Summary
Artiklen beskriver de metoder og reagenser, der er nødvendige for at udføre hybridiseringskædereaktion RNA helmonteret fluorescens in situ hybridisering (HCR, RNA, WM-FISH) for at afsløre indsigt i den rumlige og cellulære opløsning af kemosensoriske receptorgener i mygantennen og maksillær palp.
Abstract
Myg er effektive vektorer af dødelige sygdomme og kan navigere i deres kemiske miljø ved hjælp af kemosensoriske receptorer udtrykt i deres olfaktoriske vedhæng. At forstå, hvordan kemosensoriske receptorer er rumligt organiseret i de perifere olfaktoriske vedhæng, kan give indsigt i, hvordan lugt er kodet i myggens olfaktoriske system og informere nye måder at bekæmpe spredningen af mygbårne sygdomme på. Fremkomsten af tredje generations hybridiseringskædereaktion RNA helmonteret fluorescens in situ hybridisering (HCR RNA WM-FISH) muliggør rumlig kortlægning og samtidig ekspressionsprofilering af flere kemosensoriske gener. Her beskriver vi en trinvis tilgang til udførelse af HCR RNA WM-FISH på Anopheles mygantenne og maksillær palp. Vi undersøgte følsomheden af denne teknik ved at undersøge ekspressionsprofilen for ionotropiske olfaktoriske receptorer. Vi spurgte, om den beskrevne HCR WM-FISH-teknik var egnet til multipleksede undersøgelser ved at binde RNA-sonder til tre spektralt forskellige fluoroforer. Resultaterne viste, at HCR RNA WM-FISH er robust følsom over for samtidig at detektere flere kemosensoriske gener i antennen og maksillære palp olfaktoriske vedhæng. Yderligere undersøgelser vidner om HCR WM-FISH's egnethed til co-ekspression profilering af dobbelt og tredobbelt RNA-mål. Denne teknik, når den anvendes med modifikationer, kunne tilpasses til at lokalisere gener af interesse i olfaktoriske væv af andre insektarter eller i andre vedhæng.
Introduction
Mygvektorer som Anopheles gambiae er afhængige af et rigt repertoire af kemosensoriske gener udtrykt i deres perifere olfaktoriske vedhæng for at trives i en kompleks kemisk verden og identificere adfærdsmæssigt relevante lugte, der stammer fra menneskelige værter, detektere nektarkilder og lokalisere ovipositionssteder1. Mygantennen og den maksillære palp er beriget med kemosensoriske gener, der driver lugtdetektion i disse olfaktoriske vedhæng. Tre hovedklasser af ligand-gated ionkanaler driver lugtdetektion i mygs olfaktoriske vedhæng: lugtreceptorerne (OR'er), som fungerer med en obligatorisk lugtreceptor-co-receptor (Orco); de ionotropiske receptorer (IR'er), som interagerer med en eller flere IR-coreceptorer (IR8a, IR25a og IR76b); de kemosensoriske gustatoriske receptorer (GR'er), der fungerer som et kompleks af tre proteiner til påvisning af kuldioxid (CO2)1,2.
RNA-fluorescens in situ-hybridisering er et kraftfuldt værktøj til påvisning af ekspression af endogent mRNA3. Generelt anvender denne metode en fluoroformærket enkeltstrenget nukleinsyresonde med sekvens, der er komplementær til et mål-mRNA. Binding af den fluorescerende RNA-sonde til mål-RNA'et muliggør identifikation af celler, der udtrykker et transkript af interesse. Nylige fremskridt muliggør nu påvisning af transkripter i helmonteret mygvæv 4,5. Den første generation af hybridiseringskædereaktionsteknologi (HCR) anvendte en RNA-baseret HCR-forstærker; dette blev forbedret i en anden generations metode, der i stedet brugte konstrueret DNA til HCR-forstærkeren 6,7. Denne opgradering resulterede i en 10x stigning i signal, et dramatisk fald i produktionsomkostningerne og en betydelig forbedring af holdbarheden af reagenser 6,7.
I protokollen beskriver vi udnyttelsen af en tredje generations HCR helmonteret RNA fluorescens in situ hybridiseringsmetode (HCR RNA WM-FISH) metode designet til at detektere den rumlige lokalisering og ekspression af ethvert gen 8,9. Denne totrinsmetode anvender først nukleinsyreprober, der er specifikke for mRNA'et af interesse, men som også indeholder en initiatorgenkendelsessekvens; det andet trin bruger fluoroformærkede hårnåle, der binder til initiatorsekvensen for at forstærke det fluorescerende signal (figur 1). Denne metode giver også mulighed for multiplexing af to eller flere RNA-sonder og forstærkning af sondesignaler for at lette RNA-detektion og kvantificering8. Visualisering af transkriptionsoverflod og RNA-lokaliseringsmønstre af kemosensoriske gener udtrykt i de olfaktoriske vedhæng giver den første linje af indsigt i kemosensoriske genfunktioner og lugtkodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Overvejelser og forberedelse af materialer
- Beslut, om helmonteret eller kryo-sektion af væv vil være passende. Denne protokol er optimeret til helmonteret in situ-billeddannelse af RNA i Anopheles-myggeantennen og maksillær palp uden kryosektionering. Hvis prøverne er tykkere end 5 mm, anbefales kryosnit for at muliggøre sondeindtrængning.
- Identificer generne af interesse og kopier sekvenserne, herunder introner og exoner fra en passende database. Transskribere gensekvensen til RNA til syntese.
- Bestem, om du skal købe sonder fra kommercielle leverandører, eller om sonder vil blive syntetiseret i laboratoriet.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev in situ-sonderne købt fra en kommerciel leverandør (se materialetabel). Alternativt kan det syntetiseres som tidligere rapporteret10. Reagenser, der er anvendt i undersøgelsen, er beskrevet i tabel 1. Materialer, der kræves til fremstilling af reagenserne, er anført i materialetabellen.
2. Vævspræfiksering
- Bedøv 10-15 voksne kvindelige eller mandlige Anopheles coluzzii myg (stamme N'Gousso), i alderen 5-10 dage efter fremkomst, ved at samle dem med en mundaspirator i en papirkop eller plastrør og placere dem i en spand indeholdende is. En vellykket koldinduceret anæstesi kan bekræftes, når myggene er immobile.
- Halshug dem ved at fjerne hovederne fra nakkeområdet med et par tang. Brug den ikke-dominerende hånd til at tage fat i brystkassen med tang og adskille halsen fra kroppen med tang, der holdes af den dominerende hånd. Hovederne anbringes i et 1,5 ml rør indeholdende 500 μL chitinase-chymotrypsindimethylsulfoxidbuffer (CCD-buffer) på is.
BEMÆRK: Frysedyr kan deformere antennerne; En hurtig knockdown på is anbefales. Myggens alder under testning kan variere afhængigt af projektet. Det er vigtigt at bekræfte og koordinere deres fysiologiske status, såsom om de er blodfodret, sultet eller parret. I denne undersøgelse blev olfaktoriske vedhæng udtaget fra myg, der var blevet blodfodret og parret. - Forvarm myggehoveder i CCD-buffer ved 37 ° C på en varmeblok i 5 minutter, og overfør derefter røret indeholdende myggehovederne til en hybridiseringsovn og drej ved 37 ° C. Inkubationstid i CCD-buffer afhænger af vævstype. For kvindelige Anopheles-antenner skal du bruge 20 minutter, hanantenner kræver 15 minutter, mens længere inkubationstid (1 time) er nødvendig for de maksillære palper.
- Overfør hele indholdet af røret til et dissekerende urglas. Hæld forsigtigt prøven i fordybningen af et ur (dissektion) glas. Hvis myggehoveder sidder fast inde i røret, skal du bruge en pipette til at tilføje CCD-buffer i røret og skylle hovedet ud.
- Brug pincet til forsigtigt at overføre hovederne eller eventuelle antenner / palper, der løsnes under inkubation, og fastgør i 1 ml af præfikseringsmidlet.
BEMÆRK: Resterende CCD-buffer kan bevares ved -20 ° C. Buffer kan genbruges op til 3x. Hvis præfikseringsmidlet bliver lidt brunligt på grund af vævets CCD-bufferoverførsel, skal du udskifte det med yderligere 1 ml fikseringsmiddel. - Drej hovederne i præfikseringsmiddel i 24 timer ved 4 °C ved hjælp af en møtrik.
BEMÆRK: Rokkehastigheden for møtrikatoren, der blev brugt i denne undersøgelse, var ikke-justerbar; Standardhastighedsindstillingen (12 o / min) af producenten blev brugt.
3. Dissektion af væv
- Skyllehoveder 4x (5 min pr. vask) med 1 ml 0,1% PBS-Tween på is. For at undgå tab af prøver skal du bruge en pipette, der er fastgjort til gelpåfyldningsspidsen, for at fjerne væsken.
BEMÆRK: To hurtigvaske efterfulgt af en 10 minutters lang vask, og en sidste hurtigvask kunne udføres i stedet for trin 3.1. - Overfør hovederne i røret til et dissekerende urglas. Hæld forsigtigt prøven i fordybningen af et urglas. Skyl myggehoveder, der sidder fast inde i røret med 0,1% PBS-Tween.
- Under et dissekerende mikroskop skal du fjerne væv af interesse (antenner / palps) fra hovedet med skarpe tang. Hold den bageste del af hovedet med tang og tag en antenne med en anden tang fra bunden. Rens pincet med papir fugtet med RNAse-fri opløsningsmiddel. Fjern palperne ved hjælp af den samme proces.
- Overfør antennerne og palperne med pincet til tomme DNA/RNase-frie rør placeret på is. Adskil de forskellige vævsdele i forudmærkede forskellige rør.
- Dehydreret væv i 400 μL opløsningsmiddel indeholdende en blanding af methanol (MeOH 80%) og dimethylsulfoxid (DMSO 20%) i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at placere væv på en møtrik; Lad det sidde på et rørstativ ved stuetemperatur på laboratoriebænken. Det anbefales at anvende frisk opløsningsmiddelblanding. For en 500 μL stamopløsning blandes 400 μL MeOH med 100 μL DMSO. - Det dehydrerende reagens erstattes med 400 μL absolut (100 %) methanol, og vævet dehydreres natten over ved -20 °C. Lad væv sætte sig ved tyngdekraften og brug en pipette til at fjerne væsken.
BEMÆRK: Prøver er levedygtige i længere tid med dehydrering, op til 4 nætter er blevet testet uden tab af signal.
4. Væv efter fiksering
- Rehydrer væv i en firetrinsserie af klassificeret 400 μL MeOH / PBS-Tween i 10 minutter på is. Start med 75% MeOH/25% PBS-Tween efterfulgt af 50% MeOH/ 50% PBS-Tween, derefter 25% MeOH/ 75% PBS-Tween og endelig 100% PBS-Tween.
BEMÆRK: En gelpåfyldningsspids med en lille åbning kan bruges til at fjerne bufferen fra røret for at undgå at miste vævene. Bufferfjernelse kan udføres under et dissekerende mikroskop. - Vask med 400 μL fosfatbufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 (PBS-T) i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask ved at placere prøven på en møtrik.
- Der laves en 20 μg/ml proteinase-K-opløsning og inkuberes i 400 μL proteinase-K-opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Fortynd 20 mg/ml proteinase-K-stamme (1000x stamopløsning), dvs. 2 μL i 2 ml 0,1% PBS-Tween. Den resterende kan opbevares i en -20 ° C fryser. - Stop enzymatisk fordøjelse af væv ved at vaske 2x i 10 min med 400 μL 0,1% PBS-tween.
- Der tilsættes 400 μL postfikseringsmiddel og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Vask 3x, 15 min pr. vask, med 400 μL 0,1% PBS-Tween.
5. Sonde hybridisering
- Inkuber væv i 400 μL sondehybridiseringsbuffer i 5 min. Sørg for, at vævet er helt nedsænket i bufferen ved forsigtigt pipettering.
- Forbered dig på det næste trin ved at opvarme en alikvot sondehybridiseringsbuffer til 37 ° C i 30 minutter.
- Fjern buffer og forhybridiser med 400 μL forvarmet sondehybridiseringsbuffer i 30 minutter ved 37 ° C.
- Lav sondeopløsning til målkemosensoriske receptorer (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a eller Orco) ved at tilføje 8 pM sonde. Der tilsættes 8 μL 1 μM sondestamme til 500 μL forvarmet sondehybridiseringsbuffer.
- Fjern den forvarmede sondehybridiseringsbuffer, og udskift den med 400 μL opvarmet sondeopløsning.
- Inkuber væv ved 37 ° C i to nætter på en nutator placeret inde i en inkubator og dækket under en kasse.
6. Sondeforstærkning
- Sondevaskebufferen opvarmes til 37 °C. Overskydende sondeopløsning fjernes ved at skylle vævet 5x, 10 min pr. vask, med 400 μL sondevaskebuffer ved 37 ° C, nutating i inkubatoren.
BEMÆRK: Forberedelsen til trin 6.4 kan begynde. Se bemærkningen i trin 6.4. - Vaskeprøver 2x, 5 min pr. vask, med 400 μL 5x saltvand-natriumcitrat indeholdende 10% Tween-20 (SSCT) ved stuetemperatur. Optø forstærkningsbuffer til stuetemperatur på en bordplade.
- Forbered væv til amplifikation ved inkubation med 400 μL amplifikationsbuffer i 10 minutter ved stuetemperatur. På grund af amplifikationsbufferens viskositet er væv muligvis ikke helt nedsænket. Bland ved forsigtigt at pipettere amplifikationsbufferen under vævet og udstøde bufferen oven på vævet, indtil de er nedsænket.
- Forbered 18 pM hårnål h1 og 18 pM hårnål h2 separat ved at opvarme 6 μL 3 μM lager ved 95 °C i 90 s og afkøle til stuetemperatur i en mørk skuffe i 30 minutter. Sørg for, at PCR-rør er tæt dækket for at forhindre fordampning af hårnålene under opvarmning i en termisk cyklist.
BEMÆRK: For at spare tid kan trin 6.4 startes, mens du er på det 4. vasketrin i trin 6.1. Hårnåle skal opvarmes separat for at forhindre krydsreaktion. Hårnåle bør ikke fortyndes med nogen buffer i dette trin. Hårnålene kan købes hos sondeproducenten sammen med sonderne. - Forstærkningsbufferen tilsat i trin 6.3 erstattes med en blanding indeholdende de opvarmede hårnåle (fra trin 6.4) sammen med 100 μL forstærkningsbuffer. En typisk reaktion vil indeholde 6 μL h1, 6 μL h2 og 100 μL amplifikationsbuffer.
BEMÆRK: Hårnålene h1 og h2 kan kombineres efter afkøling til stuetemperatur og derefter tilsættes til 100 μL forstærkningsbuffer. For at undgå at overføre vævsprøverne fra et rør til et andet kan amplifikationsbufferen i trin 6.3 fjernes og erstattes af hårnåleblandingen fortyndet i amplifikationsbuffer. - Inkuber væv natten over og nutate i mørke ved stuetemperatur ved hjælp af møtrikatorens standardhastighed.
7. Montering af vævsprøve
- Fortyndet amplifikationsbuffer i det inkuberede væv med 300 μL 5x SSCT (natriumchlorid-natriumcitrat fortyndet i Tween-20).
BEMÆRK: Fortyndingen er nyttig til at reducere viskositeten og gør det lettere at fjerne amplifikationsbufferen fra vævet. Vi brugte Triton-X 100 til præfiksativet og Tween-20 til postfikseringstrinnet på grund af forskellene i deres handlinger som midler til permeabilisering af cellemembran. - Væv vaskes 5x med 400 μL 5x SSCT ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Opbevar væv midlertidigt ved 4 °C, indtil det er klar til montering, hvis det er nødvendigt. Vi har ikke overskredet 2 dage før billeddannelse. - Lav 5 dråber monteringsopløsning på et glasglas. Skær spidsen af en 200 μL pipettespids for at gøre den bredere og overføre vævet til et nyt glasglas.
- Tag vævsprøverne ved deres base med tang og nedsænk forsigtigt og skyl i en række monteringsopløsningsdråber. Pas på ikke at bryde vævene i dette trin.
- Monter med monteringsopløsning, læg dæksel, og forsegl med neglelak. Billede in situ vævsprøver ved hjælp af et konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Robust påvisning af kemosensoriske gener i Anopheles-antennen
Vi undersøgte følsomheden af HCR FISH-metoden (figur 1) til at detektere ekspressionen af kemosensoriske receptorer i myggeolfaktorisk væv. Vejledt af RNA-transkriptionsdata, der tidligere blev rapporteret om den kvindelige Anopheles-mygantenne, genererede vi sonder til at målrette mod en række IR'er. De gennemsnitlige transkriptionsværdier fra fire uafhængige antennetranskriptomundersøgelser afslørede, at Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) og Ir7t (13 RPKM) var mindre rigelige i antennen sammenlignet med co-receptorer Ir25a (197 RPKM) og Ir76b (193 RPKM) 5,11,12,13,14. Vi genererede sonder for at målrette mod Ir41t.1, Ir75d og Ir7t. IR64a (31 RPKM) blev også målrettet, da dets transkriptionsniveau er ca. 3x mere rigeligt end den laveste transkriptionsværdi blandt kandidatgenerne af interesse. Det skal her bemærkes, at RPKM-værdier fra transkriptomiske undersøgelser repræsenterer en bulkmåling af transkripter fra hele antennen. Som sådan kan det være, at kun få neuroner stærkt udtrykker et IR-gentranskript, eller det kan være, at et IR-gen udtrykkes lavt på tværs af mange celler. RPKM-værdier svarer derfor ikke nødvendigvis til tæthedsniveauet for en IR i en neuron. Derudover kan signalforstærkningen, der ydes af HCR-metoden, også gøre det vanskeligt at bruge denne metode til nøjagtigt at måle neuronale transkriptionsniveauer baseret på fluorescerende signaler. Vores seneste publikation diskuterede disse begreber mere detaljeret5. Data tyder på, at HCR WM-FISH er meget følsom over for detektering af mRNA-transkripter fra antennevæv som vist i figur 2.
Multiplexed co-mærkning af forskellige RNA-mål i kemosensoriske vedhæng
For at undersøge co-lokaliseringen af RNA-mål genererede vi sonder konjugeret til forskellige fluoroforer. Dobbelt in situ-hybridisering rettet mod transkripter af lugtreceptor-co-receptorgenet (Orco) og det mest bredt udtrykte ionotropiske receptor-co-receptorgen (Ir25a) afslørede colokalisering af disse forskellige kemosensoriske receptorfamilier i en delmængde af cellepopulationer i antennen (figur 3A) og maksillær palp (figur 3B). Vi undersøgte også colokalisering af transkripter af tre IR-coreceptorgener (Ir8a, Ir25a og Ir76b). Colokaliseringsmønstre tyder på, at Ir76b-positive celler udtrykker Ir25a, mens Ir8a-positive celler delvist co-lokaliserer med Ir76b og Ir25a (figur 4). Co-ekspressionsanalysen af IR-coreceptorerne viser robustheden af at bruge HCR WM-FISH til multipleksede undersøgelser.
Figur 1: Skematisk oversigt over in situ-hybridiseringskædereaktionen . Denne metode fungerer i to trin: detektion og forstærkning. En sondesæt til in situ-hybridiseringskædereaktion omfatter en splitinitiator og en nukleinsyresekvens, der er specifik for RNA-målet. Flere par sondesæt kan designes til at hybridisere flere regioner i RNA-målet; Dette definerer registreringstrinnet. Forstærkningstrinnet kræver, at fluoroformærkede hårnåle (h1 og h2) binder specifikt til initiatoren konjugeret til et sondesæt. Ved binding forstærkes RNA-signalet mærket af fluoroforen ved gentagen binding af fluoroformærkede hårnåle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: RNA-lokalisering af IR-kemosensoriske gener. HCR WM-FISH af kvindelige Anopheles coluzzii antenner til at målrette IRs. RNA-sonder inkluderer (A) IR41t.1, (B) IR75d, (C) IR7t og (D) IR64a. Indsatserne i hvide stiplede felter er forstørrede billeder fra vævet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dobbelt in situ co-lokalisering af kemosensoriske gener i antennen og maxillær palp. Konfokale Z-stack billeder af celler, der udtrykker Ir25a (grøn) og Orco (magenta) i (A) antennen og (B) maksillær palp af kvindelige Anopheles coluzzii myg. Indsatserne i hvide stiplede felter er forstørrede billeder fra vævet. Skalaen er 10 μm. Figur 3B er ændret fra15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kortlægning af den rumlige colokalisering af flere RNA-mål. In situ-billeder , der viser colokaliseringsmønstre af tre IR-coreceptorer, IR25a (magenta), IR8a (grøn) og IR76b (blå) i mygantennen. Hvide pile peger på celler, der udtrykker de tre IR-coreceptorer (IR25a, IR8a og IR76b). Skalaen er 20 μm. Dette tal er ændret fra5. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Reagenser til in situ hybridiseringskædereaktion. Reagenser, der er nødvendige for at udføre hybridiseringskædereaktion helmonteret fluorescerende in situ-hybridisering . Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tredje generation af hybridiseringskædereaktion (HCR) er bemærkelsesværdig for sin følsomhed og robusthed til at visualisere flere RNA-mål8. HCR WM-FISH er med succes blevet brugt på embryoner af Drosophila, kylling, mus og zebrafisk samt larver af nematoder og zebrafisk 10,16,17. Myggeantenner og maksillære palper er typisk tilbøjelige til høj autofluorescens og svag sondepenetration, hvilket er særligt udfordrende ved udførelse af traditionelle helmonterede in situ-metoder. Disse ulemper er blevet formindsket af signalforstærkningstrinnet integreret i HCR-protokollen, hvilket forbedrer signal-til-baggrundsforholdet og muliggør påvisning af olfaktoriske kemoreceptor-mRNA-transkripter (figur 2). HCR-protokoldesignet sikrer, at de initierende sonder er bundet til amplifikationspolymererne, hvilket muliggør billeddannelse af RNA-mål med lavt signal. I den multipleksede opsætning blev forskellige ortogonale HCR-forstærkere tøjret til spektralt unikke fluoroforer. Denne tilgang var afgørende for at undgå spektral gennemblødning fra en nærliggende billeddannelseskanal.
For at optimere HCR-metoden til brug med mygvedhæng lavede vi flere observationer. HCR-forstærkerne er lysfølsomme og bør altid opbevares i en kasse i en -20 °C fryser. Det er vores erfaring, at omfattende inkubation af væv i CCD-buffer, proteinase K eller kort fikseringstid i paraformaldehyd kan resultere i brud på antenner eller palper under vasketrinnene. Antenner og maksillære palper skal også altid gribes af basen for at undgå brud. I den tidlige fase af tilpasningen af denne protokol mistede vi konsekvent væv under rækken af bufferudvekslinger (trin 5 og 6). For at minimere sådanne tab blev antallet af væv fordoblet i starten af eksperimentet, vasketrin og bufferudvekslinger blev udført under mikroskopet, og gelbelastningsspidser ikke bredere end 0,5 mm blev brugt til at fjerne bufferne fra vævene.
HCR WM-FISH har haft succes i perifere olfaktoriske vedhæng af Anopheles gambiae 5,15 og Aedes aegypti 4,18 myggevektorer, og protokollen kunne yderligere optimeres og tilpasses andre insektvævsdele eller forskellige dyr. Den originale protokol, der er designet af producenten, inkorporerer ikke inkubation i CCD-buffer. Dette trin blev integreret i protokollen for at fordøje og permeabilisere den chitinøse neglebånd. Vi forlængede inkubationstiden i sondesættene med to nætter for at give mere tid til sondeindtrængning, en ændring af producentens protokol, der anbefaler en 16 timers inkubationstid, der fungerer godt for generiske prøver på et dias. Optimering af denne protokol for andre insektvævsdele ville kræve variation af inkubationstiden i CCD-bufferen; Perifere vævsdele med tykke neglebånd vil sandsynligvis kræve forlænget inkubationstid. Koncentrationen af proteinase K skal også justeres eksperimentelt, samtidig med at denne protokol tilpasses til forskellige vævs- eller udviklingsstadier hos dyr. Når man arbejder med væv, der er tykkere end 5 mm, bliver sondeindtrængning en udfordring. I en sådan situation er der behov for yderligere indsats for at udføre vævskryosektion eller yderligere ændre protokollen beskrevet i denne undersøgelse.
HCR WM-FISH er begrænset til samtidig visualisering af kun få genmål ad gangen sammenlignet med rumlig transkriptomik, som potentielt kan muliggøre samtidig billeddannelse af tusindvis af gener19. Kommerciel syntese af RNA-sonder er dyr; Alternativet ville være at producere sonder og forstærkere i laboratoriet, men dette kan være udfordrende for de fleste grupper og er arbejdskrævende og tidskrævende. Denne protokol er også begrænset af vanskeligheder, der opstår ved RNA-sondepenetration gennem helmonterede tykke prøver, hvilket kan kræve ændringer i protokollen (f.eks. Trin 2-vævsforberedelse) eller sektionering af det intakte væv. Hvis HCR WM-FISH-metoden, der er beskrevet her, ikke detekterer et RNA-transkript i et olfaktorisk vedhæng, kan genet kun udtrykkes i nogle få celler og kræve omfattende undersøgelse af vævet, muligvis ikke transskriberes eller transskriberes på et niveau under detektionsgrænsen for denne metode. Kvantitativ RT-PCR eller RNA seq kunne udføres for at validere sådanne fund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Margo Herre og Leslie Vosshall-laboratoriet for at dele deres in-situ hybridiseringsprotokol for Aedes aegypti olfaktoriske vedhæng. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health til C.J.P. (NIAID R01Al137078), et HHMI Hanna Gray-stipendium til JIR, en Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award til JIR og et Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoc-stipendium til JIR Vi takker Johns Hopkins Malaria Research Institute og Bloomberg Philanthropies for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al.
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al.
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
