Summary
L’article décrit les méthodes et les réactifs nécessaires pour effectuer l’hybridation de l’hybridation de l’ARN en fluorescence sur montage entier (HCR ARN, WM-FISH) afin de révéler des informations sur la résolution spatiale et cellulaire des gènes des récepteurs chimiosensoriels dans l’antenne du moustique et le palpe maxillaire.
Abstract
Les moustiques sont des vecteurs efficaces de maladies mortelles et peuvent naviguer dans leur environnement chimique à l’aide de récepteurs chimiosensoriels exprimés dans leurs appendices olfactifs. Comprendre comment les récepteurs chimiosensoriels sont organisés spatialement dans les appendices olfactifs périphériques peut offrir des informations sur la façon dont l’odeur est codée dans le système olfactif des moustiques et éclairer de nouvelles façons de lutter contre la propagation des maladies transmises par les moustiques. L’émergence de l’hybridation in situ de troisième génération (HCR ARN WM-FISH) permet une cartographie spatiale et un profilage simultané de l’expression de plusieurs gènes chimiosensoriels. Ici, nous décrivons une approche par étapes pour effectuer l’ARN HCR WM-FISH sur l’antenne du moustique anophèle et le palpe maxillaire. Nous avons étudié la sensibilité de cette technique en examinant le profil d’expression des récepteurs olfactifs ionotropiques. Nous avons demandé si la technique HCR WM-FISH décrite était adaptée aux études multiplexées en attachant des sondes d’ARN à trois fluorophores spectralement distincts. Les résultats ont fourni la preuve que l’ARN HCR WM-FISH est robuste pour détecter simultanément plusieurs gènes chimiosensoriels dans l’antenne et les appendices olfactifs des palpes maxillaires. D’autres études attestent de l’adéquation de HCR WM-FISH pour le profilage de co-expression de cibles à ARN double et triple. Cette technique, lorsqu’elle est appliquée avec des modifications, pourrait être adaptable pour localiser des gènes d’intérêt dans les tissus olfactifs d’autres espèces d’insectes ou dans d’autres appendices.
Introduction
Les moustiques vecteurs tels que Anopheles gambiae s’appuient sur un riche répertoire de gènes chimiosensoriels exprimés dans leurs appendices olfactifs périphériques pour prospérer dans un monde chimique complexe et identifier les odeurs comportementales pertinentes émanant d’hôtes humains, détecter les sources de nectar et localiser les sites de ponte1. L’antenne du moustique et le palpe maxillaire sont enrichis de gènes chimiosensoriels qui pilotent la détection des odeurs dans ces appendices olfactifs. Trois classes principales de canaux ioniques ligand-dépendants pilotent la détection des odeurs dans les appendices olfactifs des moustiques : les récepteurs odorants (OR), qui fonctionnent avec un corécepteur obligatoire des récepteurs odorants (Orco) ; les récepteurs ionotropiques (IR), qui interagissent avec un ou plusieurs corécepteurs IR (IR8a, IR25a et IR76b) ; les récepteurs gustatifs chimiosensoriels (GRs), qui fonctionnent comme un complexe de trois protéines pour détecter le dioxyde de carbone (CO2)1,2.
L’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN est un outil puissant pour détecter l’expression de l’ARNm3 endogène. En général, cette méthode utilise une sonde d’acide nucléique simple brin marquée au fluorophore avec une séquence complémentaire à un ARNm cible. La liaison de la sonde d’ARN fluorescent à l’ARN cible permet d’identifier les cellules exprimant un transcrit d’intérêt. Des progrès récents permettent maintenant la détection de transcrits dans des tissus de moustiques entiers 4,5. La première génération de la technologie de réaction en chaîne par hybridation (HCR) utilisait un amplificateur HCR à base d’ARN ; cela a été amélioré dans une méthode de deuxième génération qui a plutôt utilisé de l’ADN artificiel pour l’amplificateur HCR 6,7. Cette mise à niveau s’est traduite par une multiplication par 10 du signal, une diminution spectaculaire des coûts de production et une amélioration significative de la durabilité des réactifs 6,7.
Dans le protocole, nous décrivons l’utilisation d’une méthode d’hybridation in situ par fluorescence d’ARN à montage entier HCR de troisième génération (HCR ARN WM-FISH) conçue pour détecter la localisation spatiale et l’expression de tout gène 8,9. Cette méthode en deux étapes utilise d’abord des sondes d’acides nucléiques spécifiques à l’ARNm d’intérêt, mais qui contiennent également une séquence de reconnaissance de l’initiateur ; la deuxième étape utilise des épingles à cheveux marquées au fluorophore qui se lient à la séquence d’initiateur pour amplifier le signal fluorescent (Figure 1). Cette méthode permet également le multiplexage de deux ou plusieurs sondes d’ARN et l’amplification des signaux de sonde pour faciliter la détection et la quantification de l’ARN8. La visualisation de l’abondance des transcrits et des modèles de localisation de l’ARN des gènes chimiosensoriels exprimés dans les appendices olfactifs offre la première ligne de compréhension des fonctions des gènes chimiosensoriels et du codage des odeurs.
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Protocol
1. Considérations et préparation du matériel
- Décidez si le montage complet ou la cryo-section du tissu sera approprié. Ce protocole est optimisé pour l’imagerie in situ de l’ARN dans l’antenne du moustique anophèle et le palpe maxillaire sans cryo-section. Si les échantillons ont une épaisseur supérieure à 5 mm, il est recommandé de procéder à une cryo-section pour permettre la pénétration de la sonde.
- Identifiez les gènes d’intérêt et copiez les séquences, y compris les introns et les exons, à partir d’une base de données appropriée. Transcrire la séquence du gène en ARN pour la synthèse.
- Déterminez s’il faut acheter des sondes auprès de fournisseurs commerciaux ou si les sondes seront synthétisées en laboratoire.
NOTA : Dans le cadre de la présente étude, les sondes in situ ont été achetées auprès d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux). Alternativement, il peut être synthétisé comme indiqué précédemment10. Les réactifs utilisés dans l’étude sont décrits dans le tableau 1. Les matériaux nécessaires à la préparation des réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
2. Pré-fixation tissulaire
- Anesthésier 10 à 15 moustiques adultes femelles ou mâles Anopheles coluzzii (souche N’Gousso), âgés de 5 à 10 jours après la levée, en les recueillant à l’aide d’un aspirateur buccal dans un gobelet en papier ou un tube en plastique et en les plaçant dans un seau contenant de la glace. Une anesthésie induite par le froid réussie peut être confirmée lorsque les moustiques sont immobiles.
- Décapitaz-les en enlevant les têtes de la région du cou avec une paire de pinces. À l’aide de la main non dominante, saisissez le thorax avec une pince et séparez le cou du corps avec une pince tenue par la main dominante. Placer les têtes dans un tube de 1,5 mL contenant 500 μL de tampon chitinase-chymotrypsine diméthylsulfoxyde (tampon CCD) sur de la glace.
REMARQUE : La congélation des animaux peut déformer les antennes ; Un knockdown rapide sur la glace est recommandé. L’âge du moustique pendant les tests peut varier en fonction du projet. Il est important de confirmer et de coordonner leur état physiologique, par exemple s’ils sont nourris au sang, affamés ou accouplés. Dans cette étude, des appendices olfactifs ont été prélevés sur des moustiques nourris au sang et accouplés. - Préchauffer les têtes de moustiques dans un tampon CCD à 37 ° C sur un bloc chauffant pendant 5 min, puis transférer le tube contenant les têtes de moustiques dans un four d’hybridation et tourner à 37 ° C. Le temps d’incubation dans le tampon CCD dépend du type de tissu. Pour les antennes d’anophèles femelles, utilisez 20 min, les antennes mâles nécessitent 15 min, tandis qu’un temps d’incubation plus long (1 h) est nécessaire pour les palpes maxillaires.
- Transférez tout le contenu du tube dans un verre de montre à dissection. Versez doucement l’échantillon dans la dépression d’un verre de montre (dissection). Si des têtes de moustiques sont coincées à l’intérieur du tube, utilisez une pipette pour ajouter un tampon CCD dans le tube et rincez la tête.
- À l’aide d’une pince, transférez soigneusement les têtes ou les antennes/palpes détachés pendant l’incubation et fixez-les dans 1 mL du préfixateur.
REMARQUE : Le tampon CCD restant peut être conservé à -20 ° C. Le tampon peut être réutilisé jusqu’à 3 fois. Si le préfixateur devient légèrement brunâtre en raison du transfert du tampon CCD par les tissus, remplacez-le par 1 mL de fixateur supplémentaire. - Faire tourner les têtes dans le préfixateur pendant 24 h à 4° C à l’aide d’un nutateur.
REMARQUE : La vitesse de bascule du nutateur utilisé dans cette étude n’était pas réglable ; La vitesse par défaut réglée (12 tr/min) par le fabricant a été utilisée.
3. Dissection tissulaire
- Rincer les têtes 4 fois (5 min par lavage) avec 1 mL de PBS-Tween à 0,1 % sur glace. Pour éviter la perte d’échantillon, utilisez une pipette fixée à l’embout de chargement du gel pour retirer le liquide.
REMARQUE : Deux lavages rapides suivis d’un lavage long de 10 minutes et d’un lavage rapide final peuvent être effectués à la place de l’étape 3.1. - Transférez les têtes dans le tube dans un verre de montre à disséquer. Versez doucement l’échantillon dans la dépression d’un verre de montre. Rincez les têtes de moustiques coincées à l’intérieur du tube avec 0,1 % de PBS-Tween.
- À l’aide d’un microscope à dissection, retirez les tissus d’intérêt (antennes/palpes) de la tête à l’aide d’une pince tranchante. Tenez la partie postérieure de la tête avec une pince et saisissez une antenne avec une autre pince à la base. Nettoyez la pince avec du papier imbibé de solvant sans ARNase. Retirez les palpes en utilisant le même processus.
- Transférez les antennes et les palpes à l’aide d’une pince dans des tubes vides exempts d’ADN/RNase placés sur de la glace. Séparez les différentes parties du tissu dans différents tubes pré-étiquetés.
- Déshydrater le tissu dans 400 μL de solvant contenant un mélange de méthanol (MeOH 80%) et de diméthylsulfoxyde (DMSO 20%) pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de placer du tissu sur un nutateur ; Laissez-le reposer sur un support de tubes à température ambiante sur la paillasse du laboratoire. Il est recommandé d’utiliser un mélange de solvants frais. Pour une solution mère de 500 μL, mélanger 400 μL de MeOH avec 100 μL de DMSO. - Remplacer le réactif déshydratant par 400 μL de méthanol absolu (100 %) et déshydrater les tissus pendant une nuit à -20 °C. Laissez les tissus se déposer par gravité et utilisez une pipette pour retirer le liquide.
REMARQUE : Les échantillons sont viables pour une période prolongée de déshydratation, jusqu’à 4 nuits ont été testées sans perte de signal.
4. Post-fixation tissulaire
- Réhydrater les tissus en quatre étapes de 400 μL MeOH/PBS-Tween pendant 10 minutes sur de la glace. Commencez par 75 % de MeOH/25 % PBS-Tween, suivis de 50 % de MeOH/50 % PBS-Tween, puis de 25 % de MeOH/75 % PBS-Tween et enfin de 100 % de PBS-Tween.
REMARQUE : Un embout de chargement de gel avec une petite ouverture peut être utilisé pour retirer le tampon du tube afin d’éviter de perdre les tissus. L’élimination du tampon peut être effectuée sous un microscope à dissection. - Laver avec 400 μL de solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,1 % Tween-20 (PBS-T) pendant 10 minutes à température ambiante. Laver en plaçant l’échantillon sur un nutateur.
- Préparer une solution de 20 μg/mL de protéinase K et incuber dans 400 μL de solution de protéinase K pendant 30 min à température ambiante.
NOTA : Diluer 20 mg/mL de protéinase K (solution mère 1000x), c’est-à-dire 2 μL dans 2 mL de PBS-Tween à 0,1 %. Le reste peut être conservé dans un congélateur à -20°C. - Arrêtez la digestion enzymatique des tissus en les lavant 2 fois pendant 10 min avec 400 μL de PBS-tween à 0,1 %.
- Ajouter 400 μL de post-fixateur et incuber pendant 20 min à température ambiante. Laver 3 fois, 15 min par lavage, avec 400 μL de PBS-Tween à 0,1 %.
5. Hybridation de la sonde
- Incuber le tissu dans 400 μL de tampon d’hybridation de sonde pendant 5 min. Assurez-vous que le tissu est complètement immergé dans le tampon en pipetant doucement.
- Préparez-vous à l’étape suivante en chauffant une aliquote de tampon d’hybridation de sonde à 37°C pendant 30 min.
- Retirer le tampon et pré-hybrider avec 400 μL de tampon d’hybridation de sonde préchauffé pendant 30 min à 37°C.
- Faire une solution de sonde pour les récepteurs chimiosensoriels cibles (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a ou Orco) en ajoutant 8 pM de sonde. Ajouter 8 μL de sonde de 1 μM à un tampon d’hybridation de sonde préchauffée de 500 μL.
- Retirez le tampon d’hybridation de sonde préchauffé et remplacez-le par 400 μL de solution de sonde chauffée.
- Incuber les tissus à 37°C pendant deux nuits sur un nutator placé à l’intérieur d’un incubateur et recouvert sous une boîte.
6. Amplification de la sonde
- Chauffer le tampon de lavage de la sonde à 37 ° C. Éliminer l’excès de solution de la sonde en rinçant le tissu 5x, 10 min par lavage, avec 400 μL de tampon de lavage de la sonde à 37 ° C, nutation dans l’incubateur.
REMARQUE : La préparation de l’étape 6.4 peut commencer. Reportez-vous à la remarque de l’étape 6.4. - Laver les échantillons 2 fois, 5 minutes par lavage, avec 400 μL de citrate de sodium salin 5x contenant 10 % de Tween-20 (SSCT) à température ambiante. Décongeler le tampon d’amplification à température ambiante sur une paillasse.
- Préparer les tissus pour l’amplification en les incubant avec 400 μL de tampon d’amplification pendant 10 min à température ambiante. En raison de la viscosité du tampon d’amplification, les tissus peuvent ne pas être complètement submergés. Mélangez en pipetant doucement le tampon d’amplification sous le tissu et en expulsant le tampon sur le dessus du tissu jusqu’à ce qu’il soit submergé.
- Préparer séparément 18 pM d’épingle à cheveux h1 et 18 pM d’épingle h2 en chauffant 6 μL de papier 3 μM à 95 °C pendant 90 s et en refroidissant à température ambiante dans un tiroir sombre pendant 30 min. Assurez-vous que les tubes PCR sont bien bouchés pour éviter l’évaporation des épingles à cheveux pendant le chauffage dans un thermocycleur.
REMARQUE : Pour gagner du temps, l’étape 6.4 peut être lancée lors de la4e étape de lavage de l’étape 6.1. Les épingles à cheveux doivent être chauffées séparément pour éviter toute réaction croisée. Les épingles à cheveux ne doivent pas être diluées avec un tampon à cette étape. Les épingles à cheveux peuvent être achetées auprès du fabricant de la sonde avec les sondes. - Remplacez le tampon d’amplification ajouté à l’étape 6.3 par un mélange contenant les épingles à cheveux chauffées (à partir de l’étape 6.4) ainsi que 100 μL de tampon d’amplification. Une réaction typique contiendra 6 μL de h1, 6 μL de h2 et 100 μL de tampon d’amplification.
REMARQUE : Les épingles à cheveux h1 et h2 peuvent être combinées après refroidissement à température ambiante, puis ajoutées à 100 μL de tampon d’amplification. Pour éviter de transférer les échantillons de tissus d’un tube à l’autre, le tampon d’amplification de l’étape 6.3 peut être retiré et remplacé par le mélange d’épingles à cheveux dilué dans le tampon d’amplification. - Incubez les tissus pendant la nuit et nutez dans l’obscurité à température ambiante en utilisant la vitesse par défaut du nutateur.
7. Échantillon de tissu de montage
- Diluer le tampon d’amplification dans le tissu incubé avec 300 μL de SSCT 5x (chlorure de sodium-citrate de sodium dilué dans Tween-20).
REMARQUE : La dilution est utile pour réduire la viscosité et facilite l’élimination du tampon d’amplification du tissu. Nous avons utilisé Triton-X 100 pour le pré-fixateur et Tween-20 pour l’étape post-fixatrice en raison des différences dans leurs actions en tant qu’agents pour perméabiliser la membrane cellulaire. - Laver le papier hygiénique 5 fois avec 400 μL de SSCT 5x à température ambiante.
REMARQUE : Conservez temporairement les mouchoirs en papier à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être montés, si nécessaire. Nous n’avons pas dépassé 2 jours avant l’imagerie. - Faites 5 gouttelettes de solution de montage sur une lame de verre. Coupez l’embout d’une pipette de 200 μL pour l’élargir et transférez le tissu sur une nouvelle lame de verre.
- Saisissez les échantillons de tissus par leur base à l’aide d’une pince et plongez-les doucement et rincez-les dans une série de gouttelettes de solution de montage. Veillez à ne pas casser les tissus lors de cette étape.
- Montez avec une solution de montage, placez la lamelle et scellez avec du vernis à ongles. Imager des échantillons de tissus in situ à l’aide d’un microscope confocal.
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Representative Results
Détection robuste des gènes chimiosensoriels dans l’antenne de l’anophèle
Nous avons étudié la sensibilité de la méthode HCR FISH (Figure 1) pour détecter l’expression des récepteurs chimiosensoriels dans les tissus olfactifs des moustiques. Guidés par les données de transcription de l’ARN rapportées précédemment sur l’antenne femelle du moustique anophèle, nous avons généré des sondes pour cibler une variété d’IR. Les valeurs moyennes de transcrit de quatre études indépendantes sur le transcriptome antennaire ont révélé que Ir41t.1 (11 tr/km), Ir75d (12 tr/km) et Ir7t (13 tr/km) étaient moins abondants dans l’antenne que les corécepteurs Ir25a (197 tr/km) et Ir76b (193 tr/km)5,11,12,13,14. Nous avons généré des sondes pour cibler Ir41t.1, Ir75d et Ir7t. IR64a (31 RPKM) a également été ciblé étant donné que son niveau de transcription est environ 3 fois plus abondant que la valeur de transcription la plus faible parmi les gènes candidats d’intérêt. Il convient de noter ici que les valeurs RPKM des études transcriptomiques représentent une mesure en vrac des transcrits de l’ensemble de l’antenne. En tant que tel, il se peut que seuls quelques neurones expriment fortement une transcription du gène IR, ou qu’un gène IR soit faiblement exprimé dans de nombreuses cellules. Les valeurs de RPKM ne correspondent donc pas nécessairement au niveau d’abondance d’un IR au sein d’un neurone. De plus, l’amplification du signal permise par la méthode HCR pourrait également rendre difficile l’utilisation de cette méthode pour évaluer avec précision les niveaux de transcription neuronale en fonction des signaux fluorescents. Notre récente publication a abordé ces concepts plus en détail5. Les données suggèrent que HCR WM-FISH est très sensible à la détection des transcrits d’ARNm des tissus antennaires, comme le montre la figure 2.
Co-marquage multiplexé de différentes cibles d’ARN dans des appendices chimiosensoriels
Pour examiner la co-localisation de cibles d’ARN, nous avons généré des sondes conjuguées à différents fluorophores. Une double hybridation in situ ciblant les transcrits du gène du corécepteur du récepteur odorant (Orco) et du gène du corécepteur du récepteur ionotropique le plus largement exprimé (Ir25a) a révélé la colocalisation de ces familles distinctes de récepteurs chimiosensoriels dans un sous-ensemble de populations cellulaires de l’antenne (Figure 3A) et du palpe maxillaire (Figure 3B). Nous avons également étudié la colocalisation des transcrits de trois gènes de corécepteurs IR (Ir8a, Ir25a et Ir76b). Les profils de colocalisation suggèrent que les cellules positives pour Ir76b expriment Ir25a, tandis que les cellules positives pour Ir8a colocalisent partiellement avec Ir76b et Ir25a (Figure 4). L’analyse de co-expression des corécepteurs IR démontre la robustesse de l’utilisation de HCR WM-FISH pour les études multiplexées.
Figure 1 : Schéma de la réaction en chaîne d’hybridation in situ. Cette méthode fonctionne en deux étapes : la détection et l’amplification. Un ensemble de sondes pour la réaction en chaîne d’hybridation in situ comprend un initiateur divisé et une séquence d’acide nucléique spécifique à la cible d’ARN. Plusieurs paires de sondes peuvent être conçues pour hybrider plusieurs régions de la cible de l’ARN ; Cela définit l’étape de détection. L’étape d’amplification nécessite que des épingles à cheveux marquées au fluorophore (h1 et h2) se lient spécifiquement à l’initiateur conjugué à un ensemble de sondes. Lors de la liaison, le signal ARN marqué par le fluorophore est amplifié par la liaison répétée d’épingles à cheveux marquées au fluorophore. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Localisation de l’ARN des gènes chimiosensoriels IR. HCR WM-FISH des antennes femelles d’Anopheles coluzzii pour cibler les IR. Les sondes d’ARN comprennent (A) IR41t.1, (B) IR75d, (C) IR7t et (D) IR64a. Les encarts dans des cases blanches en pointillés sont des images agrandies du tissu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Double co-localisation in situ des gènes chimiosensoriels dans l’antenne et le palpe maxillaire. Images confocales en Z de cellules exprimant Ir25a (vert) et Orco (magenta) dans l’antenne (A) et (B) le palpe maxillaire des moustiques femelles Anopheles coluzzii. Les encarts dans des cases blanches en pointillés sont des images agrandies du tissu. L’échelle est de 10 μm. La figure 3B a été modifiée à partir de15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Cartographie de la colocalisation spatiale de plusieurs cibles d’ARN. Images in situ montrant les patrons de colocalisation de trois corécepteurs IR, IR25a (magenta), IR8a (vert) et IR76b (bleu) dans l’antenne moustique. Les flèches blanches pointent vers les cellules qui expriment les trois corécepteurs IR (IR25a, IR8a et IR76b). L’échelle est de 20 μm. Ce chiffre a été modifié de5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Réactifs pour la réaction en chaîne d’hybridation in situ . Réactifs nécessaires à l’hybridation par réaction en chaîne à montage entier fluorescent in situ . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
La troisième génération de réaction en chaîne d’hybridation (HCR) est remarquable par sa sensibilité et sa robustesse pour visualiser plusieurs cibles d’ARN8. HCR WM-FISH a été utilisé avec succès sur les embryons de drosophile, de poulet, de souris et de poisson-zèbre ainsi que sur les larves de nématodes et de poissons-zèbres 10,16,17. Les antennes de moustiques et les palpes maxillaires sont généralement sujets à une autofluorescence élevée et à une faible pénétration de la sonde, ce qui est particulièrement difficile lors de la réalisation de méthodes traditionnelles in situ à montage complet. Ces inconvénients ont été atténués par l’étape d’amplification du signal intégrée au protocole HCR qui améliore le rapport signal/bruit de fond et permet la détection des transcrits d’ARNm des chimiorécepteurs olfactifs (Figure 2). La conception du protocole HCR garantit que les sondes initiatrices sont attachées aux polymères d’amplification, ce qui permet d’imager des cibles d’ARN avec un faible signal. Dans la configuration multiplexée, différents amplificateurs HCR orthogonaux ont été attachés à des fluorophores spectralement uniques. Cette approche était essentielle pour éviter le débordement spectral d’un canal d’imagerie voisin.
Afin d’optimiser la méthode HCR pour une utilisation avec les appendices des moustiques, nous avons fait plusieurs observations. Les amplificateurs HCR sont sensibles à la lumière et doivent toujours être stockés dans une boîte dans un congélateur à -20 ° C. D’après notre expérience, une incubation prolongée des tissus dans le tampon CCD, la protéinase K ou un court temps de fixation dans le paraformaldéhyde peuvent entraîner la rupture des antennes ou des palpes pendant les étapes de lavage. Les antennes et les palpes maxillaires doivent également toujours être saisis par la base pour éviter qu’ils ne se cassent. Au début de l’adaptation de ce protocole, nous avons systématiquement perdu des tissus lors de la série d’échanges de tampons (étapes 5 et 6). Pour minimiser ces pertes, le nombre de tissus a été doublé au début de l’expérience, des étapes de lavage et des échanges de tampons ont été effectués au microscope, et des pointes de chargement de gel d’une largeur maximale de 0,5 mm ont été utilisées pour éliminer les tampons des tissus.
Le HCR WM-FISH a été couronné de succès dans les appendices olfactifs périphériques d’Anopheles gambiae 5,15 et d’Aedes aegypti 4,18 moustiques vecteurs, et le protocole pourrait être optimisé et adapté à d’autres parties de tissus d’insectes ou à différents animaux. Le protocole original conçu par le fabricant n’intègre pas d’incubation dans le tampon CCD. Cette étape a été intégrée dans le protocole pour digérer et perméabiliser la cuticule chitineuse. Nous avons prolongé le temps d’incubation dans les ensembles de sondes de deux nuits pour donner plus de temps à la pénétration de la sonde, une modification du protocole du fabricant qui recommande un temps d’incubation de 16 h qui fonctionne bien pour les échantillons génériques sur une lame. L’optimisation de ce protocole pour d’autres parties de tissus d’insectes nécessiterait de faire varier le temps d’incubation dans le tampon CCD ; Les parties périphériques des tissus avec des cuticules épaisses nécessiteront probablement un temps d’incubation prolongé. La concentration de protéinase K doit également être ajustée expérimentalement tout en adaptant ce protocole aux différents tissus ou stades de développement des animaux. Lorsque vous travaillez avec des tissus de plus de 5 mm d’épaisseur, la pénétration de la sonde devient un défi. Dans une telle situation, des efforts supplémentaires sont nécessaires pour effectuer une cryosection tissulaire ou modifier davantage le protocole décrit dans cette étude.
HCR WM-FISH est limité à la visualisation simultanée de quelques cibles génétiques à la fois, par rapport à la transcriptomique spatiale, qui pourrait potentiellement permettre l’imagerie simultanée de milliers de gènes19. La synthèse commerciale de sondes d’ARN est coûteuse ; L’alternative serait de produire les sondes et les amplificateurs en laboratoire, mais cela peut être difficile pour la plupart des groupes et demande beaucoup de travail et de temps. Ce protocole est également limité par les difficultés rencontrées par la pénétration de la sonde d’ARN à travers des échantillons épais à montage entier, ce qui pourrait nécessiter des modifications du protocole (par exemple, la préparation des tissus à l’étape 2) ou la coupe du tissu intact. Si la méthode HCR WM-FISH décrite ici ne parvient pas à détecter un transcrit d’ARN dans un appendice olfactif, le gène peut n’être exprimé que dans quelques cellules et nécessiter une étude approfondie du tissu, n’est peut-être pas transcrit ou peut être transcrit à un niveau inférieur à la limite de détection de cette méthode. Une RT-PCR quantitative ou un séquençage de l’ARN pourraient être effectués pour valider ces résultats.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Margo Herre et le laboratoire de Leslie Vosshall d’avoir partagé leur protocole d’hybridation in-situ pour les appendices olfactifs d’Aedes aegypti . Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health à C.J.P. (NIAID R01Al137078), une bourse HHMI Hanna Gray à J.I.R, une bourse Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator à J.I.R, et une bourse postdoctorale de l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins à J.I.R. Nous remercions l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins et Bloomberg Philanthropies pour leur soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
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