 RNA 표적에 특이적인 핵산 서열을 포함합니다. 여러 쌍의 프로브 세트를 설계하여 RNA 표적의 여러 영역을 하이브리드화할 수 있습니다. 이는 감지 단계를 정의합니다. 증폭 단계에서는 형광단 표지 헤어핀(h1 및 h2)이 프로브 세트에 접합된 개시제에 특이적으로 결합해야 합니다. 결합 시, 형광단에 의해 표지된 RNA 신호는 형광단 표지 헤어핀의 반복적인 결합에 의해 증폭됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: IR 화학감각 유전자의 RNA 국소화. IR을 표적으로 하는 암컷 Anopheles coluzzii 안테나의 HCR WM-FISH. RNA 프로브에는 (A) IR41t.1, (B) IR75d, (C) IR7t 및 (D) IR64a가 포함됩니다. 흰색 점선 상자의 삽입물은 조직의 확대된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 더듬이와 상악 구개에 있는 화학감각 유전자의 이중 in situ co-localization. 암컷 Anopheles coluzzii 모기의 (A) 안테나와 (B) 상악구개에서 Ir25a(녹색) 및 Orco(자홍색)를 발현하는 세포의 공초점 Z-스택 이미지. 흰색 점선 상자의 삽입물은 조직의 확대된 이미지입니다. 눈금은 10μm입니다. 그림 3B는15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 여러 RNA 표적의 공간 공동 국소화 매핑. 모기 안테나에서 IR25a(자홍색), IR8a(녹색) 및 IR76b(파란색)의 세 가지 IR 코어 수용체의 공동 국소화 패턴을 보여주는 현장 이미지. 흰색 화살표는 3개의 IR 코어 수용체(IR25a, IR8a 및 IR76b)를 발현하는 세포를 가리킵니다. 스케일은 20μm입니다. 이 수치는5에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: in situ hybridization 연쇄 반응을 위한 시약. 하이브리드화 연쇄 반응 전체 장착 형광 in situ 하이브리드화를 수행하는 데 필요한 시약. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
3세대 혼성화 연쇄 반응(hybridization chain reaction, HCR)은 여러 RNA 표적을 시각화할 수 있는 감도와 견고성으로 주목할 만하다8. HCR WM-FISH는 초파리, 닭, 생쥐 및 제브라피쉬의 배아뿐만 아니라 선충류 및 제브라피시의 유충에도 성공적으로 사용되었습니다 10,16,17. 모기 더듬이와 상악 손바닥은 일반적으로 자가형광이 높고 프로브 침투가 약하기 쉬우며, 이는 기존의 전체 장착 in situ 방법을 수행할 때 특히 까다롭습니다. 이러한 단점은 HCR 프로토콜에 통합된 신호 증폭 단계에 의해 감소되어 신호 대 배경 비율을 개선하고 후각 화학 수용체 mRNA 전사체를 검출할 수 있습니다(그림 2). HCR 프로토콜 설계는 시작 프로브가 증폭 폴리머에 연결되어 낮은 신호로 RNA 표적을 이미징할 수 있도록 합니다. 다중화 설정에서는 서로 다른 직교 HCR 증폭기가 스펙트럼적으로 고유한 형광단에 연결되었습니다. 이 접근 방식은 인접 이미징 채널의 스펙트럼 블리드스루를 방지하는 데 매우 중요했습니다.
모기 부속지와 함께 사용하기 위해 HCR 방법을 최적화하기 위해 몇 가지 관찰을 수행했습니다. HCR 증폭기는 빛에 민감하며 항상 -20°C 냉동고의 상자에 보관해야 합니다. 경험에 비추어 볼 때, CCD 완충액, 단백질 분해효소 K에서 조직을 광범위하게 배양하거나 파라포름알데히드에 짧은 고정 시간을 사용하면 세척 단계에서 더듬이 또는 손바닥이 파손될 수 있습니다. 더듬이와 상악 손바닥도 파손되지 않도록 항상 베이스를 잡아야 합니다. 이 프로토콜을 적용하는 초기 단계에서는 일련의 완충액 교환(5단계 및 6단계) 동안 지속적으로 조직이 손실되었습니다. 이러한 손실을 최소화하기 위해, 실험 시작 시 조직의 수를 두 배로 늘리고, 현미경 하에서 세척 단계 및 완충액 교환을 수행하고, 0.5mm 이하의 겔 로딩 팁을 사용하여 조직에서 완충액을 제거했습니다.
HCR WM-FISH는 Anopheles gambiae 5,15 및 Aedes aegypti 4,18 모기 매개체의 말초 후각 부속지에서 성공적이었으며, 이 프로토콜은 다른 곤충 조직 부분이나 다른 동물에 맞게 최적화되고 적응될 수 있습니다. 제조업체가 설계한 원래 프로토콜은 CCD 완충액에 배양을 포함하지 않습니다. 이 단계는 키틴질 큐티클을 소화하고 투과시키기 위해 프로토콜에 통합되었습니다. 프로브 침투에 더 많은 시간을 할애하기 위해 프로브 세트의 배양 시간을 이틀 밤 동안 연장했으며, 이는 슬라이드의 일반 샘플에 적합한 16시간의 배양 시간을 권장하는 제조업체의 프로토콜을 수정한 것입니다. 다른 곤충 조직 부위에 대해 이 프로토콜을 최적화하려면 CCD 완충액의 배양 시간을 변경해야 합니다. 두꺼운 큐티클이 있는 말초 조직 부분은 배양 시간을 연장해야 할 수 있습니다. proteinase K의 농도는 동물의 다른 조직 또는 발달 단계에 대해 이 프로토콜을 적용하는 동안 실험적으로 조정되어야 합니다. 5mm보다 두꺼운 조직으로 작업할 때는 프로브 침투가 어려워집니다. 이러한 상황에서는 조직 동결 절개를 수행하거나 본 연구에서 설명한 프로토콜을 추가로 변경하기 위한 추가 노력이 필요합니다.
HCR WM-FISH는 잠재적으로 수천 개의 유전자를 동시에 이미징할 수 있는 공간 전사체학(spatial transcriptomics)에 비해 한 번에 몇 개의 유전자 표적만 동시에 시각화하는 것으로 제한되어있다 19. RNA 프로브의 상업적 합성은 비용이 많이 듭니다. 대안은 실험실에서 프로브와 증폭기를 생산하는 것이지만 이는 대부분의 그룹에서 어려울 수 있으며 노동 집약적이고 시간이 많이 소요됩니다. 이 프로토콜은 또한 전체 마운트 두께 샘플을 통한 RNA 프로브 침투에 의해 발생하는 어려움으로 인해 제한되며, 이는 프로토콜의 교체(예: 2단계 조직 준비) 또는 온전한 조직의 절편이 필요할 수 있습니다. 여기에 설명된 HCR WM-FISH 방법이 후각 부속기에서 RNA 전사체를 검출하지 못하는 경우, 유전자는 소수의 세포에서만 발현될 수 있으며 조직에 대한 광범위한 조사가 필요하거나, 전사되지 않거나, 이 방법의 검출 한계보다 낮은 수준에서 전사될 수 있습니다. 이러한 결과를 검증하기 위해 정량적 RT-PCR 또는 RNA 염기서열 분석을 수행할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Aedes aegypti 후각 부속기에 대한 현장 교잡 프로토콜을 공유해 주신 Margo Herre와 Leslie Vosshall 연구실에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 C.J.P.(NIAID R01Al137078), J.I.R.의 HHMI Hanna Gray 펠로우십, J.I.R.의 Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award, J.I.R.의 Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship의 지원을 받았습니다. 존스 홉킨스 말라리아 연구소(Johns Hopkins Malaria Research Institute)와 블룸버그 자선재단(Bloomberg Philanthropies)의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
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- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
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