Summary
Het artikel beschrijft de methoden en reagentia die nodig zijn om hybridisatiekettingreactie-RNA, whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie (HCR, RNA, WM-FISH) uit te voeren om inzicht te krijgen in de ruimtelijke en cellulaire resolutie van chemosensorische receptorgenen in de muggenantenne en maxillaire palp.
Abstract
Muggen zijn effectieve vectoren van dodelijke ziekten en kunnen door hun chemische omgeving navigeren met behulp van chemosensorische receptoren die tot expressie komen in hun reukaanhangsels. Inzicht in hoe chemosensorische receptoren ruimtelijk zijn georganiseerd in de perifere olfactorische aanhangsels kan inzicht bieden in hoe geur wordt gecodeerd in het olfactorische systeem van muggen en nieuwe manieren bieden om de verspreiding van door muggen overgedragen ziekten tegen te gaan. De opkomst van hybridisatiekettingreactie-RNA van de derde generatie fluorescentie in situ hybridisatie (HCR, RNA, WM-FISH) maakt ruimtelijke mapping en gelijktijdige expressieprofilering van meerdere chemosensorische genen mogelijk. Hier beschrijven we een stapsgewijze aanpak voor het uitvoeren van HCR RNA WM-FISH op de Anopheles muggenantenne en maxillaire palp. We onderzochten de gevoeligheid van deze techniek door het expressieprofiel van ionotrope olfactorische receptoren te onderzoeken. We vroegen of de beschreven HCR WM-FISH-techniek geschikt was voor multiplexstudies door RNA-sondes aan drie spectraal verschillende fluoroforen te binden. De resultaten leverden bewijs dat HCR RNA WM-FISH robuust gevoelig is om tegelijkertijd meerdere chemosensorische genen in de antenne en maxillaire palp olfactorische aanhangsels te detecteren. Nader onderzoek bevestigt de geschiktheid van HCR WM-FISH voor co-expressieprofilering van dubbele en drievoudige RNA-targets. Deze techniek zou, wanneer toegepast met modificaties, kunnen worden aangepast om genen van belang te lokaliseren in de reukweefsels van andere insectensoorten of in andere aanhangsels.
Introduction
Muggenvectoren zoals Anopheles gambiae vertrouwen op een rijk repertoire van chemosensorische genen die tot expressie komen in hun perifere olfactorische aanhangsels om te gedijen in een complexe chemische wereld en gedragsrelevante geuren te identificeren die afkomstig zijn van menselijke gastheren, nectarbronnen te detecteren en ovipositieplaatsen te lokaliseren1. De muggenantenne en de maxillaire palp zijn verrijkt met chemosensorische genen die geurdetectie in deze reukaanhangsels stimuleren. Drie hoofdklassen van ligand-gated ionkanalen zorgen voor geurdetectie in de reukaanhangsels van muggen: de Odorant-receptoren (OR's), die functioneren met een obligate Odorant-receptor-co-receptor (Orco); de ionotrope receptoren (IR's), die interageren met een of meer IR-coreceptoren (IR8a, IR25a en IR76b); de chemosensorische smaakreceptoren (GR's), die functioneren als een complex van drie eiwitten om kooldioxide (CO2) te detecteren1,2.
RNA-fluorescentie in situ hybridisatie is een krachtig hulpmiddel voor het detecteren van de expressie van endogeen mRNA3. Over het algemeen maakt deze methode gebruik van een met fluorofoor gelabelde enkelstrengs nucleïnezuursonde met een sequentie die complementair is aan een doel-mRNA. Binding van de fluorescerende RNA-sonde aan het doel-RNA maakt identificatie mogelijk van cellen die een interessant transcript tot expressie brengen. Recente ontwikkelingen maken nu de detectie van transcripten in muggenweefsels met hele montage mogelijk 4,5. De eerste generatie hybridisatiekettingreactie (HCR)-technologie maakte gebruik van een op RNA gebaseerde HCR-versterker; dit werd verbeterd in een methode van de tweede generatie die in plaats daarvan gemanipuleerd DNA gebruikte voor de HCR-versterker 6,7. Deze upgrade resulteerde in een 10x toename van het signaal, een dramatische verlaging van de productiekosten en een aanzienlijke verbetering van de duurzaamheid van reagentia 6,7.
In het protocol beschrijven we het gebruik van een derde generatie HCR whole-mount RNA fluorescentie in situ hybridisatie (HCR RNA WM-FISH) methode ontworpen voor het detecteren van de ruimtelijke lokalisatie en expressie van elk gen 8,9. Deze tweestapsmethode maakt eerst gebruik van nucleïnezuursondes die specifiek zijn voor het mRNA van belang, maar die ook een initiatorherkenningssequentie bevatten; de tweede stap maakt gebruik van fluorofoor-gelabelde haarspelden die binden aan de initiatorsequentie om het fluorescerende signaal te versterken (Figuur 1). Deze methode maakt het ook mogelijk om twee of meer RNA-sondes te multiplexen en sondesignalen te versterken om RNA-detectie en -kwantificering te vergemakkelijken8. Het visualiseren van de transcriptie-abundantie en RNA-lokalisatiepatronen van chemosensorische genen die tot expressie komen in de olfactorische aanhangsels biedt de eerste lijn van inzicht in chemosensorische genfuncties en geurcodering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Overwegingen en voorbereiding van materialen
- Beslis of een hele montage of cryo-sectie van weefsel geschikt is. Dit protocol is geoptimaliseerd voor volledige montage in situ beeldvorming van RNA in de Anopheles-muggenantenne en maxillaire palp zonder cryo-sectie. Als de monsters dikker zijn dan 5 mm, wordt cryo-secties aanbevolen om sondepenetratie mogelijk te maken.
- Identificeer de genen die van belang zijn en kopieer de sequenties, inclusief introns en exonen, uit een geschikte database. Transcribeer de gensequentie in RNA voor synthese.
- Bepaal of u sondes van commerciële leveranciers wilt kopen of dat sondes in het laboratorium worden gesynthetiseerd.
OPMERKING: In dit onderzoek werden de in situ sondes gekocht bij een commerciële leverancier (zie Materiaaltabel). Als alternatief kan het worden gesynthetiseerd zoals eerder gemeld10. De in het onderzoek gebruikte reagentia worden beschreven in tabel 1. De materialen die nodig zijn voor de bereiding van de reagentia staan vermeld in de materiaaltabel.
2. Pre-fixatie van weefsel
- Verdoof 10-15 volwassen vrouwelijke of mannelijke Anopheles coluzzii-muggen (stam N'Gousso), 5-10 dagen na opkomst oud, door ze met een mondaspirator in een papieren beker of plastic buis te verzamelen en ze in een emmer met ijs te plaatsen. Een succesvolle koude-geïnduceerde anesthesie kan worden bevestigd wanneer de muggen immobiel zijn.
- Onthoofd ze door de hoofden met een pincet uit de nek te verwijderen. Gebruik de niet-dominante hand om de thorax met een tang vast te pakken en de nek van het lichaam te scheiden met een pincet die door de dominante hand wordt vastgehouden. Plaats de koppen in een buisje van 1,5 ml met 500 μl chitinase-chymotrypsinedimethylsulfoxidebuffer (CCD-buffer) op ijs.
NOTITIE: Bevriezing van dieren kan de antennes vervormen; Een snelle knockdown op ijs wordt aanbevolen. De leeftijd van de mug tijdens het testen kan variëren, afhankelijk van het project. Het is belangrijk om hun fysiologische status te bevestigen en te coördineren, bijvoorbeeld of ze bloed hebben gekregen, uitgehongerd of gedekt zijn. In deze studie werden olfactorische aanhangsels bemonsterd van muggen die met bloed waren gevoed en gepaard. - Verwarm muggenkoppen voor in CCD-buffer bij 37 ° C op een warmteblok gedurende 5 minuten en breng vervolgens de buis met de muggenkoppen over naar een hybridisatieoven en draai op 37 ° C. Incubatietijd in CCD-buffer is afhankelijk van het weefseltype. Gebruik voor vrouwelijke Anopheles-antennes 20 minuten, mannelijke antennes hebben 15 minuten nodig, terwijl een langere incubatietijd (1 uur) nodig is voor de maxillaire palpen.
- Breng de volledige inhoud van de buis over in een ontleed horlogeglas. Giet het monster voorzichtig in de holte van een horloge (dissectie) glas. Als muggenkoppen vastzitten in de buis, gebruik dan een pipet om CCD-buffer in de buis toe te voegen en spoel de kop uit.
- Gebruik een pincet om de koppen of eventuele antennes/palpen die tijdens de incubatie zijn losgeraakt voorzichtig over te brengen en fixeer in 1 ml van het prefixeermiddel.
LET OP: Overgebleven CCD-buffer kan worden bewaard bij -20 ° C. Buffer kan tot 3x worden hergebruikt. Als het prefixeermiddel enigszins bruinachtig wordt vanwege de overdracht van de CCD-buffer door de weefsels, vervang het dan door nog eens 1 ml fixeermiddel. - Draai de koppen in het voorfixeermiddel gedurende 24 uur bij 4° C met behulp van een nutator.
OPMERKING: De schommelsnelheid voor de nutator die in dit onderzoek werd gebruikt, was niet instelbaar; Het door de fabrikant ingestelde standaardtoerental (12 rpm) werd gebruikt.
3. Weefseldissectie
- Spoel de koppen 4x (5 min per wasbeurt) met 1 ml 0,1% PBS-Tween op ijs. Om monsterverlies te voorkomen, gebruikt u een pipet die aan de gellaadtip is bevestigd om de vloeistof te verwijderen.
OPMERKING: Twee snelle wasbeurten gevolgd door een lange wasbeurt van 10 minuten en een laatste snelle wasbeurt kunnen worden uitgevoerd in plaats van stap 3.1. - Breng de koppen in de buis over in een ontleedhorlogeglas. Giet het monster voorzichtig in de holte van een horlogeglas. Spoel muggenkoppen die vastzitten in de buis uit met 0.1% PBS-Tween.
- Verwijder onder een ontleedmicroscoop interessante weefsels (antennes/palpen) van het hoofd met een scherpe pincet. Houd het achterste deel van het hoofd vast met een tang en pak een antenne met een andere pincet van de basis. Reinig de pincet met papier dat is bevochtigd met RNAse-vrij oplosmiddel. Verwijder de palpen met hetzelfde proces.
- Breng de antennes en palpen met een pincet over in lege DNA/RNase-vrije buisjes die op ijs zijn geplaatst. Scheid de verschillende weefseldelen in vooraf gelabelde verschillende buisjes.
- Dehydrateer weefsel in 400 μL oplosmiddel met een mengsel van methanol (MeOH 80%) en dimethylsulfoxide (DMSO 20%) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het is niet nodig om weefsel op een nutator te plaatsen; Laat het op een buizenrek op kamertemperatuur op de laboratoriumbank staan. Het wordt aanbevolen om een vers oplosmiddelmengsel te gebruiken. Meng voor een 500 μL voorraadoplossing 400 μL MeOH met 100 μL DMSO. - Vervang het dehydraterende reagens door 400 μL absolute (100%) methanol en dehydrateer de weefsels 's nachts bij -20 °C. Laat weefsels door de zwaartekracht bezinken en gebruik een pipet om de vloeistof te verwijderen.
OPMERKING: Monsters zijn levensvatbaar voor een langere periode van uitdroging, tot 4 nachten zijn getest zonder signaalverlies.
4. Weefsel post-fixatie
- Rehydrateer weefsels in een vierstapsreeks van 400 μL MeOH/PBS-Tween gedurende 10 minuten op ijs. Begin met 75% MeOH/25% PBS-Tween gevolgd door 50% MeOH/50% PBS-Tween, dan 25% MeOH/75% PBS-Tween en tenslotte 100% PBS-Tween.
NOTITIE: Een gellaadtip met een kleine opening kan worden gebruikt om de buffer uit de buis te verwijderen om te voorkomen dat de weefsels verloren gaan. Het verwijderen van buffers kan worden gedaan onder een ontleedmicroscoop. - Wassen met 400 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (PBS-T) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen door het monster op een nutator te plaatsen.
- Maak een proteïnase-K-oplossing van 20 μg/ml en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in 400 μl proteïnase-K-oplossing.
OPMERKING: Verdun 20 mg/ml proteïnase-K-voorraad (1000x stockoplossing), d.w.z. 2 μL in 2 ml 0,1% PBS-Tween. Het restant kan worden bewaard in een vriezer van -20 ° C. - Stop de enzymatische vertering van weefsel door 2x gedurende 10 minuten te wassen met 400 μL 0,1% PBS-tween.
- Voeg 400 μL van het postfixeermiddel toe en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Wasbeurt 3x, 15 min per wasbeurt, met 400 μL 0,1% PBS-Tween.
5. Sonde hybridisatie
- Incubeer weefsel in 400 μL sondehybridisatiebuffer gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de buffer door voorzichtig te pipetteren.
- Bereid u voor op de volgende stap door een aliquot van sondehybridisatiebuffer gedurende 30 minuten te verwarmen tot 37 ° C.
- Verwijder de buffer en pre-hybridiseer met 400 μL voorverwarmde sondehybridisatiebuffer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Maak sondeoplossing voor de beoogde chemosensorische receptoren (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a of Orco) door 8 pM sonde toe te voegen. Voeg 8 μL van 1 μM sondevoorraad toe aan 500 μL voorverwarmde sondehybridisatiebuffer.
- Verwijder de voorverwarmde sondehybridisatiebuffer en vervang deze door 400 μL verwarmde sondeoplossing.
- Incubeer weefsel bij 37 ° C gedurende twee nachten op een nutator die in een couveuse is geplaatst en onder een doos is afgedekt.
6. Sonde-versterking
- Verwarm de sondewasbuffer tot 37 ° C. Verwijder overtollige sondeoplossing door het weefsel 5x, 10 min per wasbeurt te spoelen, met 400 μL sondewasbuffer bij 37 ° C, nuterend in de incubator.
OPMERKING: De voorbereiding voor stap 6.4 kan beginnen. Zie de opmerking in stap 6.4. - Was monsters 2x, 5 min per wasbeurt, met 400 μL 5x zoutoplossing-natriumcitraat met 10% Tween-20 (SSCT) bij kamertemperatuur. Ontdooi de versterkingsbuffer tot kamertemperatuur op een werkblad.
- Bereid het weefsel voor op amplificatie door gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 400 μL amplificatiebuffer. Vanwege de viscositeit van de amplificatiebuffer is het mogelijk dat weefsels niet volledig worden ondergedompeld. Meng door de amplificatiebuffer voorzichtig onder het weefsel te pipetteren en de buffer bovenop het weefsel te verdrijven totdat ze ondergedompeld zijn.
- Bereid afzonderlijk 18 pM haarspeld h1 en 18 pM haarspeld h2 door 6 μL van 3 μM bouillon gedurende 90 s op 95 °C te verwarmen en gedurende 30 minuten in een donkere lade af te koelen tot kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de PCR-buizen goed zijn afgedekt om verdamping van de haarspelden te voorkomen tijdens het verwarmen in een thermische cycler.
NOTITIE: Om tijd te besparen, kan stap 6.4 worden gestart tijdens de 4ewasstap in stap 6.1. Haarspelden moeten afzonderlijk worden verwarmd om kruisreacties te voorkomen. Haarspelden mogen in deze stap niet worden verdund met een buffer. De haarspelden kunnen samen met de sondes worden gekocht bij de fabrikant van de sonde. - Vervang de in stap 6.3 toegevoegde versterkingsbuffer door een mengsel met de verwarmde haarspeldbochten (uit stap 6.4) samen met 100 μL versterkingsbuffer. Een typische reactie bevat 6 μL h1, 6 μL h2 en 100 μL amplificatiebuffer.
OPMERKING: Haarspelden h1 en h2 kunnen na afkoeling tot kamertemperatuur worden gecombineerd en vervolgens worden toegevoegd aan 100 μL versterkingsbuffer. Om te voorkomen dat de weefselmonsters van de ene buis naar de andere worden overgebracht, kan de amplificatiebuffer in stap 6.3 worden verwijderd en vervangen door het haarspeldmengsel verdund in amplificatiebuffer. - Incubeer het weefsel 's nachts en nutate in het donker bij kamertemperatuur met de standaardsnelheid van de nutator.
7. Montageweefselmonster
- Verdun de amplificatiebuffer in het geïncubeerde weefsel met 300 μL 5x SSCT (natriumchloride-natriumcitraat verdund in Tween-20).
OPMERKING: De verdunning is nuttig om de viscositeit te verminderen en maakt het gemakkelijker om de amplificatiebuffer uit het weefsel te verwijderen. We gebruikten Triton-X 100 voor de prefixatieve stap en Tween-20 voor de postfixatieve stap vanwege de verschillen in hun werking als middelen om het celmembraan te permeabiliseren. - Was tissues 5x met 400 μL 5x SSCT op kamertemperatuur.
NOTITIE: Bewaar het weefsel indien nodig tijdelijk bij 4 °C totdat het klaar is om te worden gemonteerd. We hebben de 2 dagen voor de beeldvorming niet overschreden. - Maak 5 druppels montageoplossing op een glasplaatje. Knip de punt van een pipetpunt van 200 μl af om deze breder te maken en breng het weefsel over op een nieuw glasplaatje.
- Pak de weefselmonsters bij hun basis vast met een pincet en dompel ze voorzichtig onder en spoel ze af in een reeks druppeltjes van de montageoplossing. Pas op dat u de weefsels in deze stap niet breekt.
- Monteer met montagevloeistof, plaats dekglaasje en sluit af met nagellak. Beeld in situ weefselmonsters met behulp van een confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Robuuste detectie van chemosensorische genen in Anopheles-antenne
We onderzochten de gevoeligheid van de HCR FISH-methode (Figuur 1) om de expressie van chemosensorische receptoren in reukweefsel van muggen te detecteren. Geleid door de RNA-transcriptgegevens die eerder zijn gerapporteerd op de vrouwelijke Anopheles-muggenantenne, hebben we sondes gegenereerd om een verscheidenheid aan IR's te targeten. De gemiddelde transcriptiewaarden van vier onafhankelijke antennetranscriptoomonderzoeken toonden aan dat Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) en Ir7t (13 RPKM) minder overvloedig aanwezig waren in de antenne in vergelijking met co-receptoren Ir25a (197 RPKM) en Ir76b (193 RPKM)5,11,12,13,14. We hebben sondes gegenereerd om ons te richten op Ir41t.1, Ir75d en Ir7t. IR64a (31 RPKM) was ook het doelwit, aangezien het transcriptieniveau ongeveer 3x overvloediger is dan de laagste transcriptiewaarde onder de kandidaat-genen van belang. Hierbij moet worden opgemerkt dat RPKM-waarden uit transcriptomics-studies een bulkmeting van transcripten van de gehele antenne vertegenwoordigen. Als zodanig kan het zijn dat slechts een paar neuronen een IR-gentranscript in hoge mate tot expressie brengen, of het kan zijn dat een IR-gen in veel cellen laag tot expressie wordt gebracht. RPKM-waarden komen daarom niet noodzakelijkerwijs overeen met het abundantieniveau van een IR in een neuron. Bovendien kan de signaalversterking die door de HCR-methode wordt geboden, het ook moeilijk maken om deze methode te gebruiken om neuronale transcriptieniveaus nauwkeurig te meten op basis van fluorescerende signalen. In onze recente publicatie zijn deze concepten nader besproken5. Gegevens suggereren dat HCR WM-FISH zeer gevoelig is voor het detecteren van mRNA-transcripten uit antenneweefsels, zoals weergegeven in figuur 2.
Meervoudige co-labeling van verschillende RNA-doelen in chemosensorische aanhangsels
Om de co-lokalisatie van RNA-doelen te onderzoeken, genereerden we sondes die geconjugeerd zijn aan verschillende fluoroforen. Dubbele in situ hybridisatie gericht op transcripten van het Odorant-receptor co-receptorgen (Orco) en het meest tot expressie gebrachte ionotrope receptor co-receptorgen (Ir25a) onthulden colokalisatie van deze verschillende chemosensorische receptorfamilies in een subset van celpopulaties in de antenne (Figuur 3A) en maxillaire palp (Figuur 3B). We onderzochten ook de colokalisatie van transcripten van drie IR-coreceptorgenen (Ir8a, Ir25a en Ir76b). Colokalisatiepatronen suggereren dat Ir76b-positieve cellen Ir25a tot expressie brengen, terwijl Ir8a-positieve cellen gedeeltelijk co-lokaliseren met Ir76b en Ir25a (Figuur 4). De co-expressie-analyse van de IR-coreceptoren toont de robuustheid aan van het gebruik van HCR WM-FISH voor multiplexstudies.
Figuur 1: Schema van de in situ hybridisatie kettingreactie. Deze methode werkt in twee stappen: detectie en versterking. Een sonde die is ingesteld voor een in situ hybridisatiekettingreactie bestaat uit een gesplitste initiator en een nucleïnezuursequentie die specifiek is voor het RNA-doelwit. Meerdere paren sondesets kunnen worden ontworpen om verschillende regio's in het RNA-doelwit te hybridiseren; Dit definieert de detectiestap. De amplificatiestap vereist dat fluorofoor-gelabelde haarspelden (h1 en h2) specifiek binden aan de initiator die is geconjugeerd aan een sondeset. Bij binding wordt het RNA-signaal dat door de fluorofoor wordt gelabeld, versterkt door herhaalde binding van met fluorofoor gelabelde haarspelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: RNA-lokalisatie van IR chemosensorische genen. HCR WM-FISH van vrouwelijke Anopheles coluzzii-antennes om IR's aan te vallen. RNA-sondes omvatten (A) IR41t.1, (B) IR75d, (C) IR7t en (D) IR64a. De inzetstukken in witte gestippelde vakjes zijn uitvergrote afbeeldingen van het weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dubbele in situ co-lokalisatie van chemosensorische genen in de antenne en maxillaire palp. Confocale Z-stack beelden van cellen die Ir25a (groen) en Orco (magenta) tot expressie brengen in de (A) antenne en (B) maxillaire palp van vrouwelijke Anopheles coluzzii muggen. De inzetstukken in witte gestippelde vakjes zijn uitvergrote afbeeldingen van het weefsel. De schaal is 10 μm. Figuur 3B is aangepast van15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het in kaart brengen van de ruimtelijke colokalisatie van meerdere RNA-doelen. In situ beelden die colokalisatiepatronen tonen van drie IR-coreceptoren, IR25a (magenta), IR8a (groen) en IR76b (blauw) in de muggenantenne. Witte pijlen wijzen naar cellen die de drie IR-coreceptoren (IR25a, IR8a en IR76b) tot expressie brengen. De schaal is 20 μm. Dit cijfer is gewijzigd van5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Reagentia voor in situ hybridisatiekettingreactie. Reagentia die nodig zijn om hybridisatiekettingreactie uit te voeren op fluorescerende in situ hybridisatie van het hele montuur. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De derde generatie hybridisatiekettingreactie (HCR) is opmerkelijk vanwege zijn gevoeligheid en robuustheid om verschillende RNA-doelen te visualiseren8. HCR WM-FISH is met succes toegepast op de embryo's van Drosophila, kippen, muizen en zebravissen, evenals op de larven van nematoden en zebravissen 10,16,17. Muggenantennes en maxillaire palpen zijn doorgaans gevoelig voor hoge autofluorescentie en zwakke sondepenetratie, wat vooral een uitdaging is bij het uitvoeren van traditionele in-situ methoden voor hele montage. Deze nadelen zijn verminderd door de signaalversterkingsstap die in het HCR-protocol is geïntegreerd, waardoor de signaal-achtergrondverhouding wordt verbeterd en de detectie van olfactorische chemoreceptor-mRNA-transcripten mogelijk wordt (Figuur 2). Het ontwerp van het HCR-protocol zorgt ervoor dat de initiërende sondes worden vastgemaakt aan de amplificatiepolymeren, waardoor RNA-doelen met een laag signaal kunnen worden gevisualiseerd. In de multiplexopstelling werden verschillende orthogonale HCR-versterkers vastgemaakt aan spectraal unieke fluoroforen. Deze aanpak was van cruciaal belang om spectrale doorbloeding van een naburig beeldvormingskanaal te voorkomen.
Om de HCR-methode te optimaliseren voor gebruik met muggenaanhangsels, hebben we verschillende observaties gedaan. De HCR-versterkers zijn lichtgevoelig en dienen altijd in een doos in een vriezer van -20°C bewaard te worden. Onze ervaring is dat uitgebreide incubatie van weefsels in CCD-buffer, proteïnase K of korte fixatietijd in paraformaldehyde kan leiden tot het breken van antennes of palpen tijdens de wasstappen. Antennes en maxillaire palpen moeten ook altijd bij de basis worden vastgepakt om breuk te voorkomen. In het vroege stadium van de aanpassing van dit protocol verloren we consequent weefsels tijdens de reeks bufferuitwisselingen (stap 5 en 6). Om dergelijke verliezen tot een minimum te beperken, werd het aantal weefsels aan het begin van het experiment verdubbeld, werden wasstappen en bufferuitwisselingen onder de microscoop uitgevoerd en werden gellaadtips van niet breder dan 0,5 mm gebruikt om de buffers uit de weefsels te verwijderen.
De HCR WM-FISH is succesvol geweest in perifere olfactorische aanhangsels van Anopheles gambiae 5,15 en Aedes aegypti 4,18 muggenvectoren, en het protocol zou verder kunnen worden geoptimaliseerd en aangepast aan andere delen van insectenweefsel of andere dieren. Het oorspronkelijke protocol dat door de fabrikant is ontworpen, bevat geen incubatie in de CCD-buffer. Deze stap werd geïntegreerd in het protocol om de chitineuze cuticula te verteren en te permeabiliseren. We hebben de incubatietijd in de sondesets met twee nachten verlengd om meer tijd te geven voor sondepenetratie, een wijziging van het protocol van de fabrikant dat een incubatietijd van 16 uur aanbeveelt die goed werkt voor generieke monsters op een objectglaasje. Optimalisatie van dit protocol voor andere delen van insectenweefsel zou het nodig hebben om de incubatietijd in de CCD-buffer te variëren; Perifere weefseldelen met dikke nagelriemen zullen waarschijnlijk een langere incubatietijd nodig hebben. De concentratie proteïnase K moet ook experimenteel worden aangepast, terwijl dit protocol wordt aangepast aan verschillende weefsel- of ontwikkelingsstadia van dieren. Bij het werken met weefsels dikker dan 5 mm wordt sondepenetratie een uitdaging. In een dergelijke situatie zijn extra inspanningen nodig om weefselcryosectie uit te voeren of het in deze studie beschreven protocol verder te wijzigen.
HCR WM-FISH is beperkt tot het gelijktijdig visualiseren van slechts een paar gendoelen tegelijk in vergelijking met ruimtelijke transcriptomics, die mogelijk de gelijktijdige beeldvorming van duizenden genen mogelijk zou kunnenmaken. Commerciële synthese van RNA-sondes is duur; Het alternatief zou zijn om de sondes en versterkers in het laboratorium te produceren, maar dit kan voor de meeste groepen een uitdaging zijn en is arbeidsintensief en tijdrovend. Dit protocol wordt ook beperkt door moeilijkheden die worden ondervonden bij de penetratie van de RNA-sonde door dikke monsters van de hele berg, waarvoor wijzigingen in het protocol nodig kunnen zijn (bijv. stap 2 weefselvoorbereiding) of doorsnede van het intacte weefsel. Als de hier beschreven HCR WM-FISH-methode er niet in slaagt een RNA-transcript in een olfactorisch aanhangsel te detecteren, kan het gen in slechts enkele cellen tot expressie worden gebracht en uitgebreid onderzoek van het weefsel vereisen, wordt het mogelijk niet getranscribeerd of kan het worden getranscribeerd op een niveau onder de detectielimiet van deze methode. Kwantitatieve RT-PCR of RNA seq kan worden uitgevoerd om dergelijke bevindingen te valideren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Margo Herre en het Leslie Vosshall-lab voor het delen van hun in-situ hybridisatieprotocol voor Aedes aegypti olfactorische aanhangsels. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health aan C.J.P. (NIAID R01Al137078), een HHMI Hanna Gray fellowship aan J.I.R, een Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award aan J.I.R, en een Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship aan J.I.R. We danken het Johns Hopkins Malaria Research Institute en Bloomberg Philanthropies voor hun steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al.
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al.
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
